Abstract
Evnen Interleukin-15 (IL-15) for å aktivere mange immunantitumor mekanismer gjengir cytokinproduksjon en god kandidat for behandling av solide svulster, særlig nyrecellekarsinom. Selv om IL-15 blir i dag brukt i kliniske studier, funksjonen til cytokin på nyre komponenter har ikke blitt grundig studert; Vi undersøkte derfor rollen til IL-15 på normale og tumor renale epitelceller. Heri, analyserte vi uttrykket og de biologiske funksjoner av IL-15 i normal nedsatt proksimale tubuli (RPTEC) og i deres neoplastiske kolleger, nyre klare cellekreft (RCC). Denne studien viser at RPTEC uttrykke en funksjonell heterotrimeric IL-15Rαβγc kompleks som stimulering med fysiologiske konsentrasjoner av rhIL-15 er tilstrekkelig til å hemme epitelial mesenchymale overgang (EMT) engasjement bevare E-cadherin uttrykk. Faktisk, er IL-15 ikke bare en overlevelsesfaktor for epitelceller, men det kan også bevare den renale epiteliale fenotype gjennom γc-signalveien, noe som viser at cytokinet har et bredt virkningsområde i epitelial homeostase. I motsetning til i RCC
in vitro Hotell og
in vivo
studier viser en defekt i uttrykket av γc-reseptor og JAK3 assosiert kinase, som sterkt påvirker IL-15 signalering. Faktisk, i fravær av γc /JAK3 par demonstrerer vi montering av en enestående funksjonelle høyaffinitets-IL-15Rαβ heterodimer, som i respons til fysiologiske konsentrasjoner av IL-15, utløser et ubalansert signal som forårsaker nedregulering av tumor suppressor gen E-cadherin, favoriserer RCC EMT prosess. Bemerkelsesverdig, redning av IL-15 /γc avhengig signale (STAT5), ved co-transfeksjon γc og JAK3 i RCC, hemmer EMT hjemfall. Som konklusjon Disse data fremheve den sentrale rollen til IL-15 og γc-reseptorsignalisering i renal homøostase gjennom kontroll av E-cadherin ekspresjon og preservering av epitel-fenotype både i RPTEC (opp-regulering) og RCC (nedregulering).
Citation: Giron-Michel J, Azzi S, Khawam K, Mortier E, Caignard A, Devocelle A, et al. (2012) Interleukin-15 spiller en sentral rolle i Human Kidney fysiologi og kreft gjennom γc signalveien. PLoS ONE 7 (2): e31624. doi: 10,1371 /journal.pone.0031624
Redaktør: Eliane F. Meurs, Institut Pasteur, Frankrike
mottatt: 15 april 2011; Godkjent: 16 januar 2012; Publisert: 21 februar 2012
Copyright: © 2012 Giron-Michel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Agence Française de biomedisin, ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer) (N ° RAC11005LLA), Inca, NRB-Vaincre le Cancer, AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) IG prosjekt 5642 og italienske departementet Helse. S.A. var mottaker av ARC og NRB-Vaincre le Cancer doktorgradsstipend. K.K. var en mottaker av doktorgradsstipend fra Société Française de Néphrologie, ARC og NRB-Vaincre le Cancer. M.C. var en mottaker av et fellesskap fra Fondazione Italiana per la Lotta al neuroblastom. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
interleukin-15 (IL-15) er en pleiotropisk cytokin som er involvert i medfødt immunitet så vel som funksjoner utenfor immunsystemet. IL-15 funksjonelle mangfold forklares delvis av dets komplekse virkningsmekanismer [1], [2] som involverer ikke bare løselig og membran former av cytokiner, men også forskjellige IL-15 reseptorer (IL-15R) med spesifikke slektskap og signaltransduksjon trasé [3], [4]. Faktisk, IL-15 binder seg til IL-15Rα privat kjede med høy affinitet (Kd≥10
-11 M), som leverer et spesifikt signalisering i respons til IL-15 (NF-kB, Syk). IL-15 aksjer med IL-2 IL-2Rβ (CD122) og IL-2Rγ (CD132, γc) subenheter som danner enten en funksjonell reseptor for høy (IL-15Rαβγ, Kd≥10
-11 M) eller mellomliggende affinitet (IL-15Rβγ, Kd = 4 nM) for IL-15, slik at signaliserer gjennom en kaskade som involverer JAK /STAT, MAPK og PI3-K overføringsveier.
