Abstract
Bakgrunn
low-density lipoprotein reseptor-relatert protein-1 (LRP-1) er en endocytic reseptor formidling clearance av ulike ekstracellulære molekyler involvert i formidling av kreft celler. LRP-en dukket dermed som en attraktiv reseptor for målretting invasiv oppførsel av ondartede celler. Men nyere resultater tyder på at LRP-1 kan lette utvikling og vekst av kreftmetastaser in vivo, men den nøyaktige bidraget av reseptoren under progresjon av kreft, gjenstår å bli belyst. Mangelen på mekanistiske innsikt i intracellulære signalnettverk nedstrøms av LRP-en har hindret forståelsen av sitt bidrag til kreft.
metodikk /hovedfunnene
Gjennom en kort hårnål RNA-mediert stanse tilnærming, identifiserte vi LRP-en som en hoved regulator av ERK og JNK signalering i en svulst celle sammenheng. Co-immunoutfellingsstudier eksperimenter viste at LRP-en utgjør en intracellulær docking nettstedet for MAPK inneholder komplekser. Ved å bruke farmakologiske midler, konstitutivt aktive og dominerende negative kinaser, viste vi at LRP-en opprettholder ondartede celler i et lim tilstand som er gunstig for invasjon ved å aktivere ERK og hemme JNK. Vi videre vist at LRP-en avhengig regulering av MAPK signal organiserer cytoskeletal arkitektur og formidler lim kompleks omsetning i kreftceller. Videre fant vi at LRP-en er bundet til aktin nettverk og fokale vedheft områder og styrer ERK og JNK målretting til Talin rike strukturer.
Konklusjoner
Vi identifiserte ERK og JNK som de viktigste molekylære reléer ved hvilken LRP-1 regulerer fokal adhesjon demontering av maligne celler for å understøtte invasjon
relasjon:. Langlois B, Perrot G, Schneider C, Henriet P, Emonard H, Martiny L, et al. (2010) LRP-en Fremmer Cancer Cell invasjon ved å støtte ERK og hemme JNK signalveier. PLoS ONE 5 (7): e11584. doi: 10,1371 /journal.pone.0011584
Redaktør: Bill Hooker, Calypte Biomedical Corporation, USA
mottatt: 02.04.2010; Godkjent: 20 juni 2010; Publisert: 14.07.2010
Copyright: © 2010 Langlois et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), La Ligue Nationale Contre le Cancer (Comite de la Marne), CPER (contrat de PROJETS Etat-regionen) 2007-2013 og Fonds National pour la Santé ACI (Handling Concertée Incitative) 2008 (Canceropole Grand-Est Project). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
low-density lipoprotein (LDL) reseptoren relatert protein-1 (LRP-1) er et allestedsnærværende uttrykt endocytiske reseptoren hører til LDL-reseptorfamilien [1]. Først beskrives som en last reseptor formidling opptak og lysosomal degradering av α2-makroglobulin [2], ble LRP-en da funnet å være involvert i internalisering av over 30 funksjonelt og strukturelt urelaterte ekstracellulære ligander. Disse inkluderer proteaser, protease-inhibitor komplekser, makromolekylære proteiner og vekstfaktorer. Til å begynne med fremstilt som et 600 kDa-forløper, er LRP-1 ytterligere behandlet i trans-Golgi av en furin-konvertase for ekspresjon på celleoverflaten i det ferdige to-kjedede formen består av et 515 kDa ekstracellulært subenhet (α-kjede), ikke-kovalent bundet til et 85 kDa β-kjede som inneholder transmembrandomenet og den cytoplasmiske hale. De LRP-1 α-kjeden havner fire ligand-bindende grupper som er involvert i spesifikk gjenkjennelse av ekstracellulære ligander og sammenstillingen av multiprotein komplekser på celleoverflaten. Den intracellulære domenet av LRP-1 β-kjeden kan rekruttere molekyler involvert i endocytic maskiner og cytoplasmatiske modulatorer av signalveier [3].
