Abstract
Innledning
Upassende DNA metylering er ofte forbundet med menneskelig svulst utvikling, og i spesielle tilfeller, er assosiert med kliniske resultater. Tidligere rapporter om DNA metylering i lav /middels grad av ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) har antydet at bestemte mønstre av DNA metylering kan ha en rolle som diagnostiske eller prognostiske biomarkører. I lys av den aggressive og klinisk uforutsigbare natur høyverdig (HG) NMIBC, og dagens mangel på det foretrukne alternativ behandling (Bacillus: Calmette-Guerin), analyserer romanen metylering kan likeledes avsløre biomarkører for sykdom utfall som kunne risikere-stratify pasienter og veilede klinisk behandling ved førstegangsdiagnose.
Metoder
Arrangøren-forbundet CpG island metylering ble bestemt i primær svulstvev av 36 innledende presentasjon høyverdig NMIBCs, 12 lav /middels grad NMIBCs og 3 normale blærekontroll. Genene
HOXA9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1 Hotell og
ZNF154
ble valgt for undersøkelse på grunnlag av tidligere rapporter og /eller prognostisk verktøy i lav /middels grad NMIBC. Metylering ble bestemt ved pyrosekvensering av natrium-bisulfitt konvertert DNA, og deretter korrelert med gen-ekspresjon ved hjelp av RT-qPCR. Metylering ble også korrelert med tumor atferd, inkludert tumor tilbakefall og progresjon til muskel invasiv blærekreft eller metastaser.
Resultater
ISL1
gener «promoter-forbundet øya var mer ofte metylert i tilbakevendende og progressive høyverdig svulster enn sine ikke-tilbakevendende kolleger (60.0%
vs
. 18,2%,
p
= 0,008).
ISL1 Hotell og
HOXA9
viste signifikant høyere gjennomsnittlig metylering i tilbakevendende og progressive svulster sammenlignet med ikke-tilbakevendende tumorer (43,3%
vs
. 20,9%,
p
= 0,016 og 34,5%
vs
17,6%,
p
= 0,017, henholdsvis). Samtidig
ISL1 /HOXA9
metylering i HG-NMIBC spådd pålitelig tumor tilbakefall og progresjon innen ett år (positiv prediktiv verdi 91,7%), og var assosiert med sykdomsspesifikk dødelighet (DSM).
konklusjoner
I denne studien rapporterer vi metylering forskjeller og likheter mellom kliniske sub-typer av høy klasse NMIBC. Vi rapporterer potensialet evne metylering biomarkører, ved førstegangsdiagnose, å forutsi tumor tilbakefall og progresjon innen ett år etter diagnose. Vi fant at spesifikke biomarkører å forutse sykdomsforløp og kan derfor hjelpe pasienten behandling til tross for uforutsigbar klinisk kurs og heterogenitet av høyverdig NMIBC. Videre undersøkelser er nødvendig, inkludert validering i et større pasientmateriale, for å bekrefte den kliniske nytten av metylering biomarkører i høyverdig NMIBC
Citation. Kitchen MO, Bryan RT, Haworth KE, Emes RD, Luscombe C, Gommersall L, et al. (2015) metylering av
HOXA9 Hotell og
ISL1
Spår Patient Outcome i High-Grade ikke-invasiv blærekreft. PLoS ONE 10 (9): e0137003. doi: 10,1371 /journal.pone.0137003
Redaktør: Bing-Hua Jiang, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: May 14, 2015; Godkjent: 11 august 2015; Publisert: 02.09.2015
Copyright: © 2015 Kitchen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Nord Staffordshire Medical Institute, forskning Awards Committee, «Pump-Prime» Grant, og Universitetssykehuset i Nord-Midlands NHS Trust Cancer Charitable Foundation. BCPP er finansiert av Cancer Research UK, University of Birmingham og Birmingham The Black Country og West Midlands Nord- og Sør Omfattende Lokal forskningsnettverk, og sponset av University of Birmingham. Den BCPP biospecimen Samlingen er støttet av midler fra Birmingham Experimental Cancer Medicine Centre. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Høy grad av ikke-muskel invasiv blærekreft (HG-NMIBC) er en klinisk viktig sub-type blære overgangsordning celle carcinoma (TCC), sto for 10-15% av alle TCC på presentasjonen [1] sikret uforutsigbare natur HG-NMIBC med hensyn til tilbakefall og progresjon til invasiv eller metastatisk sykdom, presenterer mange utfordringer for vellykket ledelse. Med ingen robuste metoder for å forutsi utfall (gjentakelse, progresjon, Bacillus: Calmette-Guerin (BCG) svikt) ved førstegangsdiagnose, pasienter kan være under-behandlet med intravesikal behandling alene eller over-behandlet med umiddelbar cystektomi, både med tilskrives uheldige pasientutfall [2,3].