den vanlige γc reseptor-kjeden er en viktig del av de fire-helix-bundle cytokiner familie, slik at gjennom sin tilknytning til Janus tyrosinkinase 3 (JAK3), aktivering av STAT molekyler (Signal Givere og aktivatorer av transkripsjon) [5]. JAK3 phosphorylates ulike nedstrøms statistikk, i forhold til den type reseptor kompleks involvert. Således, IL-4 signaler hovedsakelig gjennom STAT-6, mens IL-2, IL-7, IL-9 og IL-21 handling gjennom STAT-1 og STAT-3 og IL-15 i hovedsak aktiverer STAT-5 [6], [7], [8]. Både γc og JAK3 er avgjørende for funksjonen av alle cytokinreseptorer i denne familien, og er nødvendig for utvikling av lymfoid cellesystem. Faktisk genetiske defekter i γc eller JAK3 resulterer i en alvorlig kombinert immunsvikt (SCID), karakterisert ved mangel på T, B og NK-celler i både mus og mennesker [9], [10], [11]. Det må imidlertid sies at i SCID-pasienter, kan korrigerende genterapi for γc fungere som en bidragsyter til dannelsen av cellelymfom [9], [11]. IL-2Rγ kjeden er også uttrykkes i ikke-lymfoide celler og detekteres for eksempel på visse tumor epitelceller [12], [13], [14], hvor mengden av γc er involvert i mekanismene som regulerer cellevekst. IL-2Rγ er også funnet i normale epitelceller hvor det modulerer signaltransduksjon av forskjellige medlemmer av γc familien selv om sine spesifikke biologiske funksjoner ennå ikke er klart definert [13], [15], [16].
humane epitelceller fra forskjellige vev produserer IL-15, som virker ikke bare på immunceller (for eksempel, IELs i tarmen), men også på epitelceller, hovedsakelig via sin anti-apoptotiske virkning [17], [18] , [19], [20]. Således ble det vist at humane og musenyre tubulære epitelceller (RPTEC) konstitutivt uttrykker reseptoren IL-15Rαβγ [15] og utskiller cytokin IL-15 [21], som spiller en viktig rolle i renal fysiologi som en autokrin overlevelsesfaktor . Faktisk økt følsomhet av celler til apoptose er observert i den skadede nyre av IL-15 – /-, IL-15Rα – /- knockout mus eller i løpet av akutte nyreskade indusert ved forskjellige protokoller som induserer en reduksjon i IL-15 produksjon med epithelial -celler [20], [22]. IL-15 forbedrer tarmbarrierefunksjon ved å fremme dannelsen av tett veikryss mellom epitelceller [23]. Disse resultatene tyder på at IL-15 overlevelsesfaktor kan ha andre funksjoner, som gjenstår å bli utforsket i renal epitel-celler [15], [24], [25], [26].
På grunn av sin immuno -stimulating aktivitet i flere prekliniske modeller, kan bruk av IL-15 er et cytokin som nyttig for behandling av nyrekreft. Selv om IL-15 blir nå testet i kliniske forsøk for behandling av nyrekreft (NCT01021059 Protocol) [2], forblir funksjoner av cytokin til normale epitelceller samt tumorceller lite studert. For bedre å forstå funksjonene i cytokin, foreslår vi å studere IL-15 /IL15R system på menneskelige nyre epitelceller normal opprinnelse (RPTEC) og på celler av tumor opprinnelse (RCC).
