Abstract
Det har lenge vært akseptert at immunglobuliner (IGS) ble produsert av B lymfoide celler bare. Nylig Ig har blitt funnet å bli uttrykt i forskjellige humane kreftceller og fremme tumorvekst. Rekombinasjon aktivering av gen 1 (RAG1) og RAG2, som er viktige enzymer for igangsetting av variabel-diversitet-sammenføyning segment rekombinasjon, har også blitt funnet å bli uttrykt i cancerceller. Imidlertid er mekanismen av RAG-aktivering i disse kreftceller ikke er klarlagt. Her, undersøkte vi reguleringsmekanisme av RAG-ekspresjon i fire humane kreftcellelinjer ved å analysere transkripsjonsfaktorer som induserer RAG aktivering i B-celler. Ved RT-PCR, Western blot og immunfluorescens, fant vi at transkripsjon faktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 ble uttrykt og lokalisert til kjernen av disse kreftcellene. Over-uttrykk for E2A, FOXO1 eller Foxp1 økt RAG uttrykk, mens RNA interferens fra E2A, FOXO1 eller FOXP1 redusert RAG uttrykk i kreftcellene. Kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter viste acetylering av RAG forsterker (Erag) og E2A, FOXO1 eller FOXP1 ble bundet til Erag in vivo. Disse resultatene indikerer at disse kreftceller transkripsjonsfaktorene E2A, FOXO1 og FOXP1 regulere RAG uttrykk, som initierer Ig-genet omleiring mye på den måte som ligner på B-lymfocytter
relasjon:. Chen Z, Xiao Y, Zhang J Li J, Liu Y, Zhao Y, et al. (2011) transkripsjonsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 Regulering rekombinasjon aktivere disse i kreftceller. PLoS ONE 6 (5): e20475. doi: 10,1371 /journal.pone.0020475
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 21 mars 2011; Godkjent: 26 april 2011; Publisert: 31. mai 2011
Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd (81001199 til ZC, 81030033, 30971150 til JG, 30950110335 til KC) fra Natural Science Foundation of China National, og gi LYM10079 til ZC fra Innovative Talenter Program for Guangdong Høyskoler og universiteter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det har lenge vært akseptert at immunglobuliner (IGS) bare kan uttrykkes i modne B-lymfocytter og plasmaceller. Imidlertid har nylig flere grupper rapportert at Ig kan også fremstilles ved ikke-lymfoidlinjen celler [1], inkludert humane kreftceller [2], [3], myke vev tumorceller [4], neuroner og gliaceller i sentral og perifere nervesystemet [5], okulær epitelceller og ganglion celler [6], mus testikkelspermatogenese celler og bitestiklenes epitelceller [7] og mus ammende brystkjerteltumorer epitelceller [8]. Det meste av forskningen har hittil fokusert på Ig-ekspresjon i kreftceller. Den Rekombinasjon aktiverende gen (RAG) har også blitt funnet uttrykt i cancerceller både på mRNA og proteinnivåer, og det antas å spille en betydelig rolle i syntesen av Ig av disse kreftceller [2], [3], [ ,,,0],9]. Men reguleringsmekanisme av RAG uttrykk i kreftceller er ennå ikke bestemt.
De variable regioner av Ig gener består av en variabel (V), en mangfold (D), og en sammenføyning (J) gensegment, anordningen av som resulterer fra V (D) J rekombinasjon [10]. RAG-endonuklease er nødvendig for initiering av spaltingen fase av V (D) J rekombinasjon [11]. RAG består av to tilstøtende gener, RAG1 og RAG2, som synergistisk induserer V (D) J rekombinasjon [12]. Tidligere studier har vist at mus som mangler enten RAG1 eller RAG2 unnlatt å initiere V (D) J-omleiring [13], [14]. RAG1 og RAG2 proteiner sammen ble funnet å være tilstrekkelig til å spalte rekombinasjon underlag i cellefrie systemer [15], [16]. I oppstår murine B-celle utvikling RAG uttrykk i to bølger og er regulert av et nettverk av transkripsjonsfaktorer, inkludert E2A, Ikaros, Pax5β, Foxo1, Foxp1, og NF-kB [17]. Den første bølgen resulterer i omleiring av den immunoglobulin tunge kjede i pro-B-celler. Og den andre bølgen av RAG ekspresjon fører til montering av immunoglobulin-lettkjede i pre-B-celler.