Flere studier har beskrevet betydningen av epigenetiske modifikasjoner i tumorgenesen, mest åpen som upassende DNA-metylering innenfor genpromoteren-assosiert CpG øyer, og /eller endringer som fører til histon hale modifikasjon ( s) [4,5] .Disse modifikasjoner innvirkning på genuttrykk og fremme tumorgenesen hovedsakelig ved å kneble av tumor-suppressor og /eller apoptotiske sti gener [5,6]. Slike epigenetiske-mediert genet Slå har blitt demonstrert i NMIBC og muskel-invasiv blærekreft (MIBC), og er rapportert å være assosiert med tumorresidiv, progresjon, invasjon og metastasering, men også tidlige hendelser i svulst utvikling som feltet -defect «fenomenet [7,8]. Nyere studier markere potensielle kliniske nytten av epigenetiske biomarkører i blærekreft, som beskriver svulst, blod og urin DNA metylering markører av, for eksempel, NMIBC tilbakefall eller cellegift-motstand i MIBC [9-11].
promoter tilhørende CpG Island metylering av
HOXA9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1 Hotell og
ZNF154
gener er hyppige funn i blærekreft. I disse tilfellene vises metylering i forbindelse med aggressive tumor-egenskaper, og uavhengig kan forutsi tilbakefall av sykdommen, progresjon, eller sykdomsspesifikke dødelighet (DSM) [9,12,13]. Men de fleste av disse rapportene undersøke heterogene kohorter, bestående hovedsakelig lav /middels grad NMIBC; høyverdig NMIBC ikke har vært ansett diskret for sykdom og /eller subtype bestemte epigenetiske modifikasjoner.
Vi vurderte en unik kohort av pasienter med HG-NMIBC for upassende promoter-forbundet CpG Island metylering ved første presentasjon og fjerning av den primære svulsten (e), med hensyn til kjente prospektivt innsamlede ettårige utfall av no-gjentakelse, gjentakelse og progresjon (til MIBC eller metastatisk sykdom), og i forhold til lav /middels grad NMIBC. Identifisere upassende metylering «ved diagnose «av HG-NMIBC tillates en foreløpig identifisering av nye og potensielt klinisk anvendelige prognostiske biomarkører.
Materialer og metoder
Menneskelig vevsprøver
Den primære tumor og normal blære vev som brukes ble levert av blærekreft Prognose Programme (BCPP, Nottingham forskningsetiske komité: 05 /Q2404 /173) [14], Universitetet i (nasjonale forskningsetiske Tjenesten Birmingham menneske biomaterialer Resource Centre (North West 5) : 09 /H1010 /75), og universitetssykehusene i Nord-Midlands NHS Trust (nasjonale forskningsetiske Tilbud (South Central-Oxford C): 12 /SC /0725). Alle prøver ble innhentet etter informert skriftlig samtykke og under godkjenning av relevante nasjonale etiske gjennomgang tavler (referansenummer nevnt ovenfor). Alle prøver ble bekreftet histologisk; gjenta trans-urethral reseksjon eller cystektomi ble utført, og /eller intravesikal terapi gitt, hvor foreslått av European Association of Urology retningslinjer [15]. Alle primære humane vev (tabell 1) ble lagret ved -80 ° C før nukleinsyre-ekstraksjon.