Mangfoldet av sine ligander kan forklare hvorfor LRP-en har blitt identifisert som en kritisk faktor i forskjellige patologiske kontekster inkludert aterosklerose og neurodegenerative lidelser som hyppigst beskrevet [4], [5]. Et økende antall bevis styrket den antatte rollen LRP-en i avgjørende hendelser i løpet av kreft progresjon [6]. LRP-1 ble faktisk rapportert å mediere clearance av forskjellige matriks-metalloproteinaser så som MMP-2, MMP-9 og MMP-13 [7], [8], [9], og for å regulere aktiveringen plasmin kaskade gjennom endocytose av vevs- type (tPA) eller urokinase-type (uPA) plasminogenaktivatorer [10], [11]. Tatt i betraktning den kjente funksjon ved regulering av matrisen proteolyse [12], ble LRP-1 opprinnelig foreslått som en ny tumor suppressor. Den svake uttrykk nivået av LRP-en ble observert i høy klasse humane kreftceller og vev syntes å støtte en slik hypotese [13], [14]. Men den totale funksjon av LRP-1 i kreftutvikling synes å være mye mer komplisert enn først antatt. Nyere studier har rapportert et positivt bidrag på LRP-en til migrasjon og invasjon hendelsene i ulike celletyper [10], [15], [16], inkludert ondartede kreftceller [17], [18], [19], [20 ]. LRP-1 uttrykk ble også rapportert å være hypoksi-responsive og å støtte metastatisk spredning av mus tumorxenotransplantater [21]. Videre LRP-1 ble vist å opprettholde den mitogene og /eller promigratory virkninger av flere løselige faktorer som er tilstede i peritumoral miljø, dermed støtter en pro-tumorigenesis rolle av reseptoren [15], [22], [23]. Vi har nylig vist at LRP-1 bidrar til carcinoma celle invasjon av subtilt kontrollere limet kompleks omsetning [17]. Det synes derfor som om de mekanismer som LRP-1 styrer tumorprogresjon er ikke utelukkende knyttet til dens endocytiske funksjon.
Utover endocytose, LRP-1 ble kjennetegnes ved sin evne til å utløse intracellulære signalveier regulere celleproliferasjon, differensiering , migrasjon eller overlevelse [15], [24], [25], [26]. Den korte intracytoplasmatisk domene (ICD) inneholder to NPxY motivene for fosforylering av tyrosin kinaser som er da i stand til å binde fosfotyrosin-bindende domene (PTB) holdig proteiner. Gjær to-hybrid analyser og proteomikk analyser viste at SHC (Src homologi 2 domene som inneholder protein), Fe65, DAB1 (deaktivert 1), PI3K (fosfatidyl-inositol 3-kinase) eller en PIP-4,5-kinase (fosfatidyl-inositol -4,5-kinase) homolog kan assosiere med LRP-1-ICD [27], [28]. Således, som respons på ekstracellulære stimuli, LRP-1 kan rekruttere intracellulære proteiner stilla å utløse nedstrøms signalering. LRP-1 er blitt identifisert som en molekylær signale partner for blodplate-avledet vekstfaktor reseptor (PDGFR), som fører til vandrende og proliferativ signalering og utvikling av aterosklerotiske lesjoner [4], [29]. Mer nylig promigratory effekten av plasminogenaktivator-inhibitor PAI-1 viste seg å kreve at LRP-1-avhengig aktivering av JAK (Janus kinase) /STAT (signal transduser og aktivator av transkripsjon) signalveien [30]. Videre, Ma og medarbeidere rapporterte at LRP-1 kan regulere muse-embryonale fibroblaster migrering ved å undertrykke den Rac1 og ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) trasé [31].
I kreft-feltet, er det en bemerkelsesverdig mangel kunnskap om intracellulær signale nedstrøms LRP-en og forståelse av sin mulige bidrag til kreft progresjon. I den foreliggende undersøkelse, karakterisert vi de molekylære signalerings releer som er involvert i LRP-1-mediert stimulering av kreftcelleinvasjon og identifisert LRP-1 β-kjeden som en hoveddokkside for fokal adhesjon (FA) komponenter og mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) -inneholdende komplekser.
Resultater
Identifisering av LRP-en som en regulator av MAPK signalveier i tumorceller sammenheng
for å vurdere hvilken rolle LRP- 1 ved regulering av intracellulær signaltransduksjon, anvendte vi en tidligere validert metode for å generere shLRP-1 klonale celler som stabilt overuttrykker en spesifikk hårnål sekvens rettet mot LRP-1 [17]. Som vist på fig. 1, observerte vi en ~90% nedregulering av endogen LRP-1-ekspresjon i shLRP-1-celler, sammenlignet med shCTRL celler, både på mRNA (fig. 1A) og proteinnivåer (Fig. 1B). Vi analyserte derfor effekten av LRP1 stanse på aktivering av flere potensielle LRP-1-regulerte signalveier. Aktiveringstilstander to store MAPK veier, dvs. ERK-1/2 og SAPK /JNK (spenning-aktivert protein kinase /c-Jun N-terminal kinase), ble først undersøkt (Fig. 1C). Vi har funnet at nivået av fosforylert ERK-1/2 ble selektivt redusert i LRP1-taushet celler og en økning i JNK-1/2/3-fosforylering ble påvist ved LRP-1 demping. Imidlertid gjorde fosforyleringen nivåer av Akt og p38 MAPK ikke endres vesentlig i LRP-en-mangel karsinomer. Disse resultater viser at LRP-1 kan virke som en intracellulær signalerings modulator, aktivere ERK og inhibering av JNK-signalreaksjonsveier.
