Abstract
høy celleoverflate GnRH-reseptor (GnRH-R) nivåer har vist seg å ha en stor påvirkning på graden av GnRH-agonist-mediert inhibering av tumorvekst. Muligheten av GnRH-agonist leuprorelin acetat (LA) for å indusere en post-transkripsjonell oppregulering av GnRH-R på plasmamembranen til androgen-sensitive (LNCaP) og ufølsomme (PC-3) prostatakreft (PCA) celler som har vært tidligere demonstrert ved Western blotting. Her utførte vi enkelt molekyl kraft spektroskopi ved hjelp Atomic Force Mikroskopi (AFM), som har vist seg å være et kraftig verktøy som åpner for gransking av levende celleoverflate biologiske funksjoner, som for eksempel så langt uklart GnRH agonist /reseptor interaksjon. Derfor, i hormon-ufølsomme PC-3-celler, karakterisert vi styrken på LA-reseptor-binding, og mengden og fordelingen av de funksjonelle reseptor-molekyler på celleoverflaten. Effekten av en lang og kontinuerlig behandling (opptil 30 dager) med agonist (10
-11 og 10
-6 M) på ble også undersøkt de samme parametrene. En GnRH-R økning ble observert, nådde den maksimale (~80%) etter 30 dagers behandling med den høyeste dose av LA (10
-6 M). Den analoge-induserte økning av GnRH-R ble også påvist ved Western blotting. I tillegg ble to forskjellige reseptor-bundet styrker detektert av AFM, noe som antyder eksistensen av to GnRH-R klasser. En homogen fordeling av uforpliktende hendelser har blitt funnet på ubehandlede og behandlede PC-3 celleoverflater. Den vedvarende høye reseptor nivåer på membran av disse levende celler kan garantere for vedlikehold av responsen til LA også i androgen-svarer PCa. Videre kan bestemmelse av ligand /reseptor bindingsstyrke belyse dårlig forstått ved LA /GnRH-R samhandling og /eller adresse strukturelle /kjemisk agonist optimaliseringene
Citation. Lama G, Papi M, Angelucci C, Maulucci G, Sica G, De Spirito M (2013) leuprorelinacetat langvarig effekt på GnRH reseptorer av prostata kreft celler: An Atomic Force Microscopy Studier av agonist /Receptor Interaksjon. PLoS ONE 8 (1): e52530. doi: 10,1371 /journal.pone.0052530
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 29 desember 2011; Godkjent: 19 november 2012; Publisert: 09.01.2013
Copyright: © 2013 Lama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Takeda Italia Farmaceutici SpA delvis støttet dette arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser. I 2010 Takeda Italia Farmaceutici SpA ga forfatterne en frivillig donasjon for å støtte forskning av deres Institute, ikke spesielt knyttet til dette arbeidet. Forfatterne indikerte navnet på selskapet i rettferdighet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH), en dekapeptid utskilt i et pulserende måte ved hypothalamus nevroner, styrer gonadotropin syntese og slipp ved å aktivere reseptorer (type i GnRH-R) uttrykt på fremre hypofyse celler. Den nedregulering og desensitivisering av disse Hypofysen reseptorer etter kontinuerlig administrering av GnRH agonistiske analoger representerer begrunnelsen for klinisk bruk av disse hormonene i behandling av hormonrelatert kreft siden det fører til kjønnshormoner undertrykkelse [1] – [3]. Oppdagelsen av GnRH /GnRH-R-ekspresjon i disse tumorene, så vel som i ikke-ondartede vev [4] – [7], er beskrevet muligheten for celler av extrapituitary vev til å bli direkte berørt av GnRH-analoger. Forskjellige studier demonstrerte den hemmende effekten av GnRH-agonister på veksten av forskjellige neoplasmer, inkludert prostata cancer (PCA) -celler [6], [8] – [14]. Ikke desto mindre, noen forfattere rapporterte at GnRH-agonister er ineffektive når de anvendes alene, mens motvirke eller til og med undertrykke hormon eller vekstfaktor-stimulert celleproliferasjon [15] – [19]. I tillegg viste de at disse forbindelser er i stand til å modulere PSA ekspresjon, så vel som ekspresjon av flere gener /proteiner som regulerer vekst og differensiering, apoptose eller celle /celle adhesjon [20] – [23]. Mer nylig, ble effekten av GnRH-agonistisk analog leuprorelin acetat (LA) på ekspresjon av GnRH-R undersøkt ved Western blotting i to humane PCA cellelinjer: androgen-følsomme, godt differensiert og lav invasive LNCaP-celler og androgen ufølsomme, dårlig differensierte og svært invasive PC-3 celler [24]. I disse to modellene, er analog ved både lave og høye konsentrasjoner effektiv i å indusere en post-transkripsjonell forbedring av reseptorekspresjon på plasmamembranen nivå, etter 4, 6 og 12 dager i en kontinuerlig behandling.