dataene viser at både
in vitro og in vivo
primære normale proksimale nyretubuli celler (RPTEC) uttrykker IL-15Rαβγ reseptoren, mens uttrykk for γc kjeden og JAK3 er sterkt svekket i nyre klare kreftceller (RCC) . Differensial uttrykk for γc kjeden og JAK3 har en markant innvirkning på nyre homeostase siden løselig IL-15 i RPTEC gjennom γc kjeden signalveien bevarer uttrykk for tumorsuppressorgenet E-cadherin, begrenser deres epitelial-mesenchymale overgang (EMT) engasjement . I motsetning til dette tap av γc kjeden og JAK3 i primær RCC fører til dannelsen av en enestående funksjonelle IL-15Rαβ høy affinitet heterodimer, hvis stimulering med løselig IL-15 forårsaker nedregulering av E-cadherin uttrykk som favoriserer EMT prosessen .
Materialer og Metoder
Antistoffer, cytokiner, og reagenser
Antistoffer (ABS) mot IL-15 (L-20), IL-15Rα (sc-9172) IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Rγ (sc-670), JAK3 (sc-513), og vimentin (SC-73260) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Antistoffer mot fosforylert ERK (4377), fosforylert IKB (4921), STAT5 (9358) fosforylert STAT5 (9356), og Alexa Fluor-konjugert kanin monoklonalt antistoff mot fosforylert STAT5 (3939) ble hentet fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistoffer mot IL-15Rα (AF247), E-cadherin (AF648) og PE-konjugert anti-E-cadherin (FAB18381P) ble oppnådd fra R R 5′-TGCCTGTGGCCCTGTGGATA; IL-2Rβ F 5′-GAATTCCCTGGAGAGATGGCCACGGTCCCA; R 5′-GAATTCGAGGTTTG GAAATGGATGGACCAAGT; γc kjeden F 5′-CCAGGACCCACGGGAACCCA; R 5′-GG TGGGAATTCGGGGCATCG; JAK3 F 5′-CGTTCATGCAGCCTCTTGTTC; R 5′-GCGCA CCGTCCTCCGAATAC; β-actin F 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA; R 5′-CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC.
IL-15 bmdingsanalyser
Menneske rIL-15 var radiomerket med jod (spesifikk radioaktivitet ca 2000 kpm /fmol) med en kloramin-T-metoden og bindende eksperimenter ble utført som beskrevet tidligere [30]. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 100 gangers overskudd av umerket cytokin. For IL-15 bindingsforsøk, ble RCC7 cellene inkubert med økende konsentrasjoner av merket rIL-15. Regresjonsanalyse av bindingsdata ble utført ved å bruke en én-site likevektsbindings ligning (Grafit, Erithacus Software, Staines, UK), og data ble plottet i Scatchard-koordinatsystemet. For inhibering av IL-15 bindingsforsøk, ble RCC7-celler inkubert i nærvær av økte konsentrasjoner av jodert rIL-15, og fast konsentrasjon av nøytraliserende antistoffer mot IL-2Rβ (Mikβ1, 10 ug /ml) eller IL-2Rγ (mAB2842 , 1 ug /ml) kjeder. Regresjonsanalyse av data ble utført ved hjelp av en 4-parameter logistikk ligning (Grafit, Erithacus Software).
plasmider og transient transfeksjon
pCMV6 vektor koding full-lengde cDNA Myc-DDK-merket ORF av human interleukin 2 reseptor-gamma (IL2Rγ) ble innkjøpt fra Origene Technologies Inc (Rockville, MD, USA) og i full lengde human JAK3 cDNA subklonet mellom de EcoRI-Xhol-restriksjonssetene i
pcDNA3.1
eukaryot ekspresjonsvektor var en slags gave fra Dr. Franck Gesbert (UMR1004, Inserm, Frankrike). Plasmider ble forvandlet til Topp 10 kompetente bakterieceller i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, California), hentet ved hjelp av en Maxiprep kit (Qiagen, Valencia, CA), og forsterket av kultur i Luria-Bertani-ampicillin buljong. cDNA ble transient transfektert inn i cellene i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut i seks-brønns plater (0,25 x 10
6 celler /brønn) og dyrket over natten i komplett medium. Den forbigående blanding, som inneholdt 1,0 ug av plasmid-DNA og 6 ul av Fugene 6 transfeksjon reagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) i 100 ul serumfritt DMEM-medium (Invitrogen), ble blandet i 20 minutter ved romtemperatur og deretter tilsatt til hver brønn med komplett medium i 48 timer. Den tomme
pcDNA3.1
vektor ble transfektert som kontroll.
