Abstract
ezrin tilhører ERM (ezrin-radixin-moesin) protein familie og har vist seg å regulere tidlige trinn av Fas reseptor signalisering i lymfoide celler, men dens bidrag til TRAIL-indusert celledød regulering i adherente kreftceller er ukjent. I denne studien rapporterer vi at regulering av Fasl og TRAIL-indusert celledød ved ezrin er celletype avhengig. Ezrin er en positiv regulator av apoptose i T-lymfom-cellelinje Jurkat, men en negativ regulator i tykktarmskreftceller. Bruke ezrin fosforylering eller aktin-bindende mutanter, gir vi bevis for at negativ regulering av død reseptor-indusert apoptose av ezrin oppstår i en cytoskeleton- og DISC-uavhengig måte, i tykktarm kreft celler. Bemerkelsesverdig, hemming av apoptose indusert av disse ligandene ble funnet å være tett forbundet med regulering av ezrin fosforylering av serin 66, tumor suppressor-gen WWOX og aktivering av PKA. Mangel på WWOX uttrykk i leveren kreft SK-HEP1 eller bukspyttkjertelen Mia Paca-2 cellelinjer samt WWOX stanse eller modulering av PKA aktivering av farmakologiske regulatorer, i tykktarmskreft cellelinje SW480, opphevet regulering av TRAIL signalering av ezrin. Til sammen våre resultater viser at døds reseptor pro-apoptotiske signalregulering av ezrin kan oppstå nedstrøms av DISC i tykktarm kreft celler
Citation. Iessi E, Zischler L, Etringer A, Bergeret M, Morle A, Jacquemin G , et al. (2015) Død Receptor apoptose Signale Regulering av ezrin Er Celletype Avhengig og forekommer i en DISC-uavhengig måte i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 10 (5): e0126526. doi: 10,1371 /journal.pone.0126526
Academic Redaktør: Shi-Yong Sun, Emory University, USA
mottatt: 07.01.2015; Godkjent: 03.04.2015; Publisert: May 26, 2015
Copyright: © 2015 Iessi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det europeiske fellesskap (ApopTrain Marie Curie RTN), programmet «Investissements d’Avenir» med henvisning ANR-11-LabX -0021-01-Lipstic LABEX startet, Universitetet i Bourgogne, Conseil Regional de Bourgogne, Inca (Institut National du Cancer, polynom-174), den Cancéropôle Grand-Est, Ligue Nationale contre le Cancer, ARC (Association pour la recherche sur le Cancer), og departementet for forskning og utdanning. EI, SS, LZ og AM ble støttet av stipend fra Marie Curie RTN, Inca, kapper (N ° BEX4938 /14-3) og Ligue Nationale Contre le Cancer, henholdsvis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL eller Apo2L) induserer celledød i en rekke forskjellige kreftceller, men ikke i normale celler. Dette særegenhet gjør TRAIL og TRAIL derivater nyskapende og lovende terapeutiske midler mot ondartede sykdommer. TRAIL utløser celledød ved binding til to trans agonistiske reseptorer: TRAIL-R1 (DR4) [1-3] og TRAIL-R2 (DR5) [1, 2, 4, 5], som inneholder innenfor sine intracellulære region et Død Domain (DD ), som er avgjørende for å utløse apoptose. Aktivering av TRAIL-R1 /TRAIL-R2 gjør rekruttering av adapteren protein FADD og proforms av caspase-8 og -10 for å danne makromolekylære kompleks kalt DISC (Døden fremkallende Signale Complex) [6]. Innenfor dette komplekset, er caspase-8 og -10 aktiveres av auto-proteolytisk spalting og utgitt i cytosol slik aktivering av effektor caspases [7].