(A) Totalt RNA ble renset fra FTC133 styre klonal cellelinje (shCTRL) eller klonale celler som stabilt uttrykker shRNAs for LRP-1 (shLRP-1). Transkripsjonsnivået av LRP-1 ble bestemt ved RT-PCR. p-aktin-primere ble anvendt som en normaliseringskontroll. (B) Hel-celle-ekstrakter fra hver cellelinje ble underkastet immunoblotanalyse med anti-LRP-1 β-kjede-antistoff (5A6). p-aktin-antistoffet ble anvendt for normalisering. (C) shCTRL og shLRP-1 klonale celler ble dyrket i 24 timer på gelatin-belagte overflater i 10% FBS-inneholdende media. Hel-celle-ekstrakter ble immunoblottet ved hjelp av fosfo-ERK, JNK-fosfo, fosfo-Akt og fosfo-p38-antistoffer. Antistoffer mot ERK, JNK, p38 og β-aktin ble benyttet for å sikre lik belastning og for normalisering. Den gel og immunoblot presentert er representative for minst tre separate forsøk. Tall under gel og immunolots indikerer fold inductions av comparaison med shCTRL celler.
LRP-en formidler serum-indusert aktivering av ERK-1/2 og konstituerende hemming av JNK-1/2 /3
LRP-1-mediert regulering av intracellulær signalering kan enten være avhengig av binding av ekstracellulære ligander eller på rekruttering av intracellulære stillaser. Vi vurderte LRP-1-medierte regulering av både ERK (Fig. 2A til 2D) og JNK-reaksjonsveiene (fig. 2E til 2 H) som respons på serumstimulering og gelatinbelegg. LRP-1-mediert aktivering av ERK-1/2-fosforylering ble kun observert i nærvær av serum (fig. 2A og 2B vs 2C og 2D). I motsetning til dette ble aktivering av JNK-1/2/3 i LRP-1-dempede celler ikke betinget ved nærvær av serum (fig. 2E til 2 H). I begge tilfeller regulering av MAPK ved LRP-1 var upåvirket av gelatinbelegg (fig. 2A, 2C, 2E og 2G). LRP-1-reseptor utløser derfor det ekstracellulære-ligand-avhengig aktivering av ERK-1/2 og virker som en konstitutiv inhibitor av JNK-reaksjonsveien.
shCTRL og shLRP-1-celler ble sådd ut på plast eller gelatin- belagt retter i 24 timer i fravær eller nærvær av FBS. Hel-celle-ekstrakter ble underkastet Western-blot-analyse for å studere aktivering av ERK (A-D) og JNK (E-H) i fravær eller nærvær av FBS. De respektive aktiveringsrater ERK (B, D) og JNK (F, H) ble bestemt som intensitetsforhold av fosfo-protein til tilsvarende pan-protein og uttrykt i relative enheter +/- SD, med en verdi på 1 tilskrives shCTRL celler. NS, ikke signifikant; *,
P
. 0,05
LRP-en utgjør en docking nettstedet for Src, ERK og JNK inneholder komplekser
LRP-en C-terminal ende kan samvirke med stillas molekyler som er involvert i signaltransduksjon [28]. Coimmunoprecipitation eksperimenter ble utført for å teste om det intracellulære domenet av LRP-1 er i stand til å rekruttere mål som er involvert i reguleringen av ERK og JNK signalveier i en tumorcelle sammenheng. Som vist på fig. 3, var vi i stand til å lykkes immunpresipitatet LRP-1 β-kjeden med et antistoff hevet mot ekstracellulære LRP-1 α-kjeden. Begge ERK og JNK kinaser ble co-immunopresipitert med LRP-1 β-kjeden. Vi undersøkte også fosforyleringstilstanden av disse kinaser. Fosforylerte former av ERK-1/2 ble funnet i forbindelse med LRP-1, hvor fosforylert JNK var ikke. . Src, en kinase kjent for å bli aktivert på nedstrømssiden av mitogen og matrise-reseptorer, ble også påvist i LRP-1 β-kjeden inneholdende kompleksene
immunoutfellinger av LRP-1-inneholdende komplekser (IP: LRP-1 -α) ble utført ved å bruke anti-LRP-1 α-kjede (8G1) antistoffer og immunokomplekser ble immunoblottet (IB) ved hjelp av 8G1, anti-LRP-1 β-kjeden (5A6), anti-ERK-1/2 , anti-fosfo-ERK-1/2, anti-JNK-1/2/3, anti-fosfo-JNK-1/2/3 og anti-Src-antistoff. Uspesifikke IgG ble brukt som en negativ kontroll over immunoprecipitation.