I tillegg til de RAG1 og RAG2 promotorer, har RAG-genet også andre regulatoriske elementer, slik som den proksimale enhancer (Ep), den distale forsterker (Ed) og RAG forsterker (Erag) [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Det er antatt at de nevnte transkripsjonsfaktorer regulere RAG-ekspresjon ved binding til deres korresponderende regulatoriske sekvenser i B-celler. Erag er den sterkeste enhancer regulerings RAG uttrykk. Målrettet delesjon av Erag i mus germline resulterte i en 5-fold til 10-fold reduksjon i RAG uttrykk og et delvis blokk på pro-B til pre-B-overgang [22]. E2A, Ikaros, Foxo1, Foxp1 og NF-kB ble alle vist å aktivere RAG-ekspresjon ved binding til Erag i murine B-celler [22], [23], [24], [25], [26]. Pax5β ble rapportert å aktivere RAG2 promoter i umodne B-celler [27]. Hvorvidt disse transkripsjonsfaktorer er også uttrykt i kreftceller, og om de har regulatoriske funksjoner i ekspresjonen av RAG i slike celler er verdig undersøkelse.
I denne studien vi først analysert på protein- og mRNA-uttrykk for de transkripsjon faktorer som har blitt funnet å være avgjørende for RAG aktivering i B-celler, inkludert E2A (E47 og E12), FOXO1, FOXP1, Ikaros, NF-kB, og PAX5β, i fire kreftcellelinjer. Vi deretter undersøkt for lokalisering av et antall av disse transkripsjonsfaktorer (E2A, FOXP1, NF-kB og FOXO1) ved immunofluorescens (IF). Vi fant at E2A, FOXO1 og FOXP1 ble uttrykt i kreftceller og lokalisert til kjerner av disse cellene. Over-ekspresjonen av disse tre transkripsjonsfaktorer betydelig økt RAG ekspresjon. Funksjonell inaktivering av gener av hvilken som helst av disse tre transkripsjonsfaktorer hos RNA-interferens reduseres RAG uttrykk. In vivo kromatin immunoprecipitation (chip) analyse viste at histon H3 av Erag ble acetylert og at E2A, ble FOXO1, FOXP1 bundet til Erag i disse kreftcellene. Disse resultatene indikerer at transkripsjon faktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 aktivere uttrykk for RAG, som er avgjørende for V (D) J rekombinasjon, i kreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Vi brukte ikke noen mennesker eller dyr vev i vår studie. Slik at vi ikke føler at etikk godkjenning var nødvendig.
Cell kultur
Den menneskelige lungekreft cellelinje A549, prostatakreft cellelinje PC3, brystkreft cellelinjer MCF-7, MDA- MB-231 og Burkitt lymfom cellelinjen Raji ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). A549, PC3, MCF-7 og MDA-MB-231-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% FBS (Hyclone /Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Raji-celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) med 10% FBS ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO2.
RNA-ekstrahering og RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra tumorcellene ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og ble behandlet med RNase Free DNase (Invitrogen) for å fjerne genomisk DNA. Revers transkripsjon av RNA ble utført ved hjelp av Superscript ™ III First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens anvisninger. For den negative kontrollen, ble den reverse transkriptase ikke tilsatt til reaksjonsblandingen. Konvensjonelle eller nestet PCR ble utført og primerene anvendt i denne studien var oppført i tabell 1. For Ikaros, som har flere forskjellige isoformer, ble nestet PCR benyttes for å øke følsomheten og for bedre å karakterisere de spesifikke Ikaros isoformene [28]. De to isoformer av E2A, E47 og E12 ble begge forsterket av PCR.
