Abstract
Belinostat er en hydroksamat klasse HDAC hemmer som har vist aktivitet i perifere T-celle lymfom og gjennomgår kliniske studier for ikke-hematologisk kreftsykdom. Vi studerte farmakokinetikken til belinostat i leverkreft pasienter å bestemme viktigste metabolismeveien for belinostat. Farmakokinetikk belinostat i leverkreftpasienter ble preget av rask plasmaclearance belinostat med omfattende metabolisme med mer enn fire ganger større relativ systemisk eksponering av hovedmetabolitten, belinostat glukuronid enn for belinostat. Det var betydelig interindividuell variasjon på belinostat glukuronidering. Den store metabolismeveien involverer UGT1A1-mediert glukuronidering og en god korrelasjon har blitt identifisert mellom belinostat glukuronid dannelse og glukuronidering kjente UGT1A1 underlag. I tillegg levermikrosomer husing UGT1A1 * 28 alleler har lavere glukuronidering aktivitet for belinostat forhold til de med villtype UGT1A1. Hovedmetabolismen av belinostat er gjennom glukuronidering hovedsak medieres via UGT1A1, en svært polymorfe enzymet. Den kliniske betydningen av dette funnet gjenstår å fastslå
Trial Registrering
ClinicalTrials.gov NCT00321594
Citation. Wang LZ, Ramírez J, Yeo W, Chan M-YM , Thuya WL, Lau J-YA, et al. (2013) Glukuronidering av UGT1A1 er den dominerende Pathway av Metabolsk disponering av Belinostat i leverkreftpasienter. PLoS ONE 8 (1): e54522. doi: 10,1371 /journal.pone.0054522
Redaktør: John Luk, Johnson Johnson Medical, Kina
mottatt: 02.08.2012; Akseptert: 12. desember 2012; Publisert: 30 januar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble sponset av National Research Foundation of Singapore (Experimental Therapeutics Program) og National Medical Research Council of Singapore (NMRC /CSA /021/2010). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Vær oppmerksom på at belinostat er et Topotarget produkt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
histondeacetylase hemmere (HDACis) har vist seg å ha anticancer aktivitet i ondartede celler gjennom acetylering av både histon og ikke-histonproteinene. Acetylering av histoner medierer epigenetisk modulering av gener som kan indusere apoptose, hemmer cellevekst og reduserer neoangiogenesis [1] – [7]. Flere HDACis har blitt godkjent for behandling av perifer eller kutan T-cellelymfom [8] – [10]
Belinostat er en hydroksamsyre basert pan-histon deacetylase inhibitor i klinisk utvikling som et anti-kreftterapi i. en rekke hematologiske maligniteter og solide, både som eneste legemiddel samt kombinasjonsterapier [11] – [18]. Foreløpig belinostat har fått fast track og foreldreløs narkotika betegnelse av det amerikanske Food and Drug Administration for behandling av residiverende eller refraktær perifere T-celle lymfom. Selv om klinisk stoffet har blitt relativt godt tolerert, de vanligste bivirkninger inkludert tretthet, kvalme og oppkast, og apati, og nådde grad 3 ved maksimal tolererbar dose på 1200 mg /m
2 gitt i 30 minutter (min) infusjoner for 5 påfølgende dager hver 3. uke. Belinostat er tilgjengelig i både muntlig og intravenøse formuleringer, og ettersom stoffet er forventet å bli administrert på en kronisk basis, kumulativ toksisitet er mulig. Derfor ville det være viktig å bestemme metabolismen av belinostat, å forstå dens
in vivo
disposisjon. Opp til nå, er svært lite kjent om de metabolske banene til belinostat
Andre medlemmer av hydroxaminsyren klasse HDAC hemmere som vorinostat og panobinostat gjennomgå primær metabolisme av glukuronidering [19] -. [21]. På den annen side, romidepsin, et syklisk tetrapeptid klasse HDAC-inhibitor, metaboliseres hovedsakelig av CYP3A4 [22]. Derfor hypotese vi at glukuronidering ville være det primære reaksjonsvei for metabolisme av belinostat. Videre er mange glukuronosyltransferase isoformene er svært polymorfe og slagfunksjon, for eksempel, homozygot delesjon av UGT2B17 alleler (UGT2B17 * 2) resulterer i mangelfull metabolismen av vorinostat [23]. Følgelig vil det være viktig å identifisere de viktigste metaboliserende isoform av belinostat, for bedre å forstå innvirkningen av Pharmacogenetics på interindividuell variasjon av belinostat farmakodynamikken. Dette gir også veiledning for videre interaksjonsstudier.