LRP-1-avhengige ERK-aktivering bidrar til carcinoma celle invasjon
Vi har nylig beskrevet en nøkkelrolle for LRP-en i tumor progresjon [17]. Faktisk, som vist i fig. 4A, LRP-1-manglende celler oppviste en to-gangers redusert invasiv kapasitet, sammenlignet med kontroll klonale celler. Vi har derfor undersøkt om LRP-1-avhengig aktivering av ERK kunne bidra til å karsinomcellelinje invasjon. For det første kontrollceller ble behandlet med U0126, en selektiv inhibitor av MEK-1/2 (MAPK ERK kinase-1/2), eller transfektert med en dominant-negativ mutant av MEK-1. Effektiviteten av ERK-1/2-hemming under disse betingelser kan sees i fig. 4B. Ingen forandring i JNK-fosforylering ble påvist ved ERK-hemming (fig. S1). Kontroll celle invasjon ble inhibert ved U0126 behandling på en doseavhengig måte (fig. 4C og 4D). Videre shCTRL celler som overuttrykker en kinase-dead form av MEK-en utstilt reduserte invasive egenskaper (fig. 4C og 4D). Disse resultatene indikerer at den ERK signaleringsmodulen er aktivert i løpet av carcinoma-celle invasjon. Dernest å redde aktivert ERK sti i LRP-en-forstummet celler, ble en konstitutivt aktiv ERK-2 overexpressed. Av aktiveringstilstanden av ERK-1/2 ble undersøkt ved immunblotting (fig. 4E). Som vist på fig. 4F og 4G, evne til LRP-1-manglende celler å invadere ble delvis gjenopprettet når ERK-2 ble overuttrykkes. Siden tyrosin-kinase Src kan potensielt aktivere ERK aliserte nedstrøms av LRP-1 (fig. 3), ble celle invasjon kvantifisert i nærvær av et Src-kinase-inhibitor. Imidlertid gjorde Src hemming ikke påvirke invasive egenskaper hos både shCTRL og shLRP-1 celler (fig. 4H), og dermed unntatt Src kinase bidrag til LRP-1-mediert ERK-aktivering under carcinoma celle invasjon.
Matrigel invasjonen analysen ble utført for shCTRL og shLRP-1-carcinomceller i basale betingelser (A), som følge av modulasjon av ERK-aktivitet i shCTRL (B-D) og shLRP-1-celler (E-G), eller i nærvær av Src-inhibitor ( H). (C, D) Kapasiteten shCTRL celler å invadere matrigel ble kvantifisert etter hemning av ERK-aktivitet ved hjelp av U0126 behandling (10 eller 25 uM) eller ekspresjon av en kinase-død mutant for MEK-1 (dn-MEK). (F, G) De invasive egenskaper shLRP-1-celler ble undersøkt etter en konstitutiv aktivering av ERK-2 (ca-ERK). Effektiviteten av hemming ERK i shCTRL (B) og ERK-aktivering i shLRP-1-celler (E) ble kontrollert ved hjelp av fosfo-ERK, ERK og p-aktin-antistoffer. Anti-HA ble anvendt for å kontrollere nivået av ekspresjon av overuttrykte HA-merkede proteiner. (H) Tumor celle invasjon ble målt etter hemming av Src-avhengig aktivitet ved anvendelse av 10 uM av Src-kinase-inhibitoren I (Src inh). Representative bilder vises for hver tilstand (D, G). Resultater ble oppnådd fra tre separate forsøk hver utført i tre eksemplarer. Invasjon ble bestemt ved å telle cellene i åtte tilfeldige mikroskopiske felt per brønn. Resultatene ble uttrykt som middel +/- SD etter normalisering ved sammenligning med kjøretøyet, dvs. DMSO for medikamentbehandlinger eller lipofektamin (lipo) for transfeksjon. NS, forskjeller med tilsvarende kontroll var ikke signifikant. *,
P
. 0,05
Hemming av JNK mediert av LRP-en sustains ondartet celle invasjon