Som TRAIL reseptorer, Fas, også skapt CD95 eller APO-en signaliserer apoptose gjennom dannelsen av en DISC [8]. Eksperimentelle bevis indikerer at Fas-binding til aktin cytoskjelettet gjennom ezrin primer humane CD4 + T-lymfocytter for Fas-mediert apoptose [9, 10]. CD4 T-celleaktivering, gjennom enten HIV-1 gp120 eller IL-7, og gjengir CD4 T-celler utsatt for Fas-mediert apoptose gjennom ezrin-Fas-binding, og derfor til apoptose av bystander uinfiserte T-celler i AIDS-pasienter [11, 12]. I T-lymfomer slik som Jurkatceller, ble ezrin vist å binde Fas, og til å være nødvendig for å utløse celledød [13]. Men ezrin ble også foreslått, i en annen studie, for å hemme Trail-og Fas ligand-indusert celledød i T-celle lymfomer [14].
ezrin er medlem av ezrin, radixin, moesin (ERM) familie av proteiner, som kobler forskjellige integrerende membranproteiner til aktin cytoskjelettet [15]. ERM proteiner er vanligvis til stede i cytoplasma i en inaktiv /lukket form, hvori den amino-terminale membranprotein-bindende domene (FERM eller N-ERMAD domene) er maskert på grunn av sin forbindelse med karboksyl, actin-bindende domene (C -ERMAD). ERM aktivering foreslås å skje gjennom fosforylering og binding av phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP
2) [16].
Fosforylering av ezrin på treonin 567 induserer en overgang til åpen /aktiv form, som korrelerer med sin rekruttering til plasmamembranen, hvor det binder membranmolekyler. Andre fosforyleringsseter på ezrin er beskrevet. Fosforylering på tyrosin rester 145 og 353, f.eks i respons til epidermal vekstfaktor fremmer overlevelse [17] og epitelial differensiering [18]. Src-mediert fosforylering ezrin på tyrosin 145, øker adhesjonen av epitelceller til ekstracellulær matriks [19], mens fosforylering av serin 66 av proteinkinase A (PKA) er forbundet med syresekresjon i mage-celler [20].
Vi her videre utforske funksjon ezrin i TRAIL veien. Vi viser at ezrin fosforylering på serin 66 selektivt bidrar til TRAIL-indusert celledød regulering nedstrøms TRAIL DISC i tykktarm kreft celler.
Materialer og metoder
Ligand produksjon og antistoffer
Flag-merket rekombinant humant TRAIL, Hans-merket sti og Fas ligand ble produsert og brukt som beskrevet tidligere [21]. Anti-Flag (M2), ble 8-brom-cyklisk AMP, Forskolin og ortovanadat innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Lyon, Frankrike). PKA-hemmer, H89 var fra Cayman (Interchim, Montluçon, Frankrike). For western blot analyse, ble anti-TRAIL-R1 og anti-TRAIL-R2 antistoffer kjøpt fra Chemicon (Millipore, Molsheim, Frankrike), anti-FADD, anti-fosfor-ezrin (Thr567) og anti-moesin ble innhentet fra Transduction Laboratories (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike), anti-caspase-8 og anti-caspase-10 var fra Medical Biologisk Laboratories (Clinisciences, Montrouge, Frankrike). Antistoffer mot fosfor-ezrin (Thr567) /radixin (Thr564) /moesin (Thr 558), fosfor-PKA substrat (RRXS * /T *) (100G7E), fosfo (Ser) PKC substrat (P-S3-101), fosfo-CREB (Ser133) (87G3) og den aktive spaltede fragment av kaspase-3 og kaspase-9 var fra Cell Signaling (Ozyme). Anti-radixin, caspase-2, GAPDH og HSC-70 var fra Santa Cruz Bioteknologi (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, Frankrike). Anti-aktin, anti-ezrin og anti-VSV-glykoprotein-antistoffer ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Lyon, Frankrike). For flowcytometri eksperimenter, ble anti-Bax hentet fra BD biovitenskap. Det sekundære antistoffet var en Alexa-488-coupled geit anti-mus fra Molecular Probes (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike). For immunoprecipitation, ble anti-ezrin (klone 3C12), anti-Flag (M2) og anti-VSV glykoprotein (P5D4) antistoffer kjøpt fra Sigma-Aldrich Anti-TRAIL-R1 (WB-S26) og anti-TRAIL-R2 ( B-D37) antistoffer ble levert av Gen-Probe (Diaclone, Besançon, Frankrike).