I denne studien har vi undersøkt farmakokinetikken til belinostat og identifisert metabolitter basert på massespektra og maksimal UV absorpsjon. Vi identifiserte den dominerende metabolitt av belinostat som belinostat glukuronid, og ytterligere studert glukuronidering av belinostat ved hjelp av et panel av UGT-isoenzymer og humane levermikrosomer, for å bestemme de viktigste isoformen er ansvarlig for metabolismen. Til slutt ble potensial farmakogenetiske innflytelse på farmakodynamikk av belinostat utforsket
Materialer og metoder
Protokollen for denne rettssaken er tilgjengelig som tilleggsinformasjon.; se Protocol S1.
Reagenser
Belinostat (PXD101) var en gave fra National Cancer Institute (Bethesda, Maryland, USA). Belinostat glukuronid (belinostat-G) ble kromatografisk separert med HPLC-UV og isolert fra humant plasma ved hjelp av en fraksjonsoppsamler. Den kjemiske struktur og renhet har blitt bekreftet gjennom LC-MS /MS (API 4000 trippel-kvadrupol massespektrometer, AB Sciex, Concord, Canada) og HPLC-UV-analyse. Vorinostat glukuronid (vorinostat-G), intern standard, var en gave fra Merck Sharp Dohme (IA) Corp Acetonitril (HPLC), metanol (HPLC), etanol (analysekvalitet), maursyre (analysekvalitet), di-natriumhydrogenfosfat dihydrat (Na
2HPO
4.2H
2o) og orto-fosforsyre (85%) ble oppnådd fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Direkte QTM vann (Millipore Milford, MA, USA) ble anvendt for den mobile fasen fremstillingen. Menneske UGT supersomerer og UGT Reaction-Solutions A og B ble kjøpt fra BD Gentest (San Jose, CA, USA). Dette er cDNA uttrykt UGTs og et panel av 12 (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10, UGT2B4, UGT2B7, UGT2B15, UGT2B17) ble brukt.
humane levermikrosomer Forberedelse
menneske~~POS=TRUNC lever fra 37 friske kaukasiske donorer ble behandlet i Dr. Mary Relling laboratorium ved St. Jude Children Research Hospital (Memphis, Tennessee, USA) og ble levert av leveren vev Procurement and Distribution System (finansiert av # N01- DK-9-2310) og av Cooperative menneskelig vev Network. De 37 humanlevermikrosomer (HLM) ble isolert fra forskjellige leverprøve med ingen sammenheng med hverandre. Mikrosomer ble utarbeidet av differensialsentrifugering.
studiekohorter
Denne multisenter fase I studie av belinostat ble gjort i Hong Kong og Singapore. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke i henhold til god klinisk praksis retningslinjer, og protokollen ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i Prince of Wales Hospital, Hong Kong og National University Hospital, Singapore. Sytten pasienter ble behandlet med belinostat ved økende doser på 600 (n = 3), 900 (n = 3) 1200 (n = 6) 1400 (n = 5) mg /m
2 daglig ved intravenøs (iv) infusjon i løpet av 30 min i 5 dager hver 21. dag.
Farmakokinetisk Assessment
Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet ved forutbestemte samplings tidspunkter på dag 1 før dosering, 15 min, 30 min, 45 min, 1 time (h), 1,5 timer, 2 timer, 3 timer, 5 timer og 24 timer etter infusjonen og dag 5 i det før dosering, 30 minutter, 1 time, 1,5 timer, 3 timer, 5 timer etter infusjonen og dag 22 etter starten av 30 min iv infusjon i en fase I klinisk utprøving av belinostat. Venøse blodprøver hadde blitt samlet i hepariniserte rør. Innsamlede blodprøver ble sentrifugert ved 3000 g i 10-15 minutter og plasma (supernatant) ble separert fra cellepelleten og lagres i vanlig rør ved -80 ° C inntil analyse. Konsentrasjonene av belinostat og belinostat glukuronid ble kvantifisert ved en modifisert væskekromatografi /massespektrometri-metoden [24]. I korthet ble vorinostat-G anvendt som indre standard for belinostat-G. Den massespektrometer ble operert i positiv ion modus med optimale masse overganger belinostat-G:
m /z
495 93 og vorinostat-G:
m /z
441 232, henholdsvis . Den analytiske metoden ble godt validert med god linearitet (koeffisienten, r
2≥0.999) i størrelsesorden 1-100 mikrometer for belinostat-G.