flowcytometri Analyser
For alle analyser som er beskrevet nedenfor, anskaffet vi fluorescens data for 10.000 celler på en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences) og dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest programvare (BD Biosciences). Tre replikater ble anvendt for hver tilstand og forsøket ble gjentatt minst tre ganger.
Ekspresjon av cellulære antigener.
Ekspresjon av celleoverflate (E-cadherin) og intracellulær (vimentin, Pan- CK) antigener ble analysert ved flowcytometri, som tidligere beskrevet [29], [31], [32]. I korthet, ble suspensjoner av enzymatisk frigjorte celler permeabiliserte eller ikke med BD Cytofix /Cytoperm reagens (BD Pharmingen, Le Pont De Claix, Frankrike), og 10
5-celler ble oppslemmet i RPMI-medium supplert med 1% FCS og farget med konjugert antistoffer rettet mot de ovennevnte cellemarkører. Deretter ble cellene fiksert ved inkubering med 1% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 20 minutter ved romtemperatur og analysert ved strømningscytometri.
STAT5 Aktivering.
Vi undersøkte STAT5 aktivering i RCCWT (RCC vill type) og IL-2Rγ og /eller JAK3-transfektert RCC ved behandling av cellene med 10 pg /ml av rhIL-15 i løpet av 40 minutter. Behandlede og ubehandlede celler ble løsnet med trypsin, vasket og fiksert ved inkubering med 1% paraformaldehyd i PBS i 20 minutter ved romtemperatur. Cellene ble permeabilisert ved resuspensjon, med vortexblanding, i is-kald metanol og inkubert ved 4 ° C i 10 minutter. Cellene ble vasket i 1% BSA i PBS og inkubert med en Alexa Fluor 488-konjugert mus monoklonalt antistoff mot fosforylert STAT5 i 60 minutter ved 4 ° C.
Immunoutfellingsunder og Immunoblotanalyse Analyser
Alle immunoblotting (IM) ble utført som tidligere beskrevet [29]. For immunoutfelling, ble PBS-vasket cellepelleten lysert i 1 ml 1% NP-40 og 0,1% SDS, 50 mM natriumfosfatbuffer pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM natriumortovanadat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM AEBSF, aprotinin, leupeptin og pepstatin (5 ug /ml hver gang). Etter 15 min risting ved 4 ° C ble suspensjonen sentrifugert (30 minutter ved 14.000 rpm, 4 ° C). Supernatanten ble tilsatt til 20 ul Sepharose-konjugert-M161 (anti-IL-15Rα, 2 ug /ul). Etter 4 timer omrøring ved 4 ° C, ble immunkompleksene ble vasket 5 ganger med 1 ml lyseringsbuffer og tilført på 10% PAGE-SDS. Blottene ble behandlet som tidligere beskrevet [29].
Immunocytochemistry
Celler ble fordelt i åtte-brønns avdelinger av Lab-Tek vevskultur kammer lysbilder (1 × 10
5 celler per brønn ;. Nunc, Naperville, Illinois) og ved konfluens, behandlet eller ikke med 10 pg /ml av rhIL-15 i 5 dager. For farging av membranen, ble cellene fiksert med kald methanol:acetone (01:01) ved -20 ° C i 10 minutter, vasket og deretter blokkert med PBS 3% BSA i 60 minutter. Celler ble inkubert med anti-human E-cadherin eller FITC-konjugert anti-ASO2 antistoff over natten ved 4 ° C. Deretter ble cellene vasket, inkubert i 30 minutter med en AlexaFluor488-konjugert kanin anti-geite antistoff. For intracellulær farging ble cellene fiksert med 4% (vekt /volum) paraformaldehyd i PBS og permeabilisert ved inkubasjon i 1 minutt med 0,5% Triton X-100 i PBS. Cellene ble inkubert med blokkeringsoppløsning (3% BSA i PBS) og inkubert over natten ved 4 ° C med de ulike antistoffene. Cellene ble deretter vasket og inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert kanin-anti-mus eller anti-geit-IgG fortynnet i blokkeringsløsning og inkubert i 30 minutter. F-aktin organisasjon ble åpenbart farging av cellene med 0,2 ug /ml av rhodamin-konjugert phalloidin i 20 minutter. Cellene ble vasket med PBS, montert i 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike), og visualisert ved fluorescens mikroskopi (Leica, Tyskland).
