Abstract
Epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosin-kinase (EGFR-TK) inhibitorer er anvendbare ved behandling av forskjellige avanserte humane kreftformer; varierer imidlertid deres kliniske effekt. Denne studien oppdaget
K-ras
mutasjoner å forutsi effekten av EGFR-TK inhibitor cetuximab behandling på kinesiske pasienter med metastatisk kolorektalcancer (mCRC). Totalt 87 pasienter med metastatisk kolorektalcancer ble behandlet med cetuximab for 2-16 måneder, i kombinasjon med kjemoterapi mellom august 2008 og juli 2012, og vevsprøver ble brukt for å oppdage
K-ras
mutasjoner. Dataene viste at
K-ras
mutasjonen skjedde i 27/87 (31%). Målet responsrater og sykdomskontrollrate på
K-ras
villtype og mutant pasientene var 42% (25/60) versus 11% (3/27) (p 0,05) og 60% (36 /60) i forhold til 26% (7/27) (p 0,05), respektivt. Pasienter med villtype
K-ras
hatt betydelig høyere median overlevelse ganger og progresjonsfri overlevelse, enn pasienter med mutert
K-ras plakater (21 måneder versus 17 måneder, p = 0,017 , 10 måneder versus seks måneder, p = 0,6). Disse funnene tyder på at en høy frekvens av
K-ras
mutasjoner oppstår i kinesiske mCRC pasienter og at
K-ras
mutasjon er nødvendig for å velge pasienter for valgbarhet for cetuximab terapi. Videre prospektive studier med en stor utvalgsstørrelse for å bekrefte disse foreløpige funn
Citation. Li Z, Liu XW, Chi ZC, Sun BS, Cheng Y, Cheng LW (2015) Påvisning av
K -ras
Mutasjoner i forutsi effekt av epidermal vekstfaktor reseptor tyrosin kinase (EGFR-TK) hemmer hos pasienter med metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE 10 (5): e0101019. doi: 10,1371 /journal.pone.0101019
Academic Redaktør: Laszlo Buday, ungarske Academy of Sciences, UNGARN
mottatt: 27 september 2013; Godkjent: 02.06.2014; Publisert: 07.05.2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste diagnosen kreft i verden og er en av de mest betydelige helseproblemer i Kina [1]. Selv om forekomsten av CRC pleide å være lavere i Kina enn i vestlige land, har den økt kraftig de siste årene [2]. Kirurgi er den beste behandling alternativet for CRC, som de fleste andre kreftformer, men metastatisk CRC trenger kombinasjonsbehandling, som for eksempel kirurgi pluss kjemoterapi eller mål terapi. I løpet av de siste tiårene, har 5-fluorouracil (5-FU) regimer produsert median overlevelse på ca 12 måneder for avansert CRC, mens kalsiumfolinat (CF) pluss 5-Fu forlenger median overlevelse i 14 måneder [3]. Videre oksaliplatin og irinotekan har økt median total overlevelse av pasienter til mer enn 20 måneder [4]. Sist, rettet mot behandling, inkludert anti-epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosin-kinase (EGFR-TK) har vist seg å forbedre total overlevelse av pasienter med villtype KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog) metastatisk CRC [ ,,,0],5]. Men anti-EGFR-TK behandling ved hjelp av gefitinib, erlotinib, eller cetuximab produserer forskjellige resultater i ulike kreft hos mennesker. Årsaken kan være fordi anti-EGFR-terapi hos pasienter med muterte
K-ras
kan ikke bare være ineffektivt, men også skadelig [5]. Dermed har 2011 retningslinjer fra National Comprehensive Cancer Network (NCCN) anbefales cetuximab som førstelinjebehandling for pasienter med villtype
K-ras
siden EGFR og
K-ras
mutasjoner er eksklusive [6].