På samme måte undersøkte vi i hvilken grad LRP- 1-mediert inhibering av JNK-reaksjonsveien kan støtte karsinomcellelinje invasjon. JNK1 og MKK-7 (MAPK kinase-7) ble således ko-uttrykt i shCTRL celler (Fig. 5A). Invasjon av shCTRL celler ble redusert med 25% når overuttrykkende vill-type JNK (fig. 5B og 5C), hvilket antyder at JNK-inhibering er nødvendig for å fremme invasjon. Deretter brukte vi den selektive JNK-inhibitor SP600125 og en dominant-negativ mutant av JNK å utvinne JNK-inhibering i LRP-1-manglende karsinomer (fig. 5D). Vi observerte ikke noen betydelig modulering av ERK-fosforylering under disse forholdene (Fig. S1). Interessant, den svake kapasiteten til LRP-1-dempede celler å invadere ble signifikant øket i henhold til JNK-inhibering (fig. 5E og 5F). Disse resultatene støtter ideen om at inhibering av JNK-signalveien mediert av LRP-1 bidrar til karsinomcellelinje invasjon.
Cell invasjons analyser ble utført med shCTRL (B, C) og shLRP-1-celler ( E, F) etter modulering av JNK-aktivitet (A, D). (B, C) ShCTRL-celler ble transfektert med ekspresjonsvektor som koder for villtype MKK-7 /JNK-1 før celle invasjon ble kvantifisert. (E, F) De invasive egenskaper av LRP-1-dempede-celler ble målt etter SP600125 behandling (5 eller 10 uM), eller transfeksjon med en dominant-negativ mutant av JNK-1 (dn-JNK). JNK-aktivering i shCTRL (A) og JNK-inhibering i shLRP-1-celler (D) ble undersøkt ved hjelp av fosfo-JNK, JNK og p-aktin-antistoffer. Anti-HA og anti-FLAG ble anvendt for å kontrollere ekspresjonen av overuttrykt kodede proteiner. Representative bilder vises for hver tilstand (C, F). Resultater ble oppnådd fra tre separate forsøk hver utført i tre eksemplarer. Invasjon ble bestemt ved å telle cellene i åtte tilfeldige mikroskopiske felt per brønn. Resultatene ble uttrykt som middel +/- SD etter normalisering ved sammenligning med kjøretøyet, dvs. DMSO for medikamentbehandlinger eller lipofektamin (lipo) for transfeksjoner. *,
P
. 0,05
Den LRP-1-mediert regulering av MAPK styrer feste carcinoma celler
Vi har nylig rapportert at LRP-en stanse alvorlig svekket invasjonen av ondartede celler etter hverandre til en sterk endring av celle-matrix samhandling turn-over. Vi har derfor postulert at LRP-1-avhengig styring i begge ERK og JNK-reaksjonsveiene bidrar til å modulere celle-matrise-interaksjoner for å støtte invasivitet. Som forventet, shLRP-1 celler, hvor ERK aktiviteten er redusert, vises en akselererende hastighet av tilknytning til gelatin-belagte overflater, sammenlignet med kontroll klonale celler (fig. 6A). Videre overekspresjon av en kinase-inaktivt MEK-1 mutant i shCTRL celler førte til øket adhesjon hastighet (fig. 6B), mens konstitutivt aktiv ERK-2 reduserte kapasiteten til LRP-1-manglende celler å feste (Fig. 6C). Faktisk, etter 60 min av vedlegg, ble heftende celler økte to ganger på ERK sti hemming (Fig. 6B). Samtidig er feste, ble prosentandelen av holde LRP-1-celler dempede redusert 2-fold i henhold til ERK-aktivering (fig. 6B og 6C). Likeledes overekspresjon av vill-type MKK-7 /JNK-1 i kontrollceller resulterte i en to-gangers forbedret tilslutning etter 60 minutter (Fig. 7A). Videre ble den økede festehastighet observert i LRP-1-manglende celler reversert ved ekspresjon av en dominant-negativ form av JNK-en (fig. 7B). Disse data understøtter ideen om at LRP-1 opprettholder maligne celler i en mellomliggende klebemiddel tilstand som er gunstig for invasjon via ERK-aktivering og JNK-inhibering.