Identifikasjon av Belinostat metabolitter og Isolering av Belinostat- G
metabolitt screening i pasientprøvene ble behandlet med HPLC-UV ved 268 nm, den maksimale absorpsjon bølgelengde belinostat. Grunnlinje-separasjon av alle analyttene ble oppnådd på Alltima C
18 (150 mm x 2,1 mm, 5 um) kolonne. Mobil fase oppløsningsmiddel A var 20 mM Na
2HPO
4 (pH 4,2, justert med ortofosforsyre), mens mobil fase B løsningsmiddel bestående av 70% acetonitril og 30% metanol (v /v). En gradient mobil fase program ble anvendt – Initial prosent av oppløsningsmiddel A var 75% (v /v), og at av løsningsmiddel B var 25% (v /v); Prosent av løsningsmiddel B ble økt til 95% (v /v) i løpet av 13 min, og umiddelbart byttet tilbake til 25% (v /v) i 7 minutter før injeksjonen av den etterfølgende prøve. Total driftstid på hver prøve var 25 min. Strømningshastigheten ble opprettholdt på 0,5 ml /min.
De potensielle belinostat metabolitter ble ytterligere bekreftet med en tandem massespektrometer i Q1, produkt- og forløper skanninger. Isoleringen og rensingen av hovedmetabolitten av belinostat ble utført på en Nova-Pak 3,9 x 300 mm C18-kolonne (Waters, Irland), ved bruk av 20 mM ammoniumacetat buffer (pH 5,0) og 100% metanol i en første mobilfase sammensetning 60% :40% (v /v) med en strømningshastighet på 0,6 ml /min. Metanol ble øket til 95% i løpet av 10 minutter og umiddelbart byttet tilbake til 40% i 6 minutter før den neste injeksjon. p-glukuronidase-hydrolyse og massespektrometri (både i positiv og negativ modus) for å fastslå renheten og identiteten av hovedmetabolitten.
Syrestabilitet Test for Belinostat-G
1 mg /ml av belinostat -G og vorinostat-G ble utarbeidet i ulike biler med ulike pH-verdier. Disse kjøretøyene er inkludert 10 mM ammoniumacetat (pH = 6,5), 10 mM ammoniumformiat (pH = 6,0), 0,1% eddiksyre (pH = 3,2) og 0,1% maursyre (pH = 2,6). Alle disse testprøver ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Milli Q-vann (pH = 5,5) ble anvendt som kontrolløsning som ble lagret i -20 ° C. Alle prøvene ble analysert ved LC-MS /MS for å oppnå verdiene av topparealet for belinostat-G og vorinostat-G. Den sure stabilitet både konjugerte forbindelser ble evaluert gjennom sammenligning av toppområdet forholdet mellom testprøver versus kontroll.