SDS-PAGE og Western blot
Cellelysater ble utarbeidet etter RIPA buffer. Omtrent 40 ug totalt, cellulært protein ble separert på 5% til 10% SDS-PAGE-gel. Etter elektroforese, ble de separerte proteinene overført til en polyvinylidendifluorid-membran. De primære antistoffer ble brukt omfattet RAG1 (K-20), RAG2 (D-20), GAPDH (0411), E2A (Yae), FOXP1 (D35D10), NF-kB p65 (F-6), og FOXO1 (H-128 ). FOXP1 antistoff ble hentet fra Cell Signaling Technology og de andre antistoffer ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Etter inkubasjon med det sekundære antistoff (geit-anti-mus-IgG-HRP eller geite-anti-kanin-IgG-HRP, Santa Cruz) ble immunoblot utviklet ved hjelp av Super ECL Plus deteksjonsreagensen (Applygen Technologies, Beijing) og eksponert for røntgenfilm henhold til produsentens protokoll.
immunfluorescens
Celler ble dyrket på lysbilder i 6 brønners plater og fiksert i 4% paraformaldehyde i 15 minutter ved romtemperatur. Da objektglassene ble inkubert med 0,5% Triton X-100 i 10 minutter, og blokkert i en time i PBS inneholdende 4% bovint serumalbumin (BSA). De primære antistoffer omfattet E2A (Yae), FOXP1 (D35D10), NF-kB p65 (F-6) og FOXO1 (H-128). Den detaljerte informasjonen for disse antistoffene er vist i tabell 2. isotype kontroller ble utført under anvendelse av normal mus eller kanin-IgG i samme konsentrasjon som de primære antistoffer. Etter inkubering ved 4 ° C over natten og vasking ble platene inkubert med det sekundære antistoff geit-anti-mus-IgG-FITC (grønt signal) eller geite-anti-kanin-IgG-TRITC (rødt signal) ved romtemperatur i 1 time. Etter en siste vask, ble lysbilder montert med montering media med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og undersøkt under et fluorescens mikroskop (Carl Zeiss).
plasmider konstruksjon og transfeksjon
de menneskelige E47 og E12 fragmenter ble klonet inn en pIRES2-EGFP plasmid ved restriksjonsenzym Bglll og EcoRI fra plasmider MigR1-hE47 og henholdsvis MigR1-hE12, som var snille gaver fra Dr. Barbara Kee ved University of Chicago. Den pCDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A plasmid som kodet murine Foxp1A protein ble sjenerøst gitt av Dr. Philip Tucker ved University of Texas i Austin [29]. Den FOXP1 protein ble svært konservert mellom menneskelige og murine arter (mer enn 90% identiteter), så vi brukte dette plasmid for vår studie. PcDNA3-GFP-FOXO1; AAA plasmid ble oppnådd fra Addgene og det ble fremstilt Dr. William Sellers «laboratorium som tidligere beskrevet [30]. Dette plasmid inneholdt en phosphosite mutasjon av FOXO1, som som et resultat herav ble ikke lenger er fosforylert av Akt og fortsatt kunne lokalisere til kjernen og aktivere transkripsjon i transfekterte celler [31]. Forbigående transfeksjon analyser av A549 og MCF-7 kreftceller ble gjort ved hjelp av Fugene HD Transfeksjon Reagens (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner.
RNA interferens
Liten interfering RNA (siRNA) rettet mot FOXO1 [32], FOXP1, E2A og uspesifikke kontroll siRNA (GenePharma, Shanghai, Kina) ble transfektert inn i A549 og MCF-7 kreftceller ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. SiRNA sekvenser ble oppført i tabell 1.