(A) shCTRL (hvite bokser) og shLRP-1 (grå bokser ) celler ble sådd ut på gelatin-belagte plater, og de ikke-adherente celler ble fjernet etter 30, 60 eller 90 min. Adhesjons-analyser ble også utført med shCTRL celler som overuttrykker et kinase-død mutant for MEK-1 (dn-MEK) (B) og shLRP-en som overuttrykker en konstitutivt aktiv-ERK-2 (ca-ERK) (C). For hver tilstand, blir resultatene uttrykt i prosent av tilsvarende kontroll-adherente celler i 90 minutter. Hver verdi er gjennomsnittet +/- SD for fire separate forsøk, med hver utført in triplo. *,
P
. 0,05
shCTRL (hvite bokser) og shLRP-1 (grå bokser) celler ble sådd ut på gelatin-belagte plater og ikke-heftende celler ble forkastet etter 30, 60 eller 90 min. Adhesjons-analyser ble utført med shCTRL celler som overuttrykker villtype MKK-7 /JNK1 (A) og shLRP-en som overuttrykker en dominant negativ mutant av JNK-1 (dn-JNK) (B) kinaser. For hver tilstand, blir resultatene uttrykt i prosent av tilsvarende kontroll-adherente celler i 90 minutter. Hver verdi er gjennomsnittet +/- SD for fire separate forsøk, med hver utført in triplo. *,
P
. 0,05
Den aktin nettverk av hurtig invadere karsinom blir reddet i LRP-en-forstummet celler etter aktivering av ERK eller hemming av hyperactivated JNK
Vi videre undersøkt om LRP-en avhengig regulering av MAPK signal kunne organisere koordinering av aktin og heft dynamikk under ondartet celle invasjon. Vi analyserte derfor den cellulære fordelingen av fibrillær aktin etter modulering av ERK og JNK aktivitet (Fig. 8). Heftende kontrollceller viste en polarisert morfologi med filopodial celle utvidelser og en hovedsakelig cortically distribuert aktin nettverk (Fig. 8A). I skarp kontrast, LRP-en-tie indusert bredte morfologi med mange spennings fibre, fremtredende tverrgående filamenter og en utviklet forgrenet aktin nettverk (Fig. 8F). Hemning av ERK-signalering i styringskreftceller ved U0126 behandling (Fig. 8B vs 8A) eller en dominant-negativ form av MEK-1 (fig. 8D vs 8C) induserte drastiske morfologiske forandringer som ligner de som ble oppnådd i henhold til LRP-1 demping. Det samme resultatet ble observert etter ekspresjon av villtype MKK-7 /JNK-1 i kontroll karcinomaceller (fig. 8E vs 8C). I LRP-1-stilnet celler, inhibering av JNK-signalering ved SP600125 (Fig. 8G vs 8F) eller overekspresjon av kinase-inaktive JNK-1 (fig. 8J vs 8H) gjenopprettet mesenchymale-lignende morfologi av villtype-carcinomceller. Videre konstitutivt aktiv-ERK-2 (fig. 8I vs 8H) var tilstrekkelig til å reversere bredte morfologi forårsaket av stanse av LRP-1. Resultatene viste at LRP-en stanse induserer store aktin cytoskjelett rearrangements direkte knyttet til ERK hemming og JNK hyperaktive.
shCTRL (A-E) og shLRP-1 (F-J) celler ble sådd ut gelatin-belagt plater for 120 min. ERK eller JNK aktiviteter ble modulert. Kontrollceller ble behandlet med 25 uM U0126 (B), eller transfektert med en kinase-død mutant for MEK-1 (dn-MEK) (D) for å hemme ERK-avhengige reaksjonsveien og JNK-aktivering ble oppnådd ved overekspresjon av både villtype MKK-7 og JNK-1 (E). For LRP-1-manglende celler, ble inhibering av JNK-reaksjonsveien oppnådd ved hjelp av SP600125 behandling (10 pM) (G) eller overekspresjon av en dominant-negativ form av JNK-1 (J), mens aktivering av ERK reaksjonsveien ble oppnådd etter ved hjelp av en ekspresjonsvektor for konstitutivt aktiv-ERK-2 (i). DMSO (A, F) fungerte som kontroll for medikamentell behandling (B, G) og lipofektamin (C, H) tjente som kontroll for transfeksjon analyser (D, E, I, J). Cellene ble farget for aktin filamenter (rød) og kjerner ble kontra med DAPI (blå). Bilder er representative for minst tre separate sett av kulturer. Barer, 20 mikrometer.