Cell kultur
HCT116 (human colon carcinoma), SW480 (human colon adenokarsinom), SK- HEP-1 (human leverkreft), og Mia PACA-2-cellelinjer ble dyrket med høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Lonza, Levallois-Perret, Frankrike) komplettert med 10% føtalt bovint serum (Lonza) og penicillin /streptomycin ( 100 ug /ml av hver). PANC-1 (human pankreatisk karsinom) celler ble dyrket i RPMI 1640 som ovenfor. Alle cellelinjer ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C.
Plasmid anleggs
VSV-merket ezrin WT ble subklonet fra pEGFP-N1-vektoren (Invitrogen) for å PCR 3 (Invitrogen). Mutasjoner S66A, S66D, Y145F, Y145D, Y353F, Y353D, T567A, T567D, R579A ble opprettet ved hjelp av standard PCR-metoder og en seterettet mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA) i henhold til produsentens manual (se S1 Table for primer beskrivelse). Den S66D, Y145D, Y353D, T567D ble opprettet for å etterligne fosforylert ezrin, mens S66A, Y145F, Y353F, ble T567A generert som nonphosphorylatable ezrin. De VSV-merket ezrin mutantene ble subklonet inn i pMSCV-puro ekspresjonsvektor som HindIII /XhoI fragmenter. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensering.
Retrovirus produksjon og celle transduksjon
Den retrovirale vektor pMSCV-puro uttrykk og generering av virus har tidligere blitt beskrevet [22]. HCT116, SW480, MIA PACA-2 og SK-HEP-1-celler ble infisert i 16 timer med virale supernatantene inneholdende 8 ug /ml polybrene (Hexadimethrin Bromid fra Sigma Aldrich), vasket i fosfat-bufret saltvann fra Lonza (PBS), og dyrket i komplett medium inneholdende 2,5 ug /ml puromycin fra InvivoGen.
Måling av cellelevedyktighet
i 96-brønners plater, 50 000 celler ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer med økende konsentrasjon av sin-TRAIL (fra 0 til 10 000 ng /ml) eller i 48 timer med økende konsentrasjon av CDDP (fra 1 til 1000 pM). Celleviabilitet ble bestemt av metylenblått [22].
Hoechst analyse
Cells, behandlet eller ubehandlet med Hans-TRAIL eller Fasl, ble inkubert ved 37 ° C i 6 timer. Alternativt kan cellene forbehandlet eller ikke i 30 minutter med 100 uM H89, 1 eller 100 uM forskolin eller i 20 minutter med 4 mM 8-brom-cyklisk AMP (8B), etterfulgt av TRAIL (100 eller 500 ng /ml i 6 timer) eller Fas-ligand (100 ng /ml i 6 timer), ble inkubert ved 37 ° C i 6 timer. Apoptose ble bestemt ved Hoechst farging ved å bestemme andelen av kondenserte og fragmenterte kjerner fra minst 300 celler per betingelser. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
APO 2,7 farving
celler, behandlet eller ubehandlet med His-TRAIL eller Fasl, forbehandlet eller ikke med 10 uM H89, ble permeabilisert (PBS, FCS 2,5% digitonin og 100 ug /ml) i 10 minutter ved 4 ° C og farget med PE-konjugert 2.7A6A3 antistoff (Beckman Coulter) som gjenkjenner APO2.7 mitokondriemembranprotein eksponert på et tidlig stadium på celler som gjennomgår apoptose. I alt ble 10 000 hendelser analysert ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences).
immunoutfellinger
For TRAIL DISC analysen 10
8 celler ble stimulert med 5 mikrogram Flag- TRAIL tverrbundet med 10 ug av anti-Flag M2 i 1 ml av mediet i de angitte tidsrom ved 37 ° C. Cellene ble deretter vasket med kald fosfat-saltvannsbuffer (PBS) og lysert i 1 ml lyseringsbuffer inneholdende 1% NP40, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl og 10% glycerol og proteinase-inhibitor cocktail. Lysater ble pre-erte med Sepharose 6B (Sigma-Aldrich), og immunopresipitert over natten ved 4 ° C med protein G-Sepharose-kuler (Amersham Biosciences, Les Ullis, Frankrike). For TRAIL reseptor eller GAPDH immunoutfellinger ble cellene stimulert som beskrevet ovenfor med 5 ng /ml Hans-TRAIL. I begge tilfeller ble cellene lysert i NP40-lyseringsbuffer inneholdende. Celleekstrakter ble klaret og immunopresipitert ved hjelp av 5 mikrogram av tilsvarende antistoffer. Perlene ble deretter vasket fire ganger med lyseringsbuffer, og immunopresipitatene ble eluert i ladningsbuffer (Tris-HCl 63 mM, SDS 2%, fenol rød 0,03%, glycerol 10%, og DTT 100 mM pH 6,8), kokt i 5 minutter og behandlet for immunoblotting.