ChIP
Chromatin kryssbinding og immunoprecipitation ble utført som beskrevet tidligere [23]. Den anti-acetyl-histon H3 (06-599, Upstate Biotechnology), E2A (Yae), E47 (N-649), FOXP1 (D35D10) eller FOXO1 (H-128) ble anvendt. Både E2A (Yae) og E47 (N-649)-antistoff ble anvendt i brikke for E2A. Normal kanin IgG (sc-2027, Santa Cruz) eller normal mus IgG (sc-2025, Santa Cruz) ble anvendt som en negativ kontroll. Immunoutfelt DNA-sekvenser ble analysert med PCR og primere ble oppført i tabell 1.
Resultater
E2A, ble FOXO1, FOXP1 og NF-kB uttrykt i kreftcellelinjer
RT-PCR resultater viste at FOXO1, FOXP1, NF-kB subenhet p65 og begge de to isoformer av E2A (E47 og E12), ble uttrykt i kreftceller A549, PC3, MCF-7 og MDA-MB-231 (figur 1). Imidlertid ble hverken Ikaros eller PAX5β påvist i disse kreftcellelinjer, mens de kan begge bli amplifisert fra Raji-celler. På proteinnivået, E2A, FOXO1, FOXP1 og NF-kB-subenhet p65 ble påvist i alle kreftcellene med Western blot-analysen (figur 2). Basert på molekylvekten, ble den fulle lengde FOXP1 funnet å være den viktigste isoformen av FOXP1 uttrykt i kreftcellene. Vi har også bekreftet ekspresjon av RAG1 og RAG2 i disse kreftcellelinjer (figur 2).
18S ble benyttet som en intern kontroll. Raji ble anvendt som en positiv kontroll. DNase-behandlede RNA uten tilsetning av revers transkriptase ble anvendt som en negativ kontroll.
Raji celle ble anvendt som en positiv kontroll. GAPDH ble brukt som en intern kontroll.
E2A, FOXO1 og FOXP1 ble lokalisert til kjernen av kreftceller
For å studere lokalisering av E2A, FOXO1, FOXP1 og NF-kB i kreftceller, ble IF utført under anvendelse av de tilsvarende antistoffer på de fire kreftcellelinjer. Resultatene viste at E2A og FOXP1 ble hovedsakelig er lokalisert til kjernen, mens NF-kB er utelukkende lokalisert til cytoplasmaet av kreftceller (figur 3). FOXO1 ble funnet å translocate mellom kjernen og cytoplasma, med plassering, avhengig av forholdene kultur og vekst. Når cellene var konfluente, ble FOXO1 hovedsakelig lokalisert i kjernen, mens det var hovedsakelig tilstede i cytoplasma når cellene var sparsommelig. Siden transkripsjonsfaktorer må være lokalisert i kjernen for å regulere genekspresjon, vi bare fokusert på E2A, FOXO1 og FOXP1 i den andre delen av studien.
A, normal mus IgG ble brukt i stedet for primært antistoff. B, det primære antistoff var anti-mus E2A. C, det primære antistoff var mus anti-NF-kB p65. A til C ble det sekundære antistoff geit-anti-mus-IgG-FITC. D, normal kanin-IgG ble anvendt i stedet for det primære antistoff. E, det primære antistoff var kanin anti-FOXO1. F, det primære antistoff var kanin anti-FOXP1. D til F, ble det sekundære antistoff geit-anti-kanin-IgG-TRITC. Lignende resultater ble oppnådd for A549, PC3 og MDA-MB-231 cellelinjer (data ikke vist).