In Vitro
Potens Assessment på Belinostat og Belinostat-G
Å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av doseavhengig aktivitet av belinostat og belinostat-G mot hepatocellulære kreftceller, ble humane leverleverkreft (HepG2-celler) sådd ut i to 24-brønns plater ved 10,000 celler pr brønn. Til en plate, ble 5 forskjellige konsentrasjoner av belinostat tilsatt for å oppnå 2 replikater pr konsentrasjon (0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 uM). Til den andre plate, ble like molare konsentrasjoner av belinostat-G tilsatt på samme måte. Etter 72 timer ble cellene farget med gentian violet maling (0,5% w /v, B.P.) og vurdert for levedyktighet. Videre, for å følsomheten til HepG2 belinostat og belinostat-G ble kvantitativt målt ved anvendelse av MTS-analysen. I korte trekk, HepG2 celler sådd ut i 96-brønners plater ved 3000 celler /brønn ble behandlet med syv forskjellige doser av belinostat eller belinostat-G og deretter undersøkt for vekstinhibering med Promega CellTiter 96® AQ
ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay . Etter inkubering 24 timer, 100-pl medikamentoppløsning eller blank medium ble tilsatt til hver brønn av 96-brønners plater. 72 timer senere ble 20 ul av MTS /PES tilsatt til hver brønn for inkubasjon i 3 timer. OD-verdiene er målt på bølgelengde 490 nm. Hemming av cellevekst ble beregnet på grunnlag av de selvlysende enheter med subtraksjon av bakgrunnsstoff for bare middels inneholder brønner. Den veksthemming ble definert som prosentandelen av gjennomsnittlig luminescerende enhetene fra medikament-behandlede brønner som fra kontrollbrønner uten behandling. Forsøket ble utført i tre paralleller. IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp GraphPad PRISM programvare (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).
Western blotting
For western blot analyse, HepG2 celler behandlet med belinostat ble høstet og lysert i cellelyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) og protease-inhibitor cocktail (Roche). Proteinkonsentrasjoner ble kvantifisert ved anvendelse av Bradford-analysen (Invitrogen). Proteinene ble separert på en 12% SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulosemembran. Ikke-spesifikk protein binding ble blokkert ved å inkubere med 5% ikke-fettholdig melk (BioRad Laboratories) i 0,1% PBS-Tween (PBST) ved romtemperatur i 1 time og inkubert med spesifikke antistoffer, Histone H3 og Ac-H3 [K9 /K14] (Cell Signaling), ved 4 ° C over natten. Passende artsspesifikke Pepperrot peroxidises-konjugerte sekundære antistoffer ble deretter tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av påvisning ved anvendelse av en forbedret kjemiluminescens kit (GE Healthcare).
Screening av Menneskelig 12 UGT supersomerer og Kinetic Analysis
En typisk inkubasjon besto av 50 ug av UGT, 2 mM UDPGA (UGT reaksjonsløsning A), 50 mM Tris-HCl, 8 mM MgCl
2 og 0,025 mg /ml alamethicin (UGT reaksjonsløsning B) i et endelig inkubasjonsvolum på 100 ul. Før tilsetning av substratet, ble inkubasjonsblandingen forvarmet og ekvilibrert i 5 min ved 37 ° C. Reaksjoner ble initiert ved tilsetning av 10 uM belinostat oppløsning i DMSO og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter; Reaksjonene ble avsluttet ved tilsetning av 200 ul iskald metanol og virvling. Inkubasjonsblandingen ble vortex-blandet og sentrifugert (10 060
g
) ved 4 ° C i 10 minutter, og supernatantene ble analysert. Insekt mikrosomer uten UGT cDNA tjente som negativ kontroll. Kinetiske parametre (
K
m og
V
max) av belinostat glukuronidering av UGT1A1 supersomerer ble bestemt ved hjelp av substrat konsentrasjoner av 10-750 mikrometer. Inkubasjoner ble utført som beskrevet ovenfor. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for kinetisk analyse.