DNA ekstraksjon og bisulfitt modifikasjon
Genomisk DNA ble ekstrahert fra tumor- og kontroll vev ved hjelp av et standard fenol-kloroform-ekstraksjon prosedyre [16] og deretter bisulfit-modifisert som tidligere beskrevet [4]. Bisulfitt konvertering av DNA ble bekreftet i alle tilfeller av vellykket PCR bruke primere spesifikke for bisulfitt-konvertert DNA (primer sekvenser som er gitt i støtte informasjon S1 tabell). For å øke den relative mengden og stabiliteten av bisulfit-konvertert DNA, ble hel-genom-amplifikasjon (WGA) utført som tidligere beskrevet [4] (beskrevet ytterligere i støtteinformasjon S1 tekst).
pyrosekvensering av bisulfitt-konverterte DNA
CpG island sekvenser ble identifisert fra UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/), og importert til PyroMark analyse design 2.0 Programvare for primer design (Qiagen, Manchester, UK). Avhengig av frekvens og tetthet av CpG dinukleotider i sekvensen av interesse, utformet primere omfattet 4-7 påfølgende CPGs i hvert gen (primer sekvenser i S1 tabell og detaljer om genomisk plassering i S2 tabell). Etter PCR amplifikasjon av målsekvensen, ble pyrosekvensering utført ved hjelp av en PyroMark Q24 Pyrosequencer hjelp PyroMark Q24 Software 2.0 og PyroMark Gold Q24 Reagenser (Qiagen), som tidligere beskrevet [17] (S1 tekst).
Metylering var strengt definert i tumorer som omfatter et midlere nivå av metylering på tvers av CPGs undersøkelsen på mer enn fire standardavvik (4SD) over gjennomsnittet i normale kontroller [4]. Antallet svulster metylert (etter denne definisjonen) for et gitt gen beskriver
frekvens
av metylering, mens den gjennomsnittlige prosent metylering av alle CPGs undersøkelsen beskriver
bety nivå
av metylering for en svulst i en hvilken som helst bestemt gen.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra kontroll- og tumorprøver ved bruk av en standard guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-protokollen [16], og komplementært DNA syntetisert som beskrevet tidligere [18] .Thermal sykling ved hjelp av SYBR (III) Grønn ble som tidligere beskrevet [19], med målgener normalisert til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) (S1 tabell) som endogent kontroll (S1 Tekst). Relativ kvantifisering av transkript-ekspresjon ble utført ved anvendelse av to
-ΔΔ syklus terskel (CT) metoden [20]. Redusert transkripsjon uttrykk i hver svulst ble ansett vesentlig dersom lavere enn en 3-fold reduksjon i forhold til å bety uttrykk i kontrollprøver; det motsatte var tilfelle for økt transkripsjon uttrykk [18] (S1 tekst).
Informatikk og statistikk
Microsoft Excel 2010 og Stata (v8, Stata Corporation, Texas) ble brukt til å utføre Fishers eksakte , Studentenes t, og log-rank-analyser, og sensitivitet, spesifisitet og positiv og negativ prediktiv verdi av metylering med hensyn til kliniske resultater.
Resultater
Frekvens av metylering i lav /middels – og høyverdig NMIBC
Vi i utgangspunktet bestemt metylering status for de seks kandidatgener i høy- og lav /middels grad av tumor kohorter av Pyrosequence analyser av bisulfitt-konverterte DNA. Upassende metylering av promoter-assosiert CpG øyer (S2 tabell) var en hyppig funn i begge kohorter for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1 Hotell og
ZNF154
gener, i forhold til normal blære (tabell 2).
Tabell 2 viser at metylering frekvensen i lav /middels grad av svulster var lavere for
ISL1
enn for alle andre gener undersøkt (2/12 svulster, 16,7%), men til sammenligning økt metylering frekvens innen HG tumorer (17/36; 45,0%,
p
= 0,091). Motsatt, hyppigheten av metylering var lavere i HG-NMIBCs for
HOXA9 plakater (20/36; 55,6%) sammenlignet med lav /middels grad av tumorer (10/12; 83,3%,
p
= 0,167); (Data oppsummert i tabell 2).