økningen i reseptoren tilgjengelighet på celleoverflaten kan være et aktuelt terapeutisk problem siden det er nødvendig med vedlikehold av responsen til agonisten terapi [25]. I tillegg kan det gi rom for utvikling av nye terapeutiske strategier, som er spesielt viktig for de tumorer som enten ikke reagerer eller utvikle resistens mot endokrin behandling. Faktisk, selv om det er sårt vanskelig å forutsi den PCa celle atferd
in vivo
, er det presumable at selv i hormon svarer PCa, kan agonisten administrering tilveiebringe et fordelaktig resultat også på grunn av den direkte virkning .
i den foreliggende papir, utførte vi enkelt molekyl kraft-spektroskopi ved hjelp av Atomic force Microscopy (AFM) med sikte på å karakterisere styrken på LA-reseptorbinding, og mengden og fordelingen av den funksjonelle reseptoren molekyler på androgen-svarer PC-tre celleoverflaten. Vi demonstrerte også effekten av en lang og kontinuerlig behandling med agonisten på de samme parametrene. AFM faktisk gjør det mulig for påvisning av dynamiske endringer i de mekaniske egenskapene til levende celleoverflate [26], [27], så vel som målinger i luft eller væske av ufargete og ubelagte biologiske prøver i kontrollerte omgivelser og i et nanoskala oppløsning [28] – [31], uten behovet for noen spesiell behandling som kan føre til celle ødeleggelse eller endring. Videre tilbyr enkelt molekyl kraft spektroskopi en unik mulighet til å oppdage molekylær anerkjennelse mellom individuelle ligander og reseptorer. Ettersom vedvarende høye reseptor nivåer ved plasmamembranen etter en forholdsvis lang og kontinuerlig behandling med GnRH-agonist kan forbedre effektiviteten av LA i androgen-svarer PCa, undersøkte vi effekten av agonisten ved lave og høye konsentrasjoner i PC-3-celler i inntil 30 dager. Spennende informasjon om så langt uklart GnRH agonist-reseptor interaksjon kan stamme fra studien av styrken der slik binding oppstår og ta strukturelle /kjemiske optimaliseringer av det analoge.
Materialer og metoder
Cell linjer og dyrkningsforhold
Den menneskelige hormon-insensitive PC-3 celler [32] var velvillig donert av Prof F. Labrie (Laval-universitetet, Quebec, Canada). Cellene ble rutinemessig dyrket på 25-cm
2 cellekulturflasker i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM, Euroclone SpA, Milan, Italia), supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS, Euroclone), antibiotika (100 IE /ml (penicillin, 100 ug /ml streptomycin, Euroclone), 10 mM Hepes-bufferoppløsning (Euroclone), 1 mM natrium piruvate (Euroclone) og 2 mM L-glutamin (Euroclone).
humane embryonale nyreceller HEK293 ) ikke uttrykker noe endogent GnRH-R ble vennlig levert av Prof RP Millar (Medical Research Council menneskelige Reproductive Sciences Unit, Dronningens Medical Research Institute, Edinburgh, UK), som fikk dem fra American Type Tissue Culture Collection. HEK293 celler stabilt transfektert med GnRH-R (HEK293
[SCL60]) var en gave fra professor R. P. Millar og ble generert i sitt laboratorium [33]. HEK293 og HEK293
[SCL60] celler ble anvendt som negativ og positiv kontroll for GnRH-R-ekspresjon, respektivt. Celler ble dyrket i DMEM, supplert med 10% FBS, antibiotika (100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin), 10 mM Hepes-bufferløsning, 1 mM natrium piruvate og 4 mM L-glutamin.
alle cellelinjer ble inkubert i en fuktet atmosfære av 5% CO
2-95% luft ved 37 ° C.