Over-uttrykk for E2A, FOXO1 eller Foxp1 up-regulert RAG uttrykk
for å utforske effekten av transkripsjonsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 på RAG uttrykk, A549 og MCF-7 celler ble transfektert med ekspresjonsvektoren for E47, E12, Foxp1A eller FOXO1. Den tomme vektor ble anvendt som en negativ kontroll. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble totalt protein ekstrahert for analyse av E2A, FOXP1, FOXO1 og RAG uttrykk ved Western blot analyse. Resultatene viste at transfeksjon med ekspresjonsvektoren for E47, E12, Foxp1A eller FOXO1 økt både RAG1 og RAG2 uttrykk (figur 4). Disse dataene indikerer at over-ekspresjon av E2A, FOXO1 eller Foxp1 opp-regulert ekspresjon av RAG1 og RAG2 i MCF-7-celler. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av A549-cellelinjen (data ikke vist).
MCF-7-celler ble transfektert med den tomme vektoren eller transkripsjonsfaktor ekspresjonsvektor pIRES2-EGFP-hE47, pIRES2-EGFP-hE12, pcDNA3- GFP-FOXO1, AAA eller pCDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A. 48 timer senere total protein fra MCF-7-celler ble samlet opp og analysert ved hjelp av Western blot. GAPDH ble vist som en lasting kontroll. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. Lignende resultater ble oppnådd for A549 cellelinje (data ikke vist).
RNA interferens fra E2A, FOXO1 eller FOXP1 nedregulert RAG uttrykk
For å studere regulerende funksjon av ytterligere E2A, FOXO1 og FOXP1 på uttrykk for RAG ble siRNA sekvenser for E2A, FOXO1 eller FOXP1 transfektert inn i A549 og MCF-7 celler. Den ikke-spesifikke siRNA ble anvendt som den negative kontroll. 48 timer etter transfeksjon, ble totalt protein ekstrahert for å analysere E2A, FOXP1, FOXO1 og RAG-ekspresjon ved Western blot-analyse. Transfeksjon med siRNA sekvens for E2A, FOXP1 eller FOXO1 ble funnet å redusere uttrykk for både RAG1 og RAG2 (figur 5), noe som tyder på at stanse E2A, FOXO1 eller FOXP1 gener nedregulerer RAG1 og RAG2 uttrykk i MCF-7 celler. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av A549-cellelinjen (data ikke vist).
MCF-7-celler ble transfektert med uspesifikk kontroll siRNA eller siRNA sekvens for E2A, FOXO1 eller FOXP1. 48 timer senere total protein fra MCF-7-celler ble samlet opp og analysert ved hjelp av Western blot. GAPDH ble vist som en lasting kontroll. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. Lignende resultater ble oppnådd for A549 cellelinje (data ikke vist).
E2A, FOXO1 og FOXP1 bundet til Erag in vivo
I murine B-celler transkripsjon faktorer E2A, Foxo1 og Foxp1 regulere RAG uttrykk gjennom binding til Erag, at forsterkeren regulerer RAG genuttrykk. For å undersøke hvorvidt disse transkripsjonsfaktorene oppfører seg på samme måte i kreftceller, ble ChIP utført på A549 og MCF-7 celler. Den Erag region 1 inneholder tre bindingssteder for E2A og ett bindingssete for FOXO1 eller FOXP1, mens Erag region 3 inneholder ingen bindende nettsted for E2A og ett bindingssete for FOXO1 eller FOXP1 [25]. Chip Resultatene viste at histon H3 både Erag region 1 og 3 ble acetylert, noe som indikerer at Erag var i en åpen eller aktivert tilstand. I tillegg transkripsjonsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 ble vist å være bundet til Erag region 1, men ikke til region 3 (figur 6). For begge cellelinjer ble oppnådd lignende resultater.
A, tverrbundet kromatin isolert fra MCF-7-celler ble immunopresipitert med enten isotype kontroll IgG eller anti-acetyl-histon H3-antistoff. De tilknyttede kromosomale DNA-fragmenter ble amplifisert med primere for Erag region 1 og 3. B, antistoffet for immunpresipitering ble anti-E2A, FOXO1 eller FOXP1. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. Lignende resultater ble oppnådd for A549 cellelinje (data ikke vist).