Immunhistokjemi på parafin- Embedded nyretumor og normale prøver
Biopsi fra 3 normal og 10 kreft seksjoner fra nefrektomisert nyrene med nyrecellekarsinom ble delt på 4 pm på Superfrost pluss lysbilder. Deparaffinized glass ble rehydratisert i graderte alkoholer, og underkastes varme-indusert epitop gjenfinning ved å dyppe dem i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0). Seksjoner ble inkubert over natten ved 4 ° C med anti-IL-2Rβ (AB364), anti-IL-2Rγ (sc-670) eller anti-JAK3 (07-1488) Abs, PBS-vasket og inkubert med HRP-sekundært Ab for 45 min. Analysene ble utført ved hjelp av standard metoder ved hjelp diaminobenzidine etter kontra seksjonene med hematoksylin. Den negative kontrollen ble underkastet alle behandlinger utelate primært antistoff. Lysbilder ble skannet med en Aperio scanner (Vista, CA) og farging ble kvantifisert ved hjelp av en morfometrisk TRIBVN programvare (Montrouge, Frankrike).
Resultater
IL-15R uttrykk i RPTEC og RCC primærkulturer
for å belyse funksjonen av IL-15 i nyre menneskelige modellen, undersøkte vi uttrykket av IL-15 reseptor subenheter (IL-15Rαβγ) på primærkulturer av normal proksimale nyretubuli epitelceller ( RPTEC) og klar celle renal karsinom (RCC).
RT-PCR-analyse (figur 1A, øvre panel) viser at RPTEC, i samråd med den positive PBL kontroll, uttrykker ulike transkripsjoner for IL-15Rα kjede ( 432 og 531 bp), transkripsjon for IL-15Rβ (542 bp) og karakterutskrift for γc kjeden (480 bp). I motsetning til dette, bare IL-15Rα og p-kjeder, men ikke den γc kjede, ble detektert enten på RCC (RCC5 og RCC7) eller ACHN-cellelinje. Siden JAK3 kinase interagerer spesifikt med kognatreseptoren γc kjeden, og ekspresjon av begge molekyler er gjensidig avhengig [33], vi videre analysert ved RT-PCR, JAK3 ekspresjon i normale og tumornyreceller (figur 1A, nedre panel). JAK3 kinase ble påvist i den positive kontroll hematopoietiske cellelinje TF1β og RPTEC, mens en svak budbringer mengde eller fraværende (RCC8) ble detektert i RCC analysert. Ingen JAK3 messenger ble detektert i MCF-7-styrecellen [34].
Analyse av IL-15R og JAK3 ekspresjon ble utført ved hjelp av RT-PCR (A) og immunoblotting (B) på primær normal (RPTEC) og tumoral (RCC5, RCC7, RCC8) epitelceller og ACHN-cellelinjen. Data viser at RPTEC uttrykke de tre kjeder av IL-15R (αβγ) og JAK3 mens γc og JAK3 proteiner ikke ble påvist i RCC. Spesifikke primere eller Abs mot IL-15Rα (AF247), IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Rγ (sc-670) og JAK3 (sc-513) ble anvendt. PBL, TF1β, MCF7 og IFNy-aktiverte U937-celler ble brukt som kontroller. Housekeeping β-actin ble brukt som lasting kontroll.