LRP-1-avhengig aktivering av ERK og hemming av JNK er nødvendig for FA demontering i raskt invaderer karsinom
Med tanke på effekten av LRP-en stanse på klebe og morfologiske egenskaper av carcinoma celler (fig. 6, 7 og 8), har vi undersøkt hvorvidt LRP-1-formidlet kontroll av MAPK er nødvendige for FA turn-over. Således ble den cellulære fordelingen av brennkompleksene analysert i shCTRL og shLRP-1-celler etter differensial aktivering av ERK og JNK-reaksjonsveiene (Fig. 9A til 9J). LRP-en-lyddemping førte til opphopning av mange og svært strukturerte fokale komplekser på celle periferien (Fig. 9F vs 9A). Interferens med ERK-aktivering i kontrollcellene med U0126 (fig. 9B vs 9A) eller et kinase-inaktiv form av MEK-1 (fig. 9D vs 9C) økte antallet og størrelsen av Talin holdige fokale kontakter i samme grad som observeres i LRP-1-stilnet-celler (fig. 9f). Følgelig overekspresjon av vill-type MKK-7 /JNK-1 i LRP-1-uttrykkende kontrollceller stimulert akkumulering av Talin-inneholdende perifere vedheft strukturer (fig. 9E vs 9C). I motsetning til dette, ble antallet Talin rike strukturer drastisk redusert i LRP-1-taushet celler ved hjelp av en selektiv JNK inhibitor (fig. 9G vs 9F) eller ekspresjon av en dominant-negativ JNK-1-mutant (fig. 9J vs 9H ). Lignende resultater ble oppnådd når en konstitutivt aktiv-ERK-2 ble uttrykt i LRP-1-manglende celler (Fig. 9i vs 9H). Disse data viste at JNK-aktivering eller ERK-inhibering i LRP-1-manglende celler kunne gjenopprette den opprinnelige fordelingen av adhesjons komplekser. Prosentandelen av celler som var positive for FA ble deretter kvantifisert, som allerede er beskrevet [17]. Som vist på fig. 9K og 9L, antallet LRP-1-uttrykkende kreftceller positive for Talin rike adhesjons komplekser ble økt med omtrent 1,4-fold i henhold til ERK inhibering (U0126 og dn-MEK) og 1,7-fold i henhold til JNK-aktivering (MKK-7 /JNK-1). Derimot ble økt antall fokus kontakter forårsaket av LRP-en stanse delvis reversert av ERK-aktivering (ca-ERK) eller JNK hemming (SP600125 og dn-JNK). Derfor vises LRP-en som hovedformidler av vedheft avbrudd gjennom regulering av ERK og JNK signalveier.
(A-J) shCTRL (A-E) og shLRP-1 (F-J) celler ble sådd ut på gelatin-belagte plater i 120 minutter. ERK signalveien ble hemmet i shCTRL celler ved anvendelse av 25 uM U0126 (B) eller en kinase-dead MEK-1-mutant (dn-MEK) (D) og reaktiveres i shLRP-1 celler ved en konstitutiv aktivering av ERK-2 (ca. -ERK) (I). Den MKK-7 /JNK1 vektor ble benyttet til å utløse JNK-aktivering i shCTRL celler (E) mens JNK-inhibering i LRP-1-manglende celler ble oppnådd ved anvendelse av en 10 uM SP600125 (G) eller en død-kinase for JNK-1 ( dn-JNK) (J). DMSO (A, F) fungerte som kontrollgruppe for medikamentell behandling (B, G) og lipofektamin (C, H) tjente som en kontroll for transfections (D, E, I, J). Cellene ble så farget for talin (grønn) og kjerner ble motfarget med DAPI (blå). Bilder er representative for minst tre separate sett av kulturer. Barer, 20 mikrometer. (K, L). Prosentandelen av celler positive for fokale sammenvoksninger ble kvantifisert etter modulering av ERK og JNK aktiviteter ved hjelp av selektive medikamentelle behandlinger (K) eller den angitte MAPK konstruksjon (L). For hver tilstand, ble tre hundre celler fra tre separate forsøk evaluert. Resultatene ble uttrykt i prosent, i forhold til shCTRL celler behandlet med DMSO (K) eller lipofektamin (L). *,
P
. 0,05
LRP-en er koblet til cytoskjelett og FA komponenter og styrer rekruttering av aktive MAPK til Focal komplekser