Sammenheng Studier med UGT1A1 Underlag, UGT1A1 Gene Expression og UGT1A1 * 28 Polymorphism
I en korrelasjonsstudie av glukuronidering av belinostat og UGT1A1 underlag, belinostat glukuronidering var målt som beskrevet ovenfor under anvendelse av 100 uM belinostat og 50 ug HLM; denne konsentrasjonen av belinostat ble valgt som det er nær Km av UGT1A1. Glukuronidering av bilirubin, tyroksin og SN-38 i disse mikrosomer, måling av UGT1A1 genekspresjon og genotyping for UGT1A1 * 28 har tidligere blitt beskrevet [25] -. [27]
Data Analysis
Belinostat-G dannelse hastighet (
v
) ble beregnet som Cm, 30 min /inkubasjonstid /CYP konsentrasjon, hvor Cm, 30 min var metabolitten konsentrasjonen etter 30 min inkubasjon. Plott av underlaget konsentrasjon, S (X-aksen) versus
v product: (Y-aksen) ble deretter konstruert. Km og Vmax ble beregnet ved bruk av Michaelis-Menten-ligningen (GraphPad programvare, Inc., San Diego, CA, USA). (1)
Sammenheng mellom belinostat glukuronid konsentrasjon og UGT1A1 underlag ble utført ved hjelp av både Pearsons korrelasjon og Spearmans korrelasjonstester (GraphPad Prism programvare, La Jolla, CA). Farmakokinetiske parametre ble estimert basert på ikke-kompartment analysemodell ved hjelp WinNonlin programvareversjon 5.3 (Pharmsight, Sunnyvale, CA, USA). Relativ eksponering av belinostat-G i pasientens plasma ble representert av den molare konsentrasjon AUC-forhold på belinostat-G i løpet av belinostat. En enveis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å bestemme signifikans mellom genotypene med Tukey posthoc tester for justering for sammenlikning mellom de enkelte grupper. En verdi på p 0,05 ble ansett å være betydelig
Resultater
farmakokinetikk og metabolisme Belinostat i Human Plasma
Konsentrasjonene av belinostat og belinostat-G i 17 pasienter. registrert i en fase i klinisk studie i leverkreft (HCC) ble kvantifisert for estimering av farmakokinetiske parametre (Tabell 1). Belinostat fulgt lineær farmakokinetikk ved doser 600-1400 mg /m
2, med større interindividuell variasjon av clearance ved høyere doser. Koeffisientene til variasjon av clearance (CL) var 29,0% og 30,6% i 1200 og 1400 mg /m
2, henholdsvis. Belinostat ble eliminert raskt etter intravenøs administrasjon på grunn av intensiv fase II glukuronidkonjugering, M1 (figur 1)
kromatogram på dag 5 og dag 22 (A).; Dag1 (B).
Fem metabolitter av belinostat ble identifisert ved å sammenligne ultrafiolett (UV) absorpsjon av plasmaprøver ved 268 nm før og etter dosering. Lignende profiler kromatogram ble detektert på dag 1 (figur 1B) og dag 5 (figur 1A). MS /MS-produktioner av disse fem metabolittene overvåket i positiv modus understøttet deres kjemiske struktur identifikasjon (tabell 2). Glukuronidering var den mest betydningsfulle sti belinostat metabolisme; to alternative biotransformasjonsveier involvert metylering for å metyl belinostat og reduksjon av hydroxaminsyren gruppen til den tilsvarende belinostat amid. Belinostat syre og belinostat glucoside var 2 andre mindre metabolitter oppdaget. Den foreslåtte metabolismen av belinostat er angitt i figur 2. De kjemiske strukturer av disse metabolittene foreslås basert på deres proton molekyl masse topper [M + H]
+, to ganger molekyl masse topper [2M + H]
+ og masse fragmentering profilering generert av produktet scan. Disse strukturer ble ytterligere bekreftet ved analyse av fragmenterings ioner av forløper-ioner, som avslørte et vanlig produkt ion (m /z 93, fenylamino fragment) av belinostat og dens fem metabolitter. Basert på metabolitt-strukturer, er det hydroxamide delen nøkkelen struktur for styrken av belinostat. Skanning av m /z spektra fra plasma hos pasienter støttet glukuronidering av belinostat gjennom påvisning av 495, 989, 493 som representerer den proton belinostat G, protonert dobbel belinostat G, og deprotonert belinostat G, henholdsvis. Den kjemiske strukturen til belinostat-G isolert fra plasma ble undersøkt ved massespektrometri. En serie av massespektra av belinostat-G ble anskaffet å foreslå den kjemiske struktur. For eksempel, ble m /z 495 og m /z 989 identifisert som dens protonerte lavmolekylære massetopper [M + H]
+ og 2 ganger molekyl massetopper [2M + H]
+, henholdsvis. Skanning i negativ modus detekteres dens tilsvarende deprotonerte moder ion som m /z 493 [M-H]
-. En lignende masse fragmentering profilering i positiv modus ble funnet både for belinostat og belinostat-G. Basert på den felles produktet ion (fenylamino fragment), en forløper ion skanning av m /z 93 ble behandlet på belinostat og belinostat-G for å utlede de overordnede ioner som m /z 319 [M + H]
+ for belinostat og m /z 495 [m + H]
+, henholdsvis for belinostat-G. Forutsatt at dette var korrekt, ville de kjemiske strukturer av dets metabolitter antas å ha tilsvarende UV-spektra for disse metabolitter og dens moderforbindelse i tillegg på grunn av likheten av deres grunnleggende molekylstruktur, og dette ble støttet ved UV-spektralanalyse genereres av diodeoppstillingsdetektor (DAD) viser lignende maksimum bølgelengde på 268 nm for belinostat og sine fem metabolitter.