Diskusjoner
Nylig flere forskningsgrupper rapporterte at V (D) J rekombinasjon og RAG uttrykk skjedde i kreftceller. Imidlertid er mekanismen kontrollere disse fenomenene i epitel-celler som for tiden ukjent. I denne studien, i analogi med den molekylære mekanismen for RAG uttrykk i B-celler, vi utforsket reguleringsmekanisme av RAG uttrykk i kreftceller ved å analysere transkripsjonsfaktorene E2A, Ikaros, PAX5β, FOXO1, FOXP1 og NF-kB. I likhet med sin rolle i aktivering av RAG uttrykk i B-celler, fant vi at E2A, FOXO1 og FOXP1 regulert RAG uttrykk i kreftceller ved å binde seg til Erag.
E2A tilhører klasse I helix-loop-helix (HLH) proteiner, også kjent som e-proteiner på grunn av deres evne til å binde med relativ høy affinitet til palindromisk DNA-sekvens CANNTG, referert til som en E boks side [33], [34]. Den E2A-genet koder for to E proteiner, E12 og E47, som oppstår ved alternativ spleising av det exon som koder for den HLH domenet [35]. E12 og E47 er primære transkripsjonsaktivatorer som fungerer til dels ved å rekruttere ko-aktivator protein p300 /CBP, som i sin tur rekrutterer histon acetyltransferases og RNA polymerase II til promotoren eller enhancere av målgener [36], [37]. E2A er antatt å være en viktig regulator av B-celledifferensiering ved å aktivere ekspresjonen av RAG og andre B-lymfoide gener [34]. Over-ekspresjon av E47 er tidligere blitt funnet å aktivere RAG1 ekspresjon og avIgH bakterie-linje transkripsjon i fibroblaster [38]. Ektopisk ekspresjon av E2A, sammen med RAG1 og RAG2 fremmet både IGH og igl genet rearrangementer i et ikke-lymfoid embryonisk nyrecellelinje [39], [40]. Våre funn at begge RAG og E2a-proteiner ble uttrykt i kreftceller bidrar til forståelsen av mekanismen for V (D) J rekombinasjon i neoplastiske celler.
FOXO1 og FOXP1 tilhører familien av gaffelhodeboks proteiner, hvilke inneholde et felles DNA-bindende domene (DBD) betegnet den gaffelhodeboksen eller vinger heliks domene [41]. FOXO1 kan translocate fra kjernen til cytoplasma etter å ha blitt fosforylert av Akt. Murine Foxp1 har fire alternativt skjøtes isoformer, Foxp1A-Foxp1D [29]. Deregulering av FOXO1 og FOXP1 hadde blitt vist i mange krefttyper [41], [42]. Nylig to studier viste at Foxo1 og Foxp1 regulert RAG uttrykk i murine B-celler [24], [25]. Her har vi vist at FOXO1 og FOXP1 har også regulerende funksjon i RAG uttrykk i kreftceller.
I denne studien har vi fokusert på et utvalgt antall transkripsjonsfaktorer og fant at E2A, FOXO1 og FOXP1 regulert RAG uttrykk i kreftceller. Om det er flere transkripsjonsfaktorer som er involvert i RAG uttrykk gjenstår å bli utforsket. I tillegg kan om det er flere likheter i genekspresjon mellom B-celler og kreftceller bli funnet ved hjelp høy gjennomstrømning teknikker. Tidligere ble det rapportert at Ig uttrykk fremmet tumorvekst og progresjon [2], [43], [44]. I lys av våre resultater på regulatoriske forhold aktive RAG uttrykk, kan Ig uttrykk i kreftceller kontrolleres ved å målrette oppstrøms transkripsjonsfaktorer til slutt hindre tumorprogresjon.
Takk
Vi takker Dr. Philip Tucker for å gi pCDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A plasmid, Dr. Barbara Kee for MigR1-hE47 og MigR1-hE12 plasmider, og Dr. William Selgere for pcDNA3-GFP-FOXO1; AAA plasmid.