Western blotting
immunopresipitater eller cellelysatene ble oppløst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner. Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert ved inkubering i PBS inneholdende 0,05% Tween 20 og 5% melkepulver. Membranene ble deretter inkubert med et spesifikt primært antistoff, etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff, og ble utviklet av den forbedrede kjemiluminescens fremgangsmåten i henhold til produsentens protokoll (Pierce, Rockford, IL, USA).
Analyse av Bax aktivering ved strømningscytometri
celler, behandlet eller ubehandlet med His-TRAIL, ble fiksert med 4% PFA, permeabilisert (PBS, 1% BSA og saponin 0,1%) i 10 minutter ved romtemperatur og farget med et anti -Bax antistoff som gjenkjenner den aktive N-terminal form av Bax (klon 6A7, BD Biosciences). 10 000 hendelser ble analysert ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences).
Statistical Analysis
For in vitro-studier forskjeller ble bestemt enten med to-veis gjentatt tiltak variansanalyse (ANOVA ) med Bonferroni multippel sammenligningstest, eller ved student t test, ved hjelp av Prism 5.0a programvare (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Et signifikansnivå på * P 0,05, ** P 0,01 eller *** P 0,001 ble antatt for alle tester
Resultater
ezrin er en negativ regulator av Fas og Trail-. indusert celledød
ezrin og moesin ble tidligere vist å være positive regulatorer av Fas-indusert celledød gjennom deres evne til å interagere med Fas-reseptoren i lymfoide T-celler [9, 13]. Følgelig ezrin og moesin lyddemping i Jurkatceller betydelig hemmet Fasl-indusert apoptose, og på samme måte hemmet apoptose indusert av TRAIL (S1 fig). Rollen til ezrin i å regulere Fas- og TRAIL-fremkalt apoptose ble så evaluert i colon carcinoma celler. Ezrin ble enten stabilt overexpressed (Fig 1A og 1B) eller til taushet ved hjelp av siRNA (Fig 1C og 1D) i HCT116 og SW480 celler og apoptose-indusert av TRAIL eller Fas ligand ble vurdert av Hoechst farging. Ektopisk uttrykk for ezrin betydelig svekket Fas ligand- og TRAIL-indusert celledød i de to cellelinjer (Fig 1A og 1B). Følsomhet for apoptose indusert av staurosporin, en PKC-inhibitor er kjent for å indusere mitokondrie-aktivering, ble imidlertid ikke endret i disse cellene (fig 1A og 1B). I samsvar med disse resultatene, ezrin stanse økt både FasL- og TRAIL-indusert apoptose (figur 1C og 1D).
(A) HCT116 eller (B) SW480 celler, uttrykker eller ikke VSV-ezrin ble behandlet for 6 timer med Fas-ligand (100 ng /ml) eller His-TRAIL (500 ng /ml) eller 16 timer med 1 uM staurosporin (STS). Apoptose ble kvantifisert ved farging Hoechst. Data representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forskjellige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01 respektive kontrollere celler). Ezrin ektopisk ekspresjonsnivåer ble analysert ved immunoblotting ved bruk av et anti-VSV-antistoff i kontroll eller ezrin WT-uttrykkende HCT116 og SW480-celler. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. (C) HCT116 eller (D) SW480-celler ble transfektert ezrin eller krafse (SCR) sirnas. 72 timer etter transfeksjon ble cellene stimulert i 6 timer med Fas-ligand (100 ng /ml) eller His-TRAIL (500 ng /ml) og apoptose ble kvantifisert etter farging med APO2.7 antistoff ved hjelp av strømningscytometri. Data representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forskjellige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01 respektive kontrollere celler). Ezrin ekspresjonsnivåer ble analysert ved immunblotting. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (E) Analyse av TRAIL DISC formasjon. HCT116 og SW480-celler ble stimulert med eller uten 5 pg /ml Flag-TRAIL tverrbundet med 10 ug /ml anti-Flag (M2) antistoff. Cellene ble lysert, og platen ble immunopresipitert og analysert ved western blot. Ett av tre uavhengige eksperimenter er vist. (F) HCT116-celler ble stimulert med eller uten 5 pg /ml His-TRAIL i 20 og 60 minutter. Etter cellelyse, ble GAPDH antistoff tilsatt cellelysatene og immunutfelninger ble analysert ved western blot.