K-ras
genet koder for et 21 kDa protein, som er en GTP /BNP bindende protein med GTPase aktivitet og er involvert i transduksjon av mitogene signaler til lenker reseptor tyrosine kinase aktivering til nedstrøms effektorer. Etter BNP binder seg til p21 RAS protein, vil det konvertere den til en inaktiv form, miste sin funksjon for signaloverføring. Mutasjoner i genet RAS vanligvis føre til konstitutiv aktivering av RAS GTPase, som fører til aktivering av nedstrøms signalveier, og som resulterer i celle-transformasjon og tumorigenesis [7-9]. I CRC, mer enn 90% av
K-ras
mutasjoner forekommer i
K-ras
exon 1 kodon 12 og kodon 13 [7,8].
Cetuximab er en kimære mus /humant monoklonalt antistoff mot EGFR-TK og utvikling og bruk av cetuximab har bedret overlevelse av mCRC pasienter. Tidligere data indikerte at effekten av cetuximab ble tett forbundet med
K-ras
mutasjoner, så det amerikanske Food and Drug Administration anbefales at pasienter bør gjennomgå
K-ras
mutasjonsanalyse før mottak av cetuximab behandling . Men ikke alle pasienter med villtype
K-ras
vil dra nytte av cetuximab behandling, så det var ingen sammenheng mellom EGFR uttrykk og cetuximab effekt. Total responsrate på pasienter med villtype
K-ras anbefale til cetuximab er bare 40-60%, men svarprosenten av pasienter med
K-ras
mutasjoner var bare 10% eller mindre [10,11], og dermed, i denne studien, vi har oppdaget
K-ras
mutasjoner å forutsi effekten av EGFR-TK inhibitor cetuximab i kinesiske pasienter med metastatisk kolorektalcancer.
Materialer og metoder
pasienter
i denne studien har vi rekruttert totalt 87 pasienter med histologisk bekreftet mCRC i Jilin-provinsen Cancer Hospital mellom januar 2008 og august 2010 som ble behandlet med ukentlig cetuximab (400 mg /m
2 som en initial startdose, og 250 mg /m
2 påfølgende dose) i kombinasjon med kjemoterapi (standard dose). Nærmere bestemt 55 pasienter fikk cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi og ytterligere 32 pasienter fikk cetuximab pluss irinotekan-basert kjemoterapi i 2-16 måneder. Cetuximab ble administrert som førstelinjebehandling i alle 87 pasienter ukentlig inntil sykdomsprogresjon eller slutten av denne studien. The Cancer Hospital i Jilin-provinsen Review Board godkjent denne studien og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag. Pasienter ble ekskludert fra denne studien dersom de ikke hadde fått postoperativ kjemoterapi, eller om de var 25 eller 80 år gammel.
Evaluering av behandlingsrespons og overlevelse av pasienter
Behandlingsrespons ble anslått hver måned ved computertomografi (CT) av stedet for metastasering (lever og lunge) i henhold til Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) [12]. Pasientene ble kategorisert som en komplett respons (CR), delvis respons (PR), stabil sykdom (SD), eller progressiv sykdom (PD). Målet Svarprosenten ble definert som (CR + PR) /Total, mens sykdomskontrollrate ble definert som (CR + PR + SD) /Total. Total overlevelse ble definert som tiden fra histopatologiske diagnose til død uansett årsak. Den stabil sykdom siktet at etter behandling, vil sykdommen vedvarer i minst fire uker uten signifikant endring i tumor lesjon. Den siste oppfølging av disse pasientene var i juli 2012. Men alle fag i denne studien hadde stadium IV sykdom og hvis sykdommen utviklet seg, ville behandling med cetuximab avbrytes. Dermed studien presenterer progresjonsfri overlevelse data
DNA-ekstraksjon og påvisning av K-ras mutasjoner
Parafin kvartaler fra tumorvev ble revurderes ved hjelp av H . E-fargede vevssnitt til sørge for at det totale antall tumorceller var lik for forskjellige prøver. Utvalgte deler vev fra CRC-pasienter som inneholder en høy andel av tumorceller (typisk ≥ 60%) ble identifisert ved tre erfarne patologer. Etter dette ble genomisk DNA ekstrahert fra tre 10 um tykke deler av hver tumorprøve i henhold til protokollen beskrevet tidligere [13]. Kort sagt ble vevssnittene deparaffinized i xylen, vaskes i absolutt etanol, og inkubert ved romtemperatur med 150 ul fordøyelse buffer (1 mg /ml proteinase K; 0,05 M Tris-HCl, pH 8,5; 1 mM etylendiamintetra-eddiksyre; 0,5% Tween 20; 2% natriumdodecylsulfat) i 24 timer. Den neste dag ble reaksjonene sentrifugert ved 15 000 g i 15 min og DNA ble ekstrahert ved anvendelse av en DNA-QIAamp FFPE Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble DNA-konsentrasjonen spektrofotometrisk vurdert ved anvendelse av en bølgelengde på 280/260 nm og justert til en endelig konsentrasjon på 100 pg /ml og lagret ved -20 ° C inntil bruk.