For å klargjøre den molekylære mekanismen som LRP-en styrer FA dynamikk og cytoskeletal organisasjonen gjennom MAPK regulering, ble immunoutfellingsstudier analyser utført (fig. 10). Dataene presentert i figur 10A viste at α-actinin, talin og paxillin samhandle med LRP-1 β-kjeden i hurtig-invaderende karsinomceller. Interessant nok har vi også oppdaget at en forbindelse mellom LRP-1 og aktivt fosfo-Shp-2 (SH2 domene-inneholdende protein tyrosin fosfatase-2), PP2A (serin /treonin proteinfosfatase 2A), og PAK (p-21 aktivert kinase) hvilken er viktige regulatorer av MAPK signalering. Andre molekylære releer som Ras og MEK ble også funnet assosiert til LRP-en-ICD (fig. S2). Sammensetningen av Talin-inneholdende kompleksene ble deretter analysert i LRP-1-dempede-celler sammenlignet med kontrolltumorceller (Fig. 10B). Som forventet, ble en øket mengde av talin observert i LRP-1-manglende celler. Videre er mengden av paxillin i Talin-inneholdende kompleksene ble bestemt endret i henhold til LRP-en stanse, mens α-actinin var ikke. Interessant, aktive former av ERK ble hovedsakelig påvist i Talin-inneholdende komplekser av LRP-1-uttrykkende celler. Videre ble det observert en sterk opphopning av fosfo-JNK i disse kompleksene i henhold til LRP-1 lyddemping.
shCTRL og shLRP-1-cellene ble sådd ut på gelatin-belagte overflater og hel-celle-ekstrakter ble anvendt til å utføre immunoutfellingsstudier eksperimenter (IP). (A) Immunoutfelling av LRP-1-inneholdende kompleksene ble utført ved bruk av de monoklonale anti-LRP-1-antistoffer (8G1). Immunkomplekser ble deretter immunoblottet (IB) ved hjelp av spesifikke antistoffer for LRP-1 β-kjeden, α-actinin, Talin, paxillin, fosfor-Shp-2, PP2A og PAK. (B) Talin-inneholdende kompleksene ble immunopresipitert og analysert ved hjelp av Western-blot ved bruk av anti-Talin, anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-JNK, anti-α-actinin og anti-paxillin antistoffer. Uspesifikke IgG ble brukt som en negativ kontroll over immunoutfellingsstudier analyser.
Diskusjoner
Med tanke på mangelen på molekylær kunnskap om LRP-1 i kreft-feltet, vi undersøkte den intracellulære signal nettverk å koble LRP-1 til den aggressive oppførsel av tumorceller. Våre resultater fremhevet at LRP-en opprettholder ondartede celler i et lim tilstand gunstig for invasjon ved å kontrollere ERK og JNK-avhengige veier.
Vi først vist at LRP-1 uttrykk i carcinoma celler utløser serum-mediert aktivering av ERK og er ansvarlig for den konstituerende hemming av JNK. I samsvar med våre resultater, har tidligere studier har rapportert en redusert fosforylering av ERK-1/2 i LRP-1-manglende ikke-kreftceller [15], [32]. På den annen side, Ma og medarbeidere rapporterte at LRP-en kan undertrykke ERK-aktivering for å kontrollere celle mobilitet [31]. I HT1080-celler fibrosarkom, Webb og kolleger vist at LRP-1-mangel ført til økt fosforylert ERK-nivå som stimulerer cellemigrering og invasjon [33]. I disse studiene, aktivering av ERK i LRP-1-manglende celler som kreves for ekspresjon av uPAR, uPA til reseptoren, som binder vitronektin. Disse resultatene viste seg å være meget vitronektin-avhengig siden uPAR-vitronektin interaksjonen er velkjent for å være tilstrekkelig til å igangnedstrøms forandringer i cellemigrering og signaltransduksjon [34]. Evnen til LRP-1 for å mediere den endocytiske opptak av uPAR og ned-regulere celleoverflaten mengden av uPA: uPAR-komplekset ble ofte fremkalt for å forklare kontroll av ERK-aktivering av LRP-1 [31], [33], [35 ]. Imidlertid, shRNA-mediert knock-down av LRP-1 ikke påvirke celleoverflatenivået av uPAR i vår modell [17]. Selv om ERK-aktivering ble rapportert som svar på ligandbinding til LRP-1 [15], [19], [32], [36], er en klar oversikt over de underliggende mekanismene fremdeles mangler.