ezrin ikke rekruttert i TRAIL DISC
Siden ezrin har vist seg å være en del av Fas DISC i lymfoide celler [13, 14], vi neste sjekket om ezrin ble rekruttert i TRAIL DISC i tykktarm kreft celler. HCT116 eller SW480-celler ble igjen ustimulert (CTL, 0) eller stimulert med 1 ug /ml rhFlag-TRAIL kryssbundet med 2 ug /ml M2 for 15, 20, 30 eller 60 minutter. Etter stimulering ble cellene lysert og platen ble immunopresipitert ved bruk sepharose-protein G perler. Kontroll immunoutfelling ble også utført ved anvendelse av et irrelevant antistoff (CTL) i ikke-stimulerte celler. Som vist Fig 1E, TRAIL stimulering indusert DISC formasjon som dokumentert av rekruttering av adapteren protein FADD samt initiativtaker caspases-8 og -10 til stien reseptorer. Rekruttering av ezrin ble imidlertid ikke konsekvent observert i TRAIL DISC, selv etter selektiv immunoprecipitation av enten TRAIL-R1 (S2 figur) eller TRAIL-R2 (S3 fig). For å sjekke muligheten for at ezrin rullegardin kan være uspesifikke, et protein som ikke er relatert til stien eller Fas veien ble immunopresipitert i celler stimulert med en annen versjon av TRAIL, RH-His-TRAIL, en ligand i stand til å indusere apoptose i fravær av M2 tverrbinding. Immunpresipitasjon av GAPDH trakk ned tilsvarende mengder ezrin, moesin og aktin fra ikke-stimulerte celler, men i mindre grad fra lysater hentet fra TRAIL stimulerte celler (figur 1F). Til sammen disse resultatene taler mot en fysiologisk funksjon for ezrin på DISC nivå i tykktarm kreft celler.
ezrin fosforylering modulerer TRAIL-indusert celledød
Regulering av ezrin fosforylering ble foreslått å redegjøre for sin evne å interferere med Fas-signalisering [13, 23]. Som Fasl, TRAIL induserte en økning i ezrin fosforylering på treonin 567 i SW480 celler (figur 2A). Dessuten, noe som gjenspeiles etter ezrin immunopresipitering, en økning i ezrin tyrosin 145 og serinrester fosforylering ble også funnet etter TRAIL stimulering (figur 2B). På den annen side, men, fosforylering av tyrosin ezrin 353 ble funnet å være noe redusert i celler stimulert med TRAIL, men i en lavere grad, sammenlignet med celler stimulert med Fasl (figur 2B).