Cell-behandlinger
cellene ble sådd ut ved en tetthet på 25000 celler /ml standard dyrkingsmedium i 40-mm TPP retter (Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Sveits). Når de overholdt kulturplater (etter 24 timer), ble mediet fornyet med DMEM supplert med 5% trekull-behandlet FBS (CH-FBS) og 10
6 M eller 10
-11 M LA ( Vennligst donert av Takeda Pharmaceutical Company Limited, Osaka, Japan).
mediet ble skiftet hver 48 timer, mens LA ble lagt daglig til kulturer. PC-3-celler ble eksponert til det analoge for 6, 12, 18, 24 og 30 dager.
Hver seks dager, ble cellene trypsinert, sådd ut (25.000 celler /ml) i 40-mm TPP og retter , når de overholdt kulturplater, behandlet som beskrevet ovenfor for en ytterligere 6-dagers periode. Ved slutten av hver behandlingsperiode ble cellene analysert ved hjelp av AFM. I alle forsøkene ble kontrollkulturer kjørt i parallell.
Atomic Force Microscopy (AFM)
Alle målinger ble utført ved hjelp av en atommikroskop
Nanowizard II
( JPK Instruments, Berlin, Tyskland) kombinert med en optisk mikroskop
Axio Observer plakater (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Alle oppkjøpene ble oppfylt i en PBS løsning (pH = 7,4), under en kontrollert temperatur på 37 ° C.
AFM Probe Forberedelse
For å undersøke spesifikke interaksjoner mellom LA og GnRH- R på overflaten av PC-3-celler, ble de analoge molekyler immobilisert på AFM tips. Rektangulære myke silikonnitrid microcantilevers med Ultra koniske tips med en radius på ~ 10 nm belagt på begge sider med gull (CSC16, MicroMash, San Jose, California) og kalibrert som rapportert av Papi et al. [34] ble anvendt.
Forut for immobilisering, microcantilevers ble vasket i kloroform for å fjerne oljer og grove forurensninger og deretter eksponert i 20 minutter til en UV-ozon renset for å fjerne organiske og andre oksyderbare overflateforurensninger.
analoge molekylet immobilisering prosedyre, en hyppig benyttet metode for spiss funksjonalisering med et ligandmolekyl [35], baserer seg på bruk av en 8 nm lang fleksibel tverrbinder (pyridyl ditio-Polyethyleneglycol-succinimidylpropionate, PDP -PEG-NHS, Polypure). Den rene cantilever ble straks neddykket i en PDP-PEG-NHS /kloroform-løsning i 3 timer (linker konsentrasjon: 2 mg /ml), og deretter, etter to skyllingstrinn i kloroform og en i PBS, ble behandlet med en dråpe av LA-løsning ( 2 mg /ml) over natten.
Etter funksjonalisering, utkraginger ble grundig vasket tre ganger i buffer-løsning og deretter lagret ved 4 ° C under sterile betingelser for videre anvendelse i eksperimentene. Lagringstiden var alltid 1 uke. Noen vesentlig endring i LA /GnRH-R interaksjon ble observert i denne perioden. Før han ble brukt, ble våren konstant for hver cantilever kalibreres ved hjelp av termiske metoden [36].