Den viktigste metabolitten ble identifisert som belinostat-G som ble ytterligere bekreftet gjennom enzymhydrolyse reaksjon. Det isolerte belinostat-G fra plasmaprøver ble underkastet
Escherichia coli- avledet
β-glukuronidase (6,8 mg /ml) inkubasjon i 5 timer, og den resulterende reaksjonsblanding ble analysert ved LC-MS /MS. Den kvantitative farmakokinetisk analyse indikerte at belinostat-G eksponering var fire ganger høyere enn for belinostat i humant plasma basert på den molare konsentrasjon AUC-forhold på belinostat-G /belinostat (tabell 1). Derfor ble belinostat glukuronidering bekreftet å være den dominerende metaboliseres belinostat.
Stabilitet av Belinostat-G i surt miljø
For ytterligere å karakterisere glukuronidering av belinostat, testet vi den sure stabilitet belinostat -G. Belinostat-G og vorinostat-G, en parallell styre for belinostat-G, ble vist å være stabil etter 24 timers inkubering ved 37 ° C i forskjellige sure oppløsninger (pH 2,6- pH 6,5). Variasjonen i konsentrasjoner målt ved begynnelsen av forsøket og etter 24 timer var meget marginal ( 4%). Dette stemmer overens med vår foreslått O-konjugert struktur av belinostat-G (M1) som er vist i figur 2. Imidlertid ble mindre nedbrytning (7%) identifisert bare når pH-verdien ble redusert til 2.6. Resultatene bekreftet belinostat er konjugert til glukuronid ved O-stilling, slik som O-glukuronider, men ikke N-glukuronider av hydroxaminsyrer som er stabile i surt miljø [28], [29]. Som vorinostat-G har blitt bekreftet å være en O-konjugert glucuronid [30], viser dette at det isolerte belinostat-G er en O-konjugert metabolitt i tillegg.
Bestemmelse av
In Vitro
Cytotoksisitetsdata Effekter av belinostat og belinostat-G
Figur 3a og 3b viser resultatene av dose økende konsentrasjoner av belinostat og belinostat-G utført på separate 24-brønners plater etter inkubering i 72 timer. Som belinostat konsentrasjonen øket, antall levedyktige celler (farget fiolett) viste doseavhengig reduksjon. Omvendt, økende konsentrasjoner av belinostat-G synes ikke å påvirke cellenes levedyktighet innenfor konsentrasjonsområdet testes. Som sådan, i ekvimolare konsentrasjoner mellom 0-10 uM, demonstrerer belinostat signifikant doseavhengig cytotoksisitet mens belinostat-G ikke. Videre er resultatene av MTS assays var også i overensstemmelse med den for farging analysen (figur 3c). Histone H3 acetylering for belinostat eksponering viste en tid og konsentrasjonsavhengig økning (Figur 3d)
a. Belinostat inkubasjon; b: belinostat-G inkubasjon; (Maler for konsentrasjoner tilsatt (lavere) og resultatene av 24-brønns konsentrasjoner dose økende på HepG2 celler (øvre) c. MTS resultater for belinostat (IC
50 = 6,4 mm) og belinostat-G (kan ikke konvergerte) .. d: Belinostat acetylering aktivitet på HepG2 celler (western blot) A: acetyl histone tre økte med dose tilvekst etter fem timers inkubering; B: Kinetic endringer av acetyl histone 3 med tidsintervall på 10 mikrometer
In vitro
metabolisme Screening av UGTs for belinostat-G Dannelse og enzymkinetikk
UGT1A1 glukuronideres belinostat signifikant (figur 4A), mens ingen metabolisme ble observert etter inkubasjon med UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 , UGT1A9, UGT1A10, UGT2B15 og UGT2B17. Minor metabolisme (mindre enn 3%) ble detektert med UGT1A3, UGT1A8, UGT2B4 og UGT2B7. 73,6% og 89,4% av belinostat ble omdannet til belinostat-G etter 2 timer og 4-timers inkubering med UGT1A1, henholdsvis (figur 4B). Enzym kinetiske parametere for glukuronidering av belinostat ble estimert ved å tilpasse samlede data fra de UGT1A1 inkubasjon utført i tre eksemplarer til Michaelis-Menten ligningen. De tilsynelatende Km og Vmax-verdiene for glukuronid formasjonen var 99,6 uM og 353,1 pmol /min /mg protein, respektivt (figur 5). Den iboende clearance (Vmax /Km) for dannelsen av belinostat-G ble anslått til å være 3,5 mL /min /mg protein. I kontroll insekt mikrosomer, ble det ikke observert belinostat-G-formasjon.