å detektere
K -ras
mutasjoner, polymerase chain reaction-enkelt strand konformasjon polymorphism (PCR-SSCP) ble utført ved hjelp av primere og PCR kit (Takara Bioteknologi (Dalian) Co Ltd, Dalian, Kina). I korthet ble en 50 pl PCR-blanding som ble fremstilt for hver prøve, som inneholdt 2 ul genomisk DNA, 1 pl av 10 umol /l av hver primer og 25 ul premiks (1,5 U Takara Taq-polymerase, 10 x PCR-buffer, 3,0 mmol /l Mg2 +, 0,4 mmol /l deoxynucleotidetriphosphate). Primerne for å detektere
K-ras
mutasjoner i kodon 12 og 13 var 5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3 «og 5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3», som tidligere beskrevet [14]. PCR ble utført på en 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med en innledende denaturering trinn ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sek, en endelig 72 ° C forlengelse i 5 min, og deretter lagret ved 4 ° C på ubestemt tid. Etter dette, ble PCR-produktene separert på 1,5% agarosegeler og renset ved anvendelse av et QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Venlo, Nederland) og sendes for DNA-sekvensanalyse av de
K-ras mutasjoner
ved Shanghai Generay Biotech Co Ltd (Shanghai, Kina).
Statistisk analyse
Sammenhengen mellom
K-ras
mutasjoner og respons på cetuximab behandling ble analysert ved hjelp av Fishers eksakte test. Kaplan-Meier-kurver og Log-rank test ble brukt til å analysere sammenhengen mellom
K-ras
mutasjoner og total overlevelse (OS) og progresjonsfri overlevelse (PFS) av pasientene. Den Cox proporsjonal risikomodell ble benyttet for å bestemme faktorer knyttet til total overlevelse. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
I denne studien har vi behandlet totalt 87 mCRC pasienter med cetuximab pluss oksaliplatinbasert (55 pasienter) eller irinotecan-baserte (32 pasienter) kjemoterapi i 2 til 16 måneder. De tumorvev ble utsatt for deteksjon av
K-ras mutasjoner
. Vi fant 27 pasienter med en mutert
K-ras
og den samlede
K-ras
mutasjonsraten var 31%. De detaljerte pasientkarakteristika er vist i tabell 1.