Atomic Force spektroskopi
For å utforske enkle molekylære interaksjoner, dissosiasjon prosessen med en tips- bundet ligand fra en celleoverflate-bundet reseptor ble undersøkt ved påføring av en trekkraft til den ligand-reseptor-komplekset før bindingen mellom liganden og reseptoren blakk. Interaksjons krefter tip-bundet ligander og overflate immobilisert reseptorer ble målt i kraft fjern sykluser. I en fast posisjon, ble tuppen nærmet seg til celleoverflaten og deretter trukket tilbake etter et bestemt tidsintervall (0,5 s), mens bøyingen av braket ble observert. I løpet av denne syklusen, bøyningen av braket, som er proporsjonal med den kraft, ble kontinuerlig målt og plottet mot spiss-overflateseparasjon (dvs. avstand). To representative kraft-avstandskurver er gjengitt i fig. 1, når ligand /reseptor interaksjoner ikke er registrert (svart firkant), og når en ligand /reseptor interaksjon oppdages (røde sirkler). Ved begynnelsen av tupp-overflate måten holdes cantilever nedbøyning lik null. Ved spiss-overflatekontakt, bøyer cantilever oppover, i samsvar med en frastøtende kraft som øker med fordypningen. Etterfølgende tip-overflate tilbaketrekning (fig. 1) først fører til avslapping av braketbøye inntil frastøtende kraft synker til null. Ved ytterligere tilbaketrekning, dersom interaksjonen mellom liganden og reseptoren forekommer, cantilever bøyer seg progressivt nedover, noe som reflekterer en tiltrekningskraft som øker med økende spiss-overflate separasjon (fig. 1, røde sirkler). I hvert enkelt eksperiment, for hvert tidspunkt, ble ~1000 tvangs avstander kurver utført.
To typiske kraft fjern kurver når interaksjoner ikke er oppdaget (svart firkant), og når interaksjoner blir oppdaget (rød sirkel). Den uforpliktende hendelse (eller bruddstedet) er uthevet ved hjelp av den grønne pilen.
Western blot analyse
plasmamembran-beriket fraksjoner ble fremstilt fra 6-dagers kultivert PC-3 , HEK293 og HEK293
[SCL60] celler, i henhold til protokollen beskrevet av Limonta et al. [37]. Den samme fremgangsmåte ble anvendt på PC-3-celler ubehandlet eller behandlet med LA (10
6 M eller 10
-11 M) for 6, 12, 18, 24 og 30 dager. Prøvene ble homogenisert i 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) buffer inneholdende 1 mM ditiotreitol på is. Homogenatene ble sentrifugert to ganger i 10 minutter hver på 800
g
å fjerne cellerester og de resulterende supernatanter ble sentrifugert ved 18 000
g
til pellet ned membranfraksjoner. Pelletene ble oppløst i RIPA-buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,7), 150 mM NaCl, 0,8% Triton X-100, 0,8% natriumdeoksykolat, 0,08% SDS, 10 mM EDTA, 100 mM Na
3VO
4, 50 mM NaF, 0,3 mM PMSF og 5 mM jodeddiksyre]. Proteinprøver (100 ug /felt) ble underkastet elektroforese på en 10% polyakrylamidgel under reduserende betingelser. Proteiner ble deretter elektroblottet på en polyvinylidendifluorid-membran (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA, USA), som ble undersøkt (over natten, 4 ° C) med muse-monoklonalt anti-GnRH-R-antistoff (Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA) (1:100) i TBS inneholdende 0,02% Tween 20 (TBS-T) og 5% fettfri tørrmelk (blokkeringsbuffer). Blottet ble deretter overlagt med HRP-merket sekundært antistoff (Vector, Burlingame, CA, USA; 1:5,000) i 40 minutter i blokkeringsbuffer ved romtemperatur. Proteinbåndene ble påvist ved anvendelse av et forbedret kjemiluminescens system (ECL, Amersham, Buckinghamshire, UK) og visualisert på Hyperfilm ECL (Amersham). Membraner ble reprobed med en anti β-aktin mAb (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1:10,000) som en intern kontroll for protein lasting. Signalene ble kvantifisert ved densitometri (Chemi Doc Dokumentasjon System /Antall En kvantifisering programvare, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Densitometriske enheter av proteinet av interesse ble deretter korrigert for de densitometriske enheter av β-aktin. Den spesifikke protein /β-actin ratio fra hver behandlet prøve ble delt av det under kontroll forhold verdi for å oppnå ganger endring i GnRH-R nivå.