For ytterligere å undersøke mulige årsaker til de observerte forskjellene i hyppigheten av metylering mellom høy- og lav /middels grad av tumor kohorter for spesifikke gener, bestemt vi gen-spesifikke metylering frekvenser i forhold til de kliniske kjennetegn ved HG svulster, som omfatter ett års kliniske utfall av no-gjentakelse, gjentakelse, og progresjon.
for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1 Hotell og
ZNF154
, metylering frekvenser i tilbakefall og progresjon svulster var marginalt større enn sine ikke-tilbakefall kolleger, og var samlet stort sett lik frekvensene tilsynelatende i lav /middels-klasse svulster (fig 1).
fra venstre til høyre, tumor kohort metylering frekvens /andel, som bestemmes av pyrosekvensering innen
HOXA9
,
ISL1
,
SPAG6
,
NKX6-2
,
ZIC1 Hotell og
ZNF154
, for lav /middels grad kohort (LG), ingen tilbakefall (nR) og tilbakefall og progresjon svulster henholdsvis (R + P). De fylte søylene representerer andelen av metylert tumorer i forhold til kontrollene i hvert enkelt tilfelle. Forskjeller mellom frekvensene av metylering er angitt som statistisk signifikant ved «*», der
p
0,05 som bestemmes av Fishers eksakte eller Chi-squared tester (to-halet). Metylering ble definert som beskrevet i materialer og metoder.
HOXA9
viste en tilsvarende økt metylering frekvens i tilbakefall og progresjon svulster i forhold til sine ikke-tilbakefall kolleger, men som vist i figur 1, metylering frekvens i nei-tilbakefall svulster var betydelig lavere enn det som ble observert i lav /middels grad av svulster (
p
= 0,036). Selv om utviklingen av en økning i metylering frekvens i tilbakefall og progresjon (i forhold til ingen gjentakelse) svulster var tydelig for alle gener undersøkt, dette var tydelig mer markert for
ISL1
genet. I dette tilfellet, metylering frekvens var signifikant større i tilbakefall og progresjon tumorer i forhold til ikke-tilbakefall (15/25 (60,0%)
vs
2/11 (18,2%),
p =
0,031), og også deres lave /middels grad av kolleger (15/25 (60,0%)
vs
2/12 (16,7%),
p
= 0,017) (fig 1) .
Mean metylering nivåer i lav /mellomliggende gruppe og høyverdig NMIBC
Vår metylering analyser viste også betydelige forskjeller i, og mellom, var gjennomsnittlig og omfanget av metylering nivåer innenfor enkelte svulster (fig 2). Derfor, i tillegg til de analysene som er beskrevet ovenfor, kan vi også vurdert gjennomsnitts metylering nivåer i HG og lav /middels grad kohorter og innenfor HG kreft sub-typer, for å avgjøre om nivået av metylering viste noen sammenheng med kliniske kjennetegn.
paneler (a) til (f) som representerer
HOXA9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1 Hotell og henholdsvis
ZNF154
,. Hvert panel viser enkelte kreft metylering verdier, som bestemmes av pyrosekvensering, representert ved grå sirkler innenfor kontroll (c), lav /middels grad (LG), ingen tilbakefall (NR) og tilbakefall og progresjon (R + P) tumor gruppene. De solide horisontale søylene representerer den samlede gjennomsnitts metylering innenfor hver kontroll eller svulst gruppe; forskjeller mellom midlene er angitt som statistisk signifikant ved «*», der
p
0,05 bestemmes av Studenter-t testing. Den tohodet pil representerer cut-off punkt over hvilke svulster er definert som metylert i forhold til normal blærekontroll.
Det gjennomsnittlige nivået av metylering var større, om enn ikke signifikant, i HG i forhold til deres lav /middels grad kolleger for
ISL1
,
SPAG6
,
NKX6-2
,
og ZNF154
gener (tabell 2). Denne økningen nærmet betydning for
ISL1 plakater (22,1% vs 36,5%,
p
= 0,061). Paradoksalt nok, var gjennomsnittlig nivå av metylering for
HOXA9
var lavere i HG forhold til sine lav /middels grad av kolleger, igjen nærmer betydning (29,3% vs 44,0%,
p
= 0,057) ( Tabell 2).
Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi også bestemt gen-spesifikke metylering nivåer i HG svulster og i forhold til deres kliniske utfall. Mean metylering nivåer i
ISL1 Hotell og
HOXA9
var signifikant høyere i tilbakefall og progresjon svulster i forhold til sine ikke-tilbakefall kolleger (43,3% vs. 20,9%,
p
= 0,016 og 34,5% vs. 17,6%,
p
= 0,017, henholdsvis) (figur 2). Gjennomsnittlig metylering nivå økning fra nei-tilbakefall til tilbakefall og progresjon svulster var ikke signifikant for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1 Hotell og
ZNF154
korrelasjonen av metylering innen kliniske resultater av høy klasse NMIBC
neste fastsatte sammenhengen mellom gen-spesifikke metylering med kliniske resultater innenfor HG svulst kohort.;
HOXA9 Hotell og
ISL1
ble vurdert som den eneste genene som viste en signifikant forskjell i hyppigheten eller graden av metylering.