Pasientene med villtype
K-ras svulst
hadde bedre ORR og DCR enn for pasienter med mutert
K -ras svulst
, dvs. DCR, 60% vs. 26% (χ
2 = 23,582, p 0,05), ORR, 42% vs. 11% (χ
2 = 24,669, p 0.05, tabell 2), noe som indikerer at påvisning av
K-ras
mutasjon kan forutsi responsen av pasientene til cetuximab pluss kjemoterapi. Blant 32 tilfeller mottar irinotecan, ni tilfeller hadde
K-ras
mutasjon, mens det blant 55 saker som får oksaliplatin, 18 saker hadde
K-ras
mutasjon; Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i
K-ras-mutasjon
mellom pasienter som fikk irinotecan og de som fikk oxaliplatin (p 0,05, tabell 3). Videre pasienter behandlet med cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi hadde bedre ORR og DCR enn for pasienter behandlet med cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi, dvs. DCR, 66% vs. 40% (χ
2 = 13,569, p . 0.05, tabell 3)
Videre fant vi at median overlevelse var 21 måneder i pasienter med villtype
K-ras
, mens median overlevelse var 17 måneder hos pasienter med mutert
K-ras
. Denne forskjellen var statistisk signifikant (χ
2 = 5,703, P = 0,017; figur 1). Den progresjonsfri overlevelse var 10 måneder hos pasienter med villtype
K-ras
, mens progresjonsfri overlevelse var 6 måneder hos pasienter med mutert
K-ras
. Denne forskjellen var ikke statistisk signifikant.
Videre median overlevelse var 22 måneder hos pasienter behandlet med cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi, mens median overlevelse var 18 måneder hos pasienter behandlet med cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi Denne forskjellen var også statistisk signifikant (χ
2 = 3,957 p = 0,047; figur 2). Etter CT og kjernemagnetisk resonans, de mCRC pasienter fikk cetuximab pluss irinotecan eller cetuximab pluss oksaliplatin kjemoterapi og fire mCRC pasienter ble vist i figur 3. Spesielt i sak 1, CR (helt respons) Pasienten ble behandlet med fire sykluser av cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi. Sak 2 var en CR pasient som ble behandlet med tre sykluser av cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi. Sak 3 var et PR (delvis respons) pasient som fikk fire sykluser av cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi. Sak 4 var også en PR pasient som ble behandlet med fire sykluser av cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi. Leveren fokus forsvant i sak 1 og 2, og fokuset ble sterkt redusert i sak 3 og 4. Den univariate analysen viste at
K-ras
mutasjoner og behandling valg var assosiert med dårlig prognose i CRC pasienter (
p
= 0,017 og
p
= 0,047, henholdsvis), mens multivariat analyse viste at
K-ras
mutasjon, behandling valg, og dårlig tumor differensiering var uavhengig faktorer for overlevelse av pasienter med mCRC (
p
= 0,004,
p
= 0,006 og
p
= 0,015, henholdsvis tabell 4).
disse pasientene ble behandlet med irinotecan-basert (n = 32) og oksaliplatinbasert (n = 55).
case 1 er en CR pasient som ble behandlet med fire sykluser av cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi. Sak 2 er en CR pasient som ble behandlet med tre sykluser av cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi. Sak 3 er et PR-pasient som fikk fire sykluser av cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi. Sak 4 er også en PR pasient som ble behandlet med fire sykluser av cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi. CR, fullstendig svar; PR, delvis respons.
Diskusjoner
I denne studien, vi har oppdaget
K-ras
mutasjoner i tumor vev for å forutsi respons på kinesisk pasienter med metastatisk kolorektalcancer til cetuximab pluss oksaliplatin eller irinotecan-basert kjemoterapi. Vi fant at pasienter med villtype
K-ras
etter disse behandlingene hadde bedre ORR og DCR enn pasienter med mutert
K-ras plakater (42% vs. 11% og 60% vs. 26%, henholdsvis.) Videre har vi funnet at median overlevelse av pasienter med villtype
K-ras
var 21 måneder sammenlignet med 17 måneder hos pasienter med muterte
K-ras
(p = 0,017). I tillegg var median overlevelse hos pasienter behandlet med Cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi var 22 måneder sammenlignet med 18 måneder hos pasienter behandlet med cetuximab pluss oksaliplatinbasert kjemoterapi (p = 0,047). Denne studien støtter den observasjon at påvisning av
K-ras
mutasjon er en nyttig prediktor for anti-EGFR-TK behandling ved metastatisk kolorektalcancer. Videre studier bør undersøke den underliggende molekylære mekanismen ansvarlig for mutert
K-ras
i utviklingen av avansert kolorektal kreft.