Statistisk analyse
Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest. En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
GnRH-R kvantifisering og bindende styrke i ubehandlede PC-3 celler
I Fig.. 2A en representativ fordeling av uforpliktende hendelser (~1000 kraft fjern sykluser i en mengde på 2 um /s) oppnådd på ubehandlede PC-3-celler etter 6 dager er vist. Den bimodal fordeling er karakterisert ved tilstedeværelsen av to, vel tydelige topper, hver gjenvinnes ved en gaussisk form. Den første topp (lilla linje) ble detektert ved en lavere kraft (f~37 pN), mens den andre (grønn linje) ved en høyere kraft (f~65 pN). Tilstedeværelsen av disse to toppene antyder eksistensen av to forskjellige interaksjoner. Fra bimodal fordeling, en samlet uforpliktende sannsynlighet (til dvs. sannsynligheten for opptak av en uforpliktende hendelse fra en enkelt kraft-avstand kurve) på ca. 13% ble oppnådd (fig. 2A, blå linje). Den bimodal fordeling sammen med uforpliktende sannsynlighet ikke endre for opptil 30 dager (data ikke vist).
Distribusjon av uforpliktende hendelser oppnådd ved en lasterate på 2 mikrometer /si ubehandlet (A) og LA ( 10
-6 M) -behandlet (B) PC-3 celler etter 30 dager med kultur og i HEK293
[SCL60] celler (C). Frekvens tilsvarer antall hendelser. I både ubehandlede og LA-behandlede PC-3-celler en bimodal fordeling (blå linje) er tydelig påvises og kvantifiseres ved hjelp av to Gaussiske fordelingskurver (purpur grønn og stiplede linjer). Den første toppen ble detektert ved en lavere kraft (f~37 pN), mens den andre ved en høyere kraft (f~65 pN). I HEK293
[SCL60] celler uforpliktende hendelser på høyere krefter er sjeldnere.
For å vurdere mengden av mulige uspesifikke uforpliktende hendelser som oppstår på grunn av den spesifikke tips funksjon prosedyre og følsomheten vår tilnærming, utførte vi de samme kraft spektroskopi eksperimenter på HEK293 og HEK293
[SCL60] celler. Som forventet i villtype HEK293 celler svært få tips /prøve interaksjoner ble funnet (~3%). Tvert imot, i den GnRH-R-uttrykkende HEK293
[SCL60] cells flere spiss /prøve interaksjoner ble påvist (~59%). Interessant, i disse cellene til bimodal fordeling av uforpliktende styrkene var ikke tydelig siden uforpliktende hendelser på høyere krefter (~65 PN) er klart mindre sannsynlig i forhold til de mer hyppige uforpliktende hendelser på lavere krefter ~37 PN (Fig. 2C).
GnRH-R kvantifisering og bindende kraft i behandlede PC-3 celler
En økning i agonist /GnRH-R uforpliktende hendelser ble observert i PC-3 celler i løpet av 30 dager etter eksponering for LA (10
6 M eller 10
-11 M) (fig. 3A). Forbedringen var påvisbare på alle tidsintervaller vurderes (fra 6
th til 30
th dagen; p 0,001) og den nådde den maksimale verdien av ~80% sammenlignet med kontroll etter 30 dagers behandling med den høyeste dose av den analoge. En statistisk signifikant forskjell ble alltid funnet i effekt utløst av de to medikamentkonsentrasjoner, med den høyeste dosen være mer effektive i å fremme økningen.
(A) histogrammer av LA /GnRH-R uforpliktende hendelser i LA behandlede PC-3 celler. I hver måling, utføres hver 6. dag, tellingen er normalisert til det som ble oppnådd med ubehandlede celler (kontroll) satt til 1. kolonner, bety; barer, SD. * P 0,001
vs
kontroll,
• p 0,001
vs
10
-6 M LA (enveis ANOVA og Tukey er flere sammenligningstester). (B) Modellering av GnRH-R hastighet uttrykk. Mengden av uforpliktende hendelser detektert i PC-3-celler behandlet med 10
-6 M LA (blå diamanter) eller 10
-11 M LA (red firkanter) ble normalisert til mengden av uforpliktende hendelser i ubehandlede celler ( kontroll) satt til 1. Gompertz kurve ble tilpasset til både de eksperimentelle data (blått eller rødt stiplede linjer). De GnRH-R øke prisene var helt klart annerledes [(9,3 ± 0,1) dagen
-1 for 10
-6 M LA og (6,1 ± 0,1) dagen
-1 for 10
-11 M LA] men tendens til samme verdi (1,9 ± 0,1) ved lange tider (utover 30
th dag). Data er gitt som gjennomsnitt ± SD fra to uavhengige forsøk.