HOXA9
arrangøren metylering viste 72,7% spesifisitet og en 84,2% positiv prediktiv verdi (PPV) for svulst tilbakefall og /eller progresjon innen ett år etter første diagnose, mens metylering i
ISL1
promoter demonstrert spesifisitet på 81,8% og PPV 87,5% for de samme kliniske resultater, vist i tabell 3. Videre samtidig metylering av
HOXA9 Hotell og
ISL1
ved førstegangsdiagnose spådd ett års tilbakefall og /eller progresjon, med en PPV på 91,7%, mens det opprettholdes en spesifisitet på 90,9%. For å vurdere sammenhengen mellom disse potensielle biomarkører og sykdom utfallet mer grundig, ansatt vi logistisk regresjonsanalyse. Tabell 3 viser at når vurdert individuelt, metylering av enten
HOXA9
eller
ISL1
oppnådd statistisk signifikans med tumorresidiv og /eller progresjon (
p
= 0,050 og
p
= 0,047 henholdsvis). Imidlertid, i kombinasjon, mens biomarkører var mindre signifikant assosiert med sykdomsforløp (
p
= 0,067), viste de en sterkere odds-ratio av tumor tilbakefall og /eller progresjon enn når enten ble vurdert separat (7,86 vs 4,74 og 5,73, henholdsvis)
i tillegg til tumor atferd vi også regnet promoter metylering som en prediktor for sykdomsspesifikke dødelighet. i dette tilfellet,
HOXA9
arrangøren metylering viste 57,1% spesifisitet og 70,6% negativ prediktiv verdi (NPV) for sykdomsspesifikk dødelighet, mens
ISL1
metylering foreslått 57,1% og 60,0% for disse utfallsmål.
metylering assosierte forandringer i genuttrykk i høy grad NMIBC
Kvantitativ RT-PCR ble brukt til å evaluere sammenhenger mellom metylering og genuttrykk i fire av de seks gener innenfor et sub-sett av 10-14 svulster, sammenlignet med kontroller. Figur 3 viser at, sammenlignet med kontrollene, 90,1% (29 av 32) metylerte tumorer vise redusert transkripsjon uttrykk, og 75,0% (24 av 32) viser betydelig redusert ekspresjon. Omvendt, viste 56,3% (9 av 16) unmethylated svulster uttrykk nivåer tilsvarende, eller i noen tilfeller høyere enn det tydelig i kontrollene.
Kvantitativ RT-PCR analyser av
HOXA9
,
ISL1
,
SPAG6 Hotell og
ZNF154
transkripsjon uttrykk i enkelt høyverdig svulster (Hg). Ekspresjon er rapportert i forhold til gjennomsnittet av tre normale blære kontroller (C, trekanter), hvor middelverdien er uttrykt som lik 100%. Fylte og ufylte sirkler betegner metyl- eller unmethylated tumorer, og representerer gjennomsnittsverdien fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. De horisontale barer innenfor regulerings kolonnen representerer gjennomsnittet av kontrollene, en 3-fold reduksjon under dette ligger det tohodet pil i hvert gen tomten, som representerer den cut-off for betydelig redusert uttrykk i svulster i forhold til kontrollene.
Diskusjoner
epigenomic landskapet av blærekreft er et område med økende forskningsinteresse [21], spesielt i forhold til å identifisere klinisk levedyktige biomarkører. På grunn av dagens begrensninger i å forutsi de ulike kliniske resultater observert i HG-NMIBC, og den nåværende BCG mangel, biomarkører som styrer kliniske avgjørelser er av særlig betydning [22,23]. Som beskrevet ovenfor, våre analyser avslørte hyppig, og i noen tilfeller differensial metylering, som finnes ved første HG-NMIBC diagnose, som syntes å korrelere med tumor egenskaper og kliniske parametere.