For å bekrefte differensial uttrykk for reseptorsubenheter og JAK3 kinase på proteinnivå, immunoblotting ble utført på både normale og tumorceller. Analysen bekreftet at RPTEC, RCC og TF1β celler uttrykker to store band av 46 og 56 kDa spesifikt for IL-15Rα (figur 1B, øvre panel) og et 75 kDa bånd for IL-15Rβ kjeden (figur 1B, midtre panelet) . Fraværet av den γc kjeden i RCC ble bekreftet siden den 64 kDa-båndet blir detektert utelukkende i positive kontrollcellelinjer (TF1β og IFN-γ behandlede U937) og RPTEC (figur 1B, midtre panel). JAK3 molekyl (116 kDa) ble påvist i TF1β og RPTEC celler, mens immunoblotting ikke oppdage kinase i RCC, så vel som i MCF-7 og IFN-γ behandlede U937 kontrollcellelinjer som tidligere rapportert [34], [35] (figur 1B, nedre panel). I alle ovennevnte eksperimenter, vi også studert nedsatt ATCC-CRL-1611 cellelinje (ACHN) som viser IL-15R og JAK3 uttrykk homolog til de som ble observert i RCC primærprøver.
Tap av γc kjeden i nyre klarcellet karsinom vevsprøver
for å bekrefte våre
in vitro
data, IL-2Rβ kjeden, γc kjetting og JAK3 immunhistokjemiske stainings ble utført på normale og svulst deler av nefrektomisert nyrene med nyrecelle carcinoma. Hematoxylin farging av parafin-innleiret humane nyre seksjoner avdekket i henhold lysmikroskopi nærvær av glomeruli (Gl) og flere fjerntliggende (Dt) og proksimal (Pt) rørelementene i de normale vevsprøver (figur 2). I motsetning til disse nyre strukturene ikke lenger er til stede i nyrekreft snitt, som viser tumorceller med klar cellemorfologi, karakterisert ved optisk klar cytoplasma og skarpt skissert cellemembranen.
Hematoxylin farging av biopsier fra 2 normale prøver viser nærværet av de normale nyrestrukturer (glomerulus (Gl), distal (Dt) og proksimal (PT) tubuli), mens analysen av to forskjellige kreft prøver viser at den normale vev arkitekturen er helt tapt og blir erstattet av tumorceller med klare celle morfologi, karakterisert ved optisk klar cytoplasma og skarpt skissert cellemembranen. Mens det ikke observert noen forskjell i IL-2Rβ mellom normale og tumor vevsprøver, IL-2Rγ flekker, lokalisert til både proksimale og distale tubuli i normale vevsprøver, ikke er funnet i tumorprøver. En sterk JAK3 farging er lokalisert til både proksimale og distale tubulære celler fra normale vev, mens en meget svak JAK3-protein ekspresjon blir registrert i tumorprøver. To representative prøver av totalt ti er for hver farging. Negativ kontroll ble utsatt for alle behandlinger utelate primært antistoff. Skala barer, 50 mikrometer. Farging ble kvantifisert ved hjelp av en morfometrisk TRIBVN programvare (Montrouge, Frankrike) og resultatene er presentert som histogrammer.
Immunhistokjemisk farging på to forskjellige normale nyreprøver viser at IL-2Rβ kjeden, γc kjede og en sterk JAK3 uttrykk blir oppdaget på proksimale og distale rørformede celler. I motsetning til analyser av forskjellige tumorprøver viste fravær av γc kjede farging (P 0,01) med en meget svak JAK3-protein ekspresjon (P 0,01), mens ingen signifikante forskjeller (P 0,05) i ekspresjon av IL-2Rβ ble observert kjeden mellom normale og svulstvevet derfor bekrefter resultatene oppnådd
in vitro
i primærkulturer av normale celler og kreftceller.