Det samme bimodal fordeling (med en hakke på f~37 pN og en annen på f~65 PN) påvist hos ubehandlede PC-3 celler var observert i LA-behandlede celler over tid (fra 6
th til 30
th dag), uavhengig behandling administrert til cellene. På fig. 2B, en representativ fordeling av uforpliktende hendelsene som oppnås ved en hastighet på 2 um /s i PC-3-celler behandlet i 30 dager med 10
-6 M LA er illustrert. Den blå kurven viser bimodal fordeling av de uforpliktende hendelser og en samlet uforpliktende sannsynlighet på ca 22%.
Modellering av GnRH-R rente uttrykk på PC-3 celler
For å belyse den spesifikke dynamiske beskriver økningen i de eksponerte reseptorer, sammenlignet vi forskjellig mengde av reseptorer som oppnås i løpet av behandlingstiden på de to analoge anvendte konsentrasjoner (fig. 3B). Økningen prisene var helt klart annerledes, men hadde en tendens til samme verdi på lange tider (utover 30
th dag). kan parallellkobles Denne atferden til de som ble observert i tumorceller hvor deres vekst er begrenset av den begrensede plassen i hvilke celler er begrenset og av tilgjengeligheten av næringsstoffer, som modellert av Gompertz kurve [38]: hvor X (t) representerer antall av GnRH-R, X (0) reseptoren tall ved start observasjonstid (her normalisert til en), K maksimalt antall reseptorer som kan uttrykkes på celleoverflaten og a en konstant som karakteriserer økningen frekvensen av GnRH-R .
3B viser best tilpasning kurvene til de eksperimentelle data innhentet for PC-3 celler eksponert for 10
-6 M (rød linje) eller 10
-11 M (blå linje) LA. I begge tilfeller er det bemerkelsesverdig kvalitet av passformen muliggjør gjenvinning av reseptoren inkrement sats og platåverdier. Platået verdi (K = 1,9 ± 0,1) var den samme på begge LA benyttede konsentrasjoner. Siden K ble satt til en for ubehandlede prøver, platåverdi som oppnås viser at i LA-behandlede PC-3-celler reseptoren tall kan øke opp til 90% sammenlignet med ubehandlede celler, uavhengig av den agonist-konsentrasjon som brukes. På den annen side ble økningen hastigheten sterkt påvirket av LA-konsentrasjon [α = (9,3 ± 0,1) dag
-1 til 10
-6 M LA og α = (6,1 ± 0,1) dag
– 1 til 10
-11 M LA], og dermed jo høyere konsentrasjon jo raskere GnRH-R-ekspresjon.
topografiske fordelingen av bindingssetene
A todimensjonale kart over uforpliktende arrangementer utført over celleoverflaten forsyner en klar visualisering av GnRH-R romlige fordeling (fig. 4). Uforpliktende hendelser som opptrer med kraft 50 pN (. Som svarer til den første toppen av den bimodale fordelingen i figur 2A) er representert i blått, mens de i området 50-100 pN (tilsvarende den andre topp i figur 2A). i rødt. Den romlige fordeling av GnRH-R over PC-3 celleoverflaten vises homogen. Behandlinger med agonisten ikke påvirker den romlige fordeling reseptoren (fig. 5), så vel som den tidsintervaller, men økte reseptornivået. Sjelden var noen klynger funnet (data ikke vist).