De tilsynelatende Km og Vmax verdier for glukuronid formasjonen var 99,6 mikrometer og 353,1 pmol /min /mg protein, henholdsvis.
korrelasjonen av glukuronidering av Belinostat med UGT underlag
i humanlevermikrosomer, ble sammenhengen mellom glukuronidering av belinostat og UGT underlag testet ved bruk av parametrisk (Personens korrelasjon) og ikke-parametrisk (Spearmans korrelasjon) tester. Belinostat-G formasjon korrelert sterkt med bilirubin glukuronid dannelse (Figur 6A) (Pearson r
2 = 0,53; Spearman r
2 = 0,61 p 0,0001) og andre veletablerte substrater av UGT1A1 som tyroksin og SN38 (Pearson r
2 = 0,68; Spearman r
2 = 0,81 og Pearson r
2 = 0,82; Spearman r
2 = 0,62, henholdsvis, alle p 0,001) (figur 6B og 6C). Belinostat-G konsentrasjoner etter inkubasjon med HLM korrelert godt med UGT1A1 mRNA uttrykk (Pearson, r
2 = 0,66, p 0,0001, figur 7A). Samlet utgjør disse tyder på at UGT1A1 er den dominerende UGT isoformen i belinostat glukuronidering
A:. Bilirubin-G; B: tyroksin-4-G /CPT-11; . C: SN38-G /CPT11
A: Korrelasjon av dannelsen belinostat glukuronid med UGT1A1 uttrykk i humanlevermikrosomer; B: Belinostat glukuronid formasjon ved humanlevermikrosomer henhold til villtype, heterozygot og homozygot UGT1A1 * 28 genotyper
UGT1A1 genotype og Glukuronidering av Belinostat i humanlevermikrosomer og korrelasjon med UGT1A1 Gene Expression
UGT1A1 er en polymorfe enzymet med allele varianter som påvirker dens enzymatisk aktivitet. UGT1A1 * 28 er en hyppig polymorfisme som reduserer glukuronidering aktivitet. Derfor, for å bestemme effekten av UGT1A1 * 28 på dannelsen av belinostat-G, målte vi belinostat-G konsentrasjoner etter inkubasjon av belinostat med hver av 37 HLM prøvene tidligere genotypet for
UGT1A1 * 28
. Den 30-min post-ruge belinostat-G konsentrasjoner (gjennomsnitt ± SD) var 15.39 ± 6.00, 11.35 ± 4.11 og 7.14 ± 3.28 mikromol for UGT1A1 * 1 homozygot, UGT1A1 * 28 heterozygote og homozygote mikrosomer, henholdsvis. En måte ANOVA-analyse viste at signifikant forskjell mellom gruppene ble funnet (p = 0,01). Tukey posthoc analyse antydet at bare forskjellen mellom UGT1A1 * 1 og UGT1A1 * 28 homozygot mikrosomer var statistisk signifikant. Som vist i figur 7B, UGT1A1 * 1 homozygot mikrosomer hadde to ganger større bety belinostat-G konsentrasjoner i forhold til UGT1A1 * 28 homozygot mikrosomer etter inkubasjon (
p
0,001)
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er dette den første rapporten beskriver glukuronidering av belinostat. Vi har vist at belinostat gjennomgår utstrakt metabolisme via glukuronidering skjer på hydroksamat del, som fører til inaktivering av dets cytotoksisitet. Dette er konsistent blant annet hydroksamat klasse HDAC hemmere også, der glukuronidering spiller en betydelig rolle i sin metabolisme. Den metabolittprofilering etter inkubasjon med et panel av supersomerer overekspresjon spesifikke UGT isoformer, korrelasjon med glukuronideringsprosessen forekomst av kjente UGT1A1 underlag ved hjelp humanlevermikrosomer, og analyse av massespektrometri profilen til belinostat i en kohort av pasienter med leverkreft gitt bevis for at belinostat glukuronidering