Løselig IL-15 utløser en differensial celle signal i RCC og RPTEC
Så vidt vi vet, IL-15Rαβ heterodimer ble bare beskrevet i IL-2Rγ – /- knockout mus, som viser en effektiv binding og endocytose av radiomerket IL-15 [36]. Imidlertid gjorde forfatterne ikke undersøke om IL-15Rαβ heterodimer eksisterer som en ford kompleks eller er dannet etter IL-15 bindende og dermed generere en funksjonell heterodimer.
For å evaluere IL-15 bindende γc-negative RCC, vi først analysert radioaktivt merket rekombinant, humant IL-15 (rhIL-15) binding til RCC7 celler ved Scatchard plot-analyse (figur 3A). Dataene viser tilstedeværelsen av en enkelt klasse av høyaffinitets-reseptorer (Kd = 375 pM, 413 IL-15 bindingsseter per celle). Spesifikk IL-15 binding ble fullstendig opphevet ved at anti-IL-2Rβ mAb Mikβ1 (figur 3A, innfelt), mens nøytraliserende anti-IL-2Rγ mAb hadde ingen effekt på spesifikk IL-15 binding, noe som tyder på at bindings faktisk reflekterte nærvær av en IL-15Rα /IL-2Rβ kompleks
A) Scatchard plot-analyse.: Effekt av anti-IL-15Rβ og γc mAb’er på IL-15-binding til RCC. For IL-15 bindingsforsøk, ble RCC7 cellene inkubert med økende konsentrasjoner av radiojodert rIL-15 i nærvær eller ikke av de følgende nøytraliserende mAbs: anti-IL-2Rβ og IL-2Rγ. Den ikke-spesifikk celle-binding ble bestemt i nærvær av radiojodert rhIL-15 og et 100-gangers overskudd av umerket rhIL-15. Celle-bundet (B) og ubundne (frie, F) fraksjonene ble målt, og den spesifikke bundne fraksjon ble beregnet ved å subtrahere den ikke-spesifikke binding fra den celle-bundet fraksjon. På ordinaten er plottet forholdet mellom den spesifikke bundne fraksjon (uttrykt i seter pr celle) over den totale konsentrasjon (bundet pluss fri) av radiojodert rIL-15 (uttrykt i pM). På abscissen bundet fraksjon (uttrykt i områder per celle). Den høye affinitet spesifikke IL-15-binding (Kd = 375 pM, 413 IL-15 bindingsseter per celle), som ble fullstendig opphevet ved nøytraliserende antistoff mot IL-2Rβ (innfelt), men ikke den γc kjeden, antydet nærværet på RCC av en IL-15Rα /IL-2Rβ kompleks. B) Bestemmelse av IL-15Rαβ komplekset ved immunutfelling (IP) med anti-IL-15Rα (M161) eller mus-IgG-protein G-Sepharose-konjugat på total lysat (TL) av RCC7. Immunoutfelt kompleksene ble blottet enten med anti-IL-2Rβ (sc-1046) og anti-IL-15Rα (sc-9172). C) Stimulering for 10 og 40 min med fysiologisk (10 pg /ml) og supra fysiologisk (10 ng /ml) konsentrasjoner av rhIL-15 induserer fosforylering av MAPK ERK1 /2 og IκBα i RPTEC og RCC7, mens STAT5 aktivering var bare observert i RPTEC. Histograms representerer densitometry sammenligning av hver faktor normalisert p-aktin i tre forskjellige RCC (RCC5, RCC7, RCC8) og 3 RPTEC grupper. * P 0,05 versus kontroll, Mann-Whitney-testen. Ett eksperiment representant for totalt tre er vist.