(A) En representant høyoppløselig bilde av PC-tre celleoverflate regnes for reseptoren kartlegging. (B) En representant LA /GnRH-R uforpliktende kraft kart innhentet på PC-3 celler behandlet i 30 dager med 10
-6 M LA. I blå er representert uforpliktende hendelser skjer på kraft 50 pN mens i rødt de på kraft i størrelsesorden 50-100 pN
homogen fordeling av reseptormolekylene ble ikke påvirket av behandlingen. med den analoge (10
-6 M) og påvirkes gjennom tidsintervaller. I blå er representert uforpliktende hendelser skjer på kraft 50 pN mens i rødt de på kraft i størrelsesorden 50-100 pN
GnRH-R kvantifisering av Western blot analyse
Western blot-analyse av GnRH-R-uttrykkende celler (HEK293
[SCL60]) viste en tydelig bånd ved tilnærmet 60 kDa, den molekylære massen av type i-reseptor hypofysen rapportert i litteraturen [39]. PC-3-celler viste et mindre intenst bånd ved den samme posisjon. En ubetydelig signal ble påvist i ikke-transfektert HEK293 celler (figur 6A.)
(A) Western blot analyse av GnRH-R i. PC-3 celler, HEK293 celler (ikke uttrykker GnRH-R) og HEK293
[SCL60] celler (stabilt transfektert med GnRH-R) etter 6 dager med kultur. (B) Western blot viser LA-utløst forbedring av GnRH-R i PC-3 celler behandlet for 6-30 dager med den analoge (10
-11 eller 10
-6 M). Representative blot fra to separate forsøk som ga tilsvarende resultater er vist. (C) Gruppert densitometriske data for Western blot-analyse av GnRH-R. Intensiteten av de signaler som ble kvantifisert ved densitometrisk skanning og normalisert til den for β-aktin (anvendt som en lasting kontroll). Dataene er forholdet mellom verdiene av behandlede og ubehandlede prøver (kontroll, satt til 1), og de er vist som gjennomsnitt ± SD av 2 uavhengige eksperimenter. * P 0,001
vs
kontroll,
• p. 0,001
vs
10
-6 M LA (enveis ANOVA og Tukey er flere sammenligningstester)
i PC-3 celler, en 6-30 dagers behandling med både LA konsentrasjoner (10
-11 og 10
-6 M) induserte en statistisk signifikant økning (fra 70% til 110 %, p 0,001) i reseptor nivåer (fig 6B og 6C), som støtter data fra atomic force spektroskopi.. Selv om den høyeste LA dose syntes å være mer effektive i å fremme GnRH-R økning, ble statistisk signifikans ikke alltid nådd (Fig. 6C).
Diskusjoner
De direkte extrapituitary effekten av GnRH-analoger kan betraktes som resultatet av en kompleks mosaikk av molekylære hendelser som er nødvendigvis avhengig av mengden av GnRH-R-molekyler er tilgjengelig på celleoverflaten og det aktiverte signalveien, som begge varierer blant vev [4], [40].
Knappe informasjon er tilgjengelig på effekten av GnRH analoger på GnRH-R. De fleste av de publiserte studier på effekten av GnRH-agonister på GnRH-R uttrykk har blitt utført på
in vitro Hotell og
in vivo
hypofysen modeller. I disse studiene, de observerte effekten syntes å være strengt avhengig av administrasjonsformen, hvor et kort eller pulserende eksponering for agonisten førte til en oppregulering av reseptor-nivåene, mens en kontinuerlig og forlenget behandling bestemmes en reduksjon eller venstre dem uforandret [41] – [43]. I PCA har svært heterogene resultater er rapportert. En immunhistokjemisk undersøkelse er beskrevet en GnRH-R reduksjon i PCA prøver fra pasienter som gjennomgikk en tre-måneders lange neoadjuvant hormonbehandling med leuprolid og antiandrogen bikalutamid, sammenlignet med immunreaktivitet observert i prøver fra ubehandlede pasienter [44]. Dette funnet ble tilskrevet av forfatterne til binding av det analoge til PCA-celler. Også i DU-145 xenopodet PCas, en agonist-induserte svak nedgang i GnRH-R-nivåer ble beskrevet, mens ingen signifikante forskjeller ble observert i de reseptor-mRNA-nivåer [45]. Lignende resultater ble oppnådd når PCA-celler og fibroblaster, isolert fra pasientprøver, ble cocultured og utsatt for leuprolid [46]. På den annen side ble en sterk økning i GnRH-R mRNA som er beskrevet i rotte prostata etter 28 dagers behandling med goserelin [43]. I denne sammenheng ble det observert ved Western-blotting som LA var i stand til å indusere en post-transkripsjonell oppregulering av membran GnRH-R etter 4, 6 og 12 dager etter behandling i androgen-insensitive, meget inngripende og dårlig differensiert PC-3-celler [24 ].