De seks genene er valgt for analysene er overveiende medlemmer av transkripsjonsfaktor familier, primært regulerer gen-ekspresjon, enzym-binding, og celledifferensiering [24]. Deres valg for analysene var på grunnlag av deres hyppige upassende metylering i blærekreft [9,12,13,25]. I tidligere rapporter,
HOXA9 Hotell og
ZNF154
metylering har vært forbundet med svulst tilbakefall, og
ISL1
metylering med tumorprogresjon hos overveiende lav /middels grad av svulster [9, 13].
Vår første analyser viste lignende metylering frekvenser i lav /mellomliggende gruppe og HG-NMIBC for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
og
ZNF154
. I disse tilfellene metylering frekvenser som var lik de som tidligere er rapportert i litteraturen [9,12,13,25]. Men en forskjell i hyppigheten av metylering var tydelig mellom de lave /mellomliggende-og HG-NMIBC kohorter for
HOXA9 Hotell og
ISL1
gener: selv om metylering frekvensen til
HOXA9
promoter i lav /middels grad av svulster var lik som tidligere beskrevet i litteraturen [12,13], ble det funnet på markert lavere frekvens i HG-NMIBC. Omvendt, for
ISL1
, metylering frekvens i lav /middels grad av svulster var lavere enn tidligere beskrevet av andre [13]; imidlertid metylering frekvensøkningen som er tydelig i tilbakefall og progresjon svulster er mer i samsvar med disse rapportene.
differensial metylering frekvens i
HOXA9 Hotell og
ISL1
kan relatere til flere confounders, herunder fremgangsmåten i denne undersøkelsen anvendes for å definere tumor metylering, og de relativt få lav /middels grad av tumorer med henblikk på analyse. Men det samsvar mellom våre metylering data og de som er rapportert av andre for
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1 Hotell og
ZNF154
, bekrefter robusthet i vår tilnærming. På bakgrunn av dette, begrunnet vi at forskjellene i metylering frekvens observert for
HOXA9 Hotell og
ISL1
kan være påfølgende til ulike kliniske egenskaper og /eller utfall innenfor vår HG svulst kohort; et fenomen på samme måte som er beskrevet i, for eksempel, bryst, tykktarm og hypofysesvulster [4,26,27]. Vi utførte derfor HG-NMIBC sub-type analyser og fant at metylering profiler av tilbakefall og progresjon svulster, men ligner på hverandre, var for det meste ganske forskjellig fra sine nei-tilbakefall kolleger; på dette grunnlaget vi gruppert tilbakefall og progresjon svulster for analyser
metylering frekvens i tilbakefall og progresjon svulster var gjennomgående høyere på tvers av alle seks gener i forhold til sine ikke-tilbakefall kolleger.; disse forskjellene var mest uttalt for
HOXA9 Hotell og
ISL1 Hotell og oppnådde statistisk signifikans for
ISL1
. Paradoksalt nok, i
HOXA9
, ingen tilbakefall, tilbakefall og progresjon svulster var sjeldnere metylert enn i sine lav /middels grad av tumor kolleger. Selv om årsakene til dette er uklar, kan mulige forklaringer knyttet til nummeret, eller heterogenitet, svulster undersøkt, selv om vi ikke kan utelukke at det er epigenetiske forskjeller i bestemte gener mellom lav /mellomliggende gruppe og høyverdig svulster. Omvendt, metylering frekvens i tilbakefall og progresjon svulster i
ISL1
var markert høyere enn i sine lav /middels grad av kolleger. Lignende forklaringer til de som er beskrevet for
HOXA9
kan forklare disse observasjonene.
Gjennom kvantitative Pyrosequence analyserer vi bestemt gjennomsnittlig metylering over flere CpG nettsteder som viser at, videre til metylering frekvensforskjeller, det eksisterer forskjeller i metylering nivåer mellom kreft kohorter for bestemte gener. Spesielt forskjeller i gjennomsnitts metylering nivåer mellom lav /mellomliggende gruppe og HG svulster, og også mellom ikke-gjentakelse, og deres tilbakefall og progresjon tumor kolleger, analogt til observasjoner rapportert av andre i brystkreft og tykktarmskreft undertyper [26,27 ]. For begge
HOXA9 Hotell og
ISL1
, var det en betydelig økning i gjennomsnittlig nivå av metylering i tilbakefall og progresjon svulster i forhold til sine ikke-tilbakefall kolleger.
observerte forskjeller i frekvens og metylering bety metylering nivå mellom disse klinisk divergerende undergrupper, antyder at frekvensen og /eller at nivået av metylering øker med tumor aggressivitet. Lignende trender har blitt rapportert i andre tumortyper [26,27], og dette antas å representere akkumulering av epigenetiske avvik over tid, i likhet med akkumulering av genetiske mutasjoner og genomiske ustabilitet åpenbare i løpet av tumorprogresjon [28].