For å bekrefte tilstedeværelse av en IL-15Rα /IL-2Rβ kompleks heterodimer, potensielle interaksjoner mellom IL-15Rα og IL-2Rβ kjedene i RCC ble undersøkt utføre ko-immunoutfellingsstudier eksperimenter på RCC7 cellelysater ved immunadsorpsjon til Sepharose-konjugert anti-IL-15Rα (M161) (figur 3B). Anti-IL-2Rβ immunblot avslører tilstedeværelse av et spesifikt 75 kDa-protein (øvre panel), mens anti-IL-15Rα blot, utført på den samme membranen, viser ekspresjon av spesifikke bånd av 56 og 46 kDa (nedre panel) som indikerer at IL-2Rβ og IL-15Rα reseptorunderenhetene er konstitutivt tilknyttet, danner en IL-15Rαβ heterodimer i fravær av cytokinet.
for å bestemme hvorvidt IL-15Rαβ kompleks uttrykt på RCC er funksjonell, vi undersøkt signaltransduksjon aktivering i normale og tumor renale celler behandlet med fysiologisk (10 pg /ml) og supra fysiologisk (10 ng /ml) konsentrasjoner av rhIL-15 (figur 3C). Stimulering med rhIL-15 (10-40 min) indusert i RCC7 fosforylering av MAPK ERK1 /2 ved begge konsentrasjoner, mens ingen STAT5 fosforylering ble observert selv i nærvær av 10 ng /ml rhIL-15 (figur 3B, øvre panel ). I motsetning til dette, i RPTEC uttrykker heterotrimeric-reseptor-komplekset, ble aktiveringen av MAPK ERK1 /2 og STAT5 indusert som reaksjon på 10 pg /ml og 10 ng /ml av rhIL-15. Videre er det en hurtig fosforylering av IκBα, en nøkkel hendelse i aktivering av transkripsjonsfaktor NF-kB, i RPTEC og RCC7 som respons på fysiologisk rhIL-15-konsentrasjonen (figur 3B, nedre panel), noe som indikerer at IL-15Rαβ kompleks binder IL-15 ved høy affinitet og er funksjonell.
Løselig IL-15 kontroller E-cadherin uttrykk på nyre epitelceller
E-cadherin er ansvarlig for å opprettholde interaksjoner av epitelceller og er ofte nedregulert i løpet av tumorprogresjon [37]. Således undersøkte vi effekten av rhIL-15 på E-cadherin ekspresjon på både RCC7 og RPTEC ved immunofluorescens-analyse (figur 4A) og immunoblotting (figur 4B). For å evaluere effekten av rhIL-15 på normal RPTEC, vi brukte en celle modell der berøvelse av kortikosteroider, som er kraftige indusere av E-cadherin [38], sammen med fraværet av daglig medium fornyelse fører i løpet av fem dager til reduksjon av E-cadherin uttrykk, uten å påvirke cellenes levedyktighet (97%, data ikke vist). Immunofluorescens-analyse (figur 4A) viser at normale epitelceller RPTEC i de første passasjene (p2) for å vise et epitelial-lignende morfologi kjennetegnet ved en høy grad av membran E-cadherin uttrykket (basal d0) i motsetning til fem dager gamle RPTEC (basal d5 ) som viser lav E-cadherin uttrykk i fravær av daglig medium fornyelse. Tilsetning av 10 pg /ml av rhIL-15 i løpet av fem dager bevarer den opprinnelige E-cadherin nivå og dermed en epitel-lignende morfologi. I motsetning til RPTEC, RCC7 på dag 0 og dag 5 skjerm en svak E-cadherin uttrykk, som forsvinner etter 5 dager med rhIL-15 behandling (Figur 4A). Immunblotanalyse (figur 4B) viser tydelig de motsatte virkninger av rhIL-15 for ekspresjon av den modne 120 kDa E-cadherin formen på RPTEC versus RCC (dag 5).
Immunofluorescensanalyse (A) og immunoblot ( B) viser at 5 dager rhIL-15-behandling (10 pg /ml) bevarer membran E-cadherin uttrykk på primær normal epitelceller RPTEC, mens det induserer sin nedregulering på RCC7. Mediet kultur av RPTEC ble ikke forandret for å fremkalle reduksjon av E-cadherin uttrykk. Behandling med rhIL-15 ble fornyet på dag 3. Histograms representerer densitometry sammenligning av E-cadherin immunoblotter normalisert p-aktin i tre forskjellige RCC (RCC5, RCC7, RCC8) celler og 3 RPTEC grupper.