Tykktarmskreft metastasizes ofte til leveren, noe som fører til problemer med å kontrollere det klinisk . I vår studie, var 65 av 87 pasienter (74,7%) som hadde metastatisk sykdom i leveren, etterfulgt av metastasering til lungen, eggstokk, og hud. Uten progressiv behandling, pasienter med metastatisk sykdom har en svært dårlig prognose [15]; dermed vil fremskritt i behandling av metastatisk kolorektalcancer redde liv og forbedre livskvaliteten for pasientene. I denne studien vurderer vi
K-ras
mutasjoner i 87 mCRC pasienter til å forutsi responsen av pasienter til cetuximab pluss oksaliplatin eller irinotecan-basert kjemoterapi. Vi fant 27 pasienter med mutert
K-ras product: (31%), som var i samsvar med de i vestlige CRC pasienter [16] og kinesiske CRC pasienter [17]. Tidligere studier har vist at pasienter med villtype
K-ras
hatt en bedre respons på cetuximab behandling enn de med mutert
K-ras product: [10,11]. I denne studien, bekreftes også disse funnene [10,11,18]. På et molekylært nivå, kan andre ikke-tyrosin kinaser også aktivere EGFR signalveien som kan forklare hvorfor
K-ras
mutasjon er nyttig, men ikke perfekt i å forutsi motstand mot cetuximab. Videre vi eller andre, bare oppdaget de vanligste mutasjonene i
K-ras plakater (dvs. ekson kodon 12 og 13), men andre
K-ras
kan også spille en rolle i anti-EGFR-TK motstand. I tillegg er det nødvendig å kontrollere om subtyper eller området av metastatisk kolorektalcancer spille en rolle i respons til anti-EGFR-TK terapi, som cetuximab.
Videre studien kombinert cetuximab med oksaliplatin eller irinotekanbasert kjemoterapi, som også kan påvirke responsen pasientene. Forskjellen vi viser i denne studien kan være på grunn av interaksjon mellom cetuximab og irinotecan eller oksaliplatin; dermed er videre studier er nødvendig for å avklare dette spørsmålet. Imidlertid Van Cutsem et al. undersøkt kjemoterapi utfallet i K-
ras
pasienter med metastatisk kolorektalcancer og viste at det var ingen signifikant forskjell i progresjonsfri overlevelse eller total overlevelse mellom pasienter som fikk cetuximab pluss irinotekan, fluorouracil og folinsyre (FOLFIRI) eller FOLFIRI alene [19]. Derfor er det mulig at en annen kjemoterapi kan føre til forskjellige responser i pasienter.
aktivert K-ras-proteinet reagerer med fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) for å aktivere dets nedstrøms effektorer (slik som pattedyr mål av rapamycin ) til indirekte modulere celle overlevelse. Dessuten gjennom BRAF /mitogen-aktivert kinase (MAPK) reaksjonsveien, aktivert K-ras-proteinet også påvirker celleproliferasjon [20]. Hittil har en rekke målrettede terapier mot EGFR-signalering er etablert og cetuximab er en menneskelig /mus kimære IgG1 monoklonalt antistoff som binder seg til det ekstracellulære domenet av EGFR og hemmer EGFR-medierte signal [21]. En fersk studie viste at cetuximab behandlingen var effektiv i villtype
K-ras
og EGFR kinesisk CRC pasienter, som ga bevis for effekt-prediksjon av EGFR målretting terapeutiske strategier [22,23].
Men mye mer er nødvendig for vellykket cetuximab terapi av avanserte CRC pasienter i klinikken. Vi kunne først vurdere
K-ras
mutasjoner til å velge pasienter med behov for cetuximab behandling og deretter undersøke hvordan mutert
K-ras
fiendskap cetuximab effekt eller omgår EGFR-TK hemming. En ny legemiddelkombinasjonen kan være nødvendig for å undertrykke aktiviteten av muterte K-ras-proteinet.