in vitro Hotell og
in vivo
medieres primært av UGT1A1. Interessant, enzymet isoformen som primært metaboliserer en annen hydroksaminsyre baserte HDAC-inhibitor vorinostat
in vivo
er UGT2B17, mens belinostat metaboliseres av UGT1A1, som er en mer rikelig isoform i den humane lever [31]. UGT1A1 er til stede i mage-tarmkanalen, noe som sannsynligvis vil redusere absorpsjon av belinostat, og føre til redusert biotilgjengelighet [32]. I tillegg vil den høye effektiviteten av UGT1A1 for metaboliserer belinostat sannsynlig redusere ytterligere sin oral biotilgjengelighet gjennom omfattende førstepassasjemetabolisme, utfordrer utvikling av oral belinostat.
De HDAC hemmere som er i klinisk utvikling har potensial for alvorlige bivirkninger. Noen klasserelaterte effekter inkluderer trombocytopeni, forlenget QT-intervallet i elektrokardiogram, alvorlig tretthet og mage-tarmbivirkninger, og disse synes å være doseavhengig. Belinostat har vært forbundet med tretthet, diaré og forlenget QT-intervall i fase I og II-studier [11], [33]. I lys av sin smalt terapeutisk vindu, er det viktig å bestemme de faktorer som Pharmacogenetics av belinostat som står for interindividuell variasjon av dets farmakokinetikk. Vi har tidligere vist at pasienter med slettede UGT2B17 lene har lavere vorinostat-glukuronid til vorinostat område-under-the-kurven forhold og større bivirkninger [20]. Følgelig vil det være viktig å forstå graden av interindividuell variasjon av belinostat farmakokinetikk og farmakodynamikk tilskrives polymorfe ekspresjon av UGT1A1. Vår studie i humanlevermikrosomer er første skritt i denne retningen.
UGT1A1 * 28 er en genetisk polymorfisme hos arrangøren regionen der en ekstra TA gjenta seg i den TATA boks som vanligvis har seks TA gjentar, og resulterer i redusert ekspresjon av UGT1A1 [34]. I menneskelige levermikrosomer, er glukuronidering av SN-38, den aktive metabolitten av irinotecan, mindre effektiv i mikrosomer husing UGT1A1 * 28 sammenlignet med villtype genotype [25]. Concordantly, individer med en eller flere av UGT1A1 * 28 lene oppleve høyere risiko for nøytropeni fra irinotecan behandling i doser som er høyere enn 250 mg /m
2 [35], [36]. Dette polymorfisme er også mer vanlig hos kaukasiere enn asiater, med en allel frekvens på ca 30% i kaukasiere og 10% i asiater [37]. Våre data viser at UGT1A1 * 28 er assosiert med redusert belinostat glukuronidering, noe som tyder på at pasienter med denne genotypen kan potensielt ha en høyere eksponering for aktiv belinostat som følge av nedsatt clearance av belinostat. Selv om de kliniske konsekvensene av dette høyere eksponering med den anbefalte dosen av belinostat er foreløpig ukjent, er høyere toksisitet til belinostat forventet. Hvis dette er bevist, UGT1A1 genotyping før belinostat terapi, som er tilgjengelig for irinotecan, er en måte å individualterapi.
Enten UGT1A1 * 28 påvirker farmakokinetikken og mer avgjørende farmakodynamikken til belinostat hos pasienter gjenstår å være studert; våre data støtter behovet for slike fremtidige studier i pasienter.