(A) immunoblot analyse av fosfo-ezrin (Thr567) uttrykk nivåer i SW480 celler etter stimulering med Hans-TRAIL, Fas ligand eller orthovanadate (NAV). Prosentandelen av relativ fosfo-Thr567 (ezrin) intensitetene ble bestemt på følgende måte: intensiteten av spesifikt bånd i stimulerte celler dividert med den normaliserte intensiteten av ustimulerte celler, normalisert til HSC70. (B) SW480 celler ble stimulert med 500 ng /ml Hans-TRAIL eller 100 ng /ml Fas ligand i 15 minutter eller venstre ubehandlet. Etter at cellelyse i NP40-inneholdende buffer, ble ezrin immunopresipitert med et anti-ezrin antistoff (klon 3C12). Nivået av ezrin fosforylering ble bestemt ved western blot ved anvendelse av anti-fosfo-ezrin målretting tyrosiner 353 og 145, anti-fosfo-erm gjenkjenne fosforylert-ezrin på treonin 567, -moesin på treonin 558 og-radixin på treonin 564 og et anti- pan fosfoserin-. (C) Skjematisk fremstilling av ezrin domener og fosforyleringsseter i proteinet. (D) SW480 celler ble infisert med en tom pMSCV retroviral vektor (Mock) eller med en pMSCV vektor koding ezrin WT, ezrin S66A, ezrin S66D, ezrin Y145F, ezrin Y145D, ezrin Y353F, ezrin Y353D, ezrin T567A, ezrin T567D og ezrin R579A. Ekspresjonsnivåene til ezrin konstruksjoner ble bestemt ved immunblot fra NP40 celleekstrakter ved bruk av et anti-VSV-antistoff. Actin ble her brukt som en lasting kontroll. Dataene som vises, er representative for tre uavhengige eksperimenter. (E) valgt celle-ekstrakter ble oppnådd etter lyse i SDS ble analysert ved immunblot som ovenfor. (F) Effekt av ezrin WT og ezrin phosphomutants ektopisk uttrykk på TRAIL-indusert celledød i SW480 celler. Celler ble stimulert med TRAIL 500 ng /ml i 6 timer. Apoptose ble målt ved APO2.7 farging ved strømningscytometri. (G) Celleviabilitet i SW480 celler som uttrykker ezrin S66A, ezrin S66D eller ezrin R579A, sammenlignet med mock-infiserte celler ble evaluert av metylenblått analyse 24h etter behandling ved hjelp av økende konsentrasjoner av Hans-TRAIL. (H) Prosent inhibitoriske TRAIL konsentrasjonskurver, i ng /ml, fra SW480 celler som uttrykker de indikerte ectopically ezrin mutanter ble oppnådd ved methylen blå farving i 16 timer etter å ha økt His-TRAIL-konsentrasjoner. Tilsvarende IC25, IC50 og IC90, som induserer 25, 50 og 90% celledød, ble oppnådd ved anvendelse av CompuSyn. Data representerer middelverdi ± SD på minst 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 respektive til Mock kontrollceller
For å finne ut om ezrin fosforylering [19, 20, 24] påvirker TRAIL signalering, vi neste generert flere fosforylering mutanter som koder nonphosphorylatable varianter eller pseudophosphorylated varianter av ezrin, på serin 66, treonin 567 og tyrosinene 145 og 353 områder ved seterettet mutagenese (fig 2C). I tillegg til disse fosforylering mutanter, en mutant defekt i ezrin F-aktin binding, ble ezrin R579A som genereres for å bestemme rollen til aktin cytoskjelettet i ezrin-mediert inhibering TRAIL [25]. Infeksjon av SW480 celler med en retroviral vektor som koder for disse konstruksjoner ført til varierende, men vesentlige ekspresjonsnivåene til ezrin mutanter (figur 2D), med unntak av nonphosphorylatable varianten Y145F, ble for det meste uttrykkes i uløselig fraksjon (figur 2E). Interessant mest ezrin mutanter svekket Trail-(Fig 2F) og Fas ligand-indusert apoptose (S4 fig). Bemerkelsesverdig, den nonphosphorylatable variant S66A betydelig, selektivt forsterket apoptose fremkalt av TRAIL, mens den pseudophosphorylated variant S66D vist overlegen beskyttende effekt i forhold til ezrin WT og å håne celler (figur 2F og 2G). Endring av S66 fosforylering imidlertid ikke klart å regulere ezrin-mediert Fasl-indusert apoptose hemming (S4 Fig). Som WT ezrin, aktin-bindende mangel mutant R579A hemmet apoptose indusert av Fasl og TRAIL (Fig 2F og S4 figur), noe som tyder på at hemming av apoptose indusert av død reseptor ezrin i tykktarm kreft celler kan skje uavhengig av cytoskjelettet bindende egenskaper ezrin. Endring av ezrin fosforylering på serin 66 ser ut til å være langt den viktigste hendelsen kontrollere ezrin evne til å hemme TRAIL signalering.