Siden våre funn støtter tidligere sammenslutninger av
HOXA9 Hotell og
ISL1
metylering med tumor egenskaper og atferd [9,13], avgrenset vi potensielle kliniske korrelater til
HOXA9 Hotell og
ISL1
metylering, inkludert deres prognostisk potensial. I vår HG-NMIBC kohort,
HOXA9
eller
ISL1
metylering ved førstegangsdiagnose spådd pålitelig tumorresidiv eller progresjon innen ett år. I denne sammenheng, samtidig metylering av både
HOXA9 Hotell og
ISL1
forbedret positiv prediktiv verdi på 91,7%, sammenligner gunstig med andre postulerte biomarkører av tilbakevendende /progressiv sykdom i NMIBC [13,29] . Videre logistisk regresjon syntes å bekrefte at disse funnene var ikke påfølgende til metylering i et enkelt gen. Videre, og som tidligere beskrevet [9,13], samtidig metylering i
HOXA9 Hotell og
ISL1
var assosiert med DSM og redusert total overlevelse, men dette nådde ikke statistisk signifikans. I denne sammenheng, vi erkjenner at antall svulster tilgjengelig for etterforskning og i fravær av lignende rapporter, at de assosiasjoner vi rapporterer mellom upassende metylering og HG-NMIBC sykdom utfallet vil kreve validering i større, uavhengige kreft kohorter.
til slutt, for å avsløre potensielle funksjonelle relevansen av metylering innen høyverdig sykdom, vurdert vi forholdet mellom metylering og genekspresjon; på tvers av de fire genene studert, fant vi en sammenslutning av unormal metylering med redusert avskrift uttrykk, i samsvar med funn fra andre grupper [9,13]. Disse funnene var ikke signifikant, muligens relatert til antall svulster undersøkt, eller passasjer /sjåfør fenomen, hvorved epigenetiske merkene kan være til stede, men ikke forårsakende av endret genekspresjon [30].
Disse funnene er den første til å rapporten likheter og forskjeller i gen-forbundet metylering i HG-NMIBC forhold til lav /middels grad av svulster. Videre har vi vist at spesifikke metylering mønstre på første diagnosen forutsi ettårige HG-NMIBC kliniske utfall, og peker på spennende muligheter for metylering som en prognostisk biomarkør i dette klinisk uforutsigbar sykdom. Videre undersøkelser utnytte genom-wide array-analyser er nødvendig for å ytterligere karakter epigenetiske likheter og forskjeller mellom lav /middels og HG-NMIBC, og å avsløre biomarkører som kan tjene som terapeutiske mål eller veilede klinisk behandling, for eksempel timing, dose og lengde av BCG terapi, eller tidspunktet for cystektomi.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. . Primer bord
Liste over bisulfitt-konverterte PCR primere, pyrosekvensering (sekvensering) primere, og RT-qPCR primere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137003.s001 plakater (docx)
S2 Bord. CpG island informasjon
Tabell notering genomisk plasseringen av promoter-forbundet CpG island regioner vurderes for hver av de seks gener
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0137003.s002 plakater (docx)
S3 Table. . Rådatafilen
Excel-regneark som inneholder gjennomsnittsverdier for pyrosekvensering og RT-qPCR data
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137003.s003 plakater (XLSX)
S1 tekst. . supplerende materialer og metoder
Nærmere beskrivelse av primær vevsprøver, og nærmere beskrivelse av DNA-ekstraksjon, natriumbisulfitt-konvertering, pyrosekvensering, RNA ekstraksjon og RT-qPCR prosedyrer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137003. S004 product: (docx)
takk
Vi vil gjerne takke alle West Midlands Konsulent Urologer og deres enheter involvert med BCPP, samt BCPP forsknings sykepleiere og Margaret Grant, Deborah Bird, Jennifer Barnwell, Duncan Nekeman og Eline van Roekel.