med mål om å få innsikt i de funksjonelle egenskaper av GnRH-R eksponert på celleoverflaten, og derfor aktivt involvert i agonist-reseptor signalisering, en AFM basert tilnærming på levende PC-3 celler var tatt i bruk for første gang i foreliggende studie. Effektene av en lang og kontinuerlig behandling med LA på viktige aspekter av membranen GnRH-R (dvs. mengden av de uforpliktende hendelser, styrke på analog-reseptor binding og reseptor distribusjon) ble undersøkt.
Ved å registrere mengden og styrken av interaksjonen, demonstrerte vi muligheten av hormonet for å øke ekspresjonen /tilgjengeligheten av GnRH-R på PC-3-celle-overflate, da administreres kontinuerlig til cellene, med en maksimal økning av ~80% etter 30 dagers behandling med den høyeste dose av LA.
i denne sammenheng har vi også studerte kinetikken av GnRH-R eksponering i PC-3-celler behandlet med høye og lave konsentrasjoner agonist. Kinetics ble analysert ved montering av Gompertz kurve, et logistisk kurve allment vedtatt å beskrive befolkningsøkningen i flere biologiske systemer. Den Gompertz kurve gjenvinner riktig tidsavhengig økning av den GnRH-R på celleoverflaten. Ifølge denne modellen, frekvensen av ekspresjon av GnRH-R i LA-behandlede celler er avhengig av agonist-konsentrasjonen som anvendes, mens den asymptotiske verdi er uavhengig av LA-konsentrasjonen og relatert til de spesifikke cellekarakteristikker og eksperimentell tilstand anvendt. Dette beviser, mens klart å etablere forekomsten av en LA-utløst langvarig oppregulering av sin egen reseptor på celleoverflaten, gjør det mulig for påvisning av den maksimale mengden av reseptorer at cellen kan uttrykke. Sistnevnte funn gjør at finjustering av dosen /effekt-forhold ved å endre LA konsentrasjon. I samsvar med de ovenfor angitte resultater er data fra immunoblotanalyse av membran GnRH-R utført på PC-3-celler behandlet i 6-30 dager med det analoge, som klart viste LA effekt i å indusere en betydelig oppregulering av reseptoren, som tidligere har demonstrert av den samme teknikk inntil 12 dager med behandling [24]. Western blot resultatene er enig med AFM-data som den høyeste dosen LA syntes å være mer effektive i å fremme GnRH-R øker, selv om statistisk signifikans ikke alltid ble nådd. Dette kan være på grunn av de iboende forskjeller mellom de to metodene.
Når det gjelder de mekanismer som er ansvarlig for den analoge-indusert reseptor forbedring, forskjellige funksjonelle parametre kan være involvert i bestemmelse av mengden av reseptorer er tilgjengelige på plasmamembranen. Vår tidligere studie om LA-indusert oppregulering av GnRH-R på PC-tre celleoverflaten vist at en slik effekt skjedde på en post-transcriptional nivå [24]. Således er det tenkelig at den agonist kan opptre øke oversettelse hastigheten av reseptoren transkripsjon og /eller bremse proteinnedbrytingen. På grunnlag av litteraturen, er det også mulig å spekulere i at en av de involverte mekanismer kan være representert ved agonist evne til å fremme den GnRH-R-utgang fra det endoplasmatiske retikulum (ER) derfor favorisere reseptoren anterohandelen, innenfor intracellulær transport vesikler til plasmamembranen. Dette ville være i overensstemmelse med den observasjon at andre syv transmembrane (7TM) reseptorer, for eksempel S-opioid peptid reseptorer, som er mye lagret i ER, blir sendt til celleoverflaten som respons på aktivering av en liten subpopulasjon av membranreseptorer [47 ]. Siden 7TM reseptorer også gjennomgå retrograd transport fra celleoverflaten via endosomer, er et alternativ mulig forklaring som GnRH-R-aktivering kan hemme reseptoren internalisering, som for type I pattedyr-GnRH-R er kjent for å forekomme meget langsomt [48].