I forhold til foreldre cellene der rundt 200 ng /ml TRAIL er nødvendig for å indusere celledød i 50% av cellene, ezrin WT eller R579A mutante uttrykkende celler viste en IC50 på 260 og 380 ng /ml, mens IC50 i S66A uttrykkende celler var mindre enn 40 ng /ml og den til S66D nådde 850 ng /ml (fig 2G ). Med andre ord, regulering av ezrin fosforylering på S66 modulerer TRAIL-fremkalt celledød følsomhet av en størrelsesorden fra 0,2 til mer enn fire ganger sammenlignet med foreldreceller (Fig 2H og S2 tabell, for IC% -verdier).
ezrin hemmer TRAIL-indusert celledød nedstrøms TRAIL DISC
Analyse av caspase-8 og caspase-10-aktivering i cellelysatene hentet fra SW480 celler som uttrykker enten ezrin WT, R579A, S66A eller S66D, stimulert med økende konsentrasjoner av TRAIL, viste at TRAIL DISC forbundet initiator caspaser ble aktivert på en lignende måte, uavhengig av ezrin mutant (figur 3A). På den annen side, aktiveringen av caspase-9 og caspase-3 ble svakt utvidet i ezrin S66A uttrykker SW480-celler og jevn reduksjon i SW480 celler som uttrykker ezrin WT, ezrin S66D og ezrin R579A, som jugged fra de tilsvarende spaltede produktene (fig 3A) . Videre TRAIL DISC Dannelse ble hverken forandres ved ektopisk ekspresjon av ezrin S66A, og heller ikke S66D mutanter (figur 3B), og ingen av ezrin mutant som vi har testet hittil var i stand til å endre TRAIL-R1 eller TRAIL-R2 ekspresjonsnivåer (S5 figur), som indikerer at ezrin regulerings aktivitet forekommer nedstrøms TRAIL DISC, sannsynligvis på nivået av mitokondriene. Støtter denne konklusjon ble det funn at Bax aktivering i respons til 200 ng /ml TRAIL stimulering falt fra 45% til 30% i celler som uttrykker ezrin WT eller ezrin S66D sammenlignet med mock-transfekterte celler (figur 3C), mens aktivering av Bax i S66A ezrin uttrykkende celler nådde nesten 57% av cellene etter stimulering (figur 3C).
(A) Immunoblot-analyse av kaspase-aktivering, i SW480-celler som uttrykker enten ezrin S66A, S66D, R579A eller WT, 16 eller 6 timer etter His-TRAIL (20 eller 200 ng /ml) stimulering, respektivt. (B) Analyse av TRAIL DISC formasjonen i SW480 celler som uttrykker enten S66A, S66D eller WT ezrin. Celler ble stimulert med 5 ug /ml Flag-TRAIL tverrbundet med 10 ug /ml anti-Flag (M2) antistoff. Etter celle-lysering, ble den DISC immunpresipitert og analysert ved western blot. (C) Analyse av Bax aktivering. Ezrin S66A, S66D, WT og mock-infiserte SW480 celler ble ubehandlet eller stimulert med Hans-TRAIL (20 eller 200 ng /ml) i 16 timer, deretter permeabilized og farget med et antistoff som gjenkjenner aktiv Bax før analyse av flowcytometri. Effekten av to forskjellige konsentrasjoner av TRAIL (20 eller 200 ng /ml, grå og sorte linjer, henholdsvis) ble sammenlignet med ustimulerte celler (grå fylt kurve). Prosentandelen av celler inneholdende aktiv Bax etter TRAIL stimulering er vist (øvre og nedre verdi, henholdsvis).
ezrin-mediert TRAIL regulering er forbundet med WWOX
Proteinkinase A har vært vist seg å mediere den fosforylering av ezrin på serin 66 [20]. Som forskolin, en aktivator av PKA, TRAIL-indusert aktivering av PKA, PKC men også, som vist ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner PKA og PKC-substrater (figur 4A og 4B). I samsvar med PKA aktivering, fosforylering av CREB på serin 133 økt i dose- og tidsavhengig måte i disse cellene (figur 4B), og farmakologisk modulering av PKA i SW480 celler phenocopied regulering av TRAIL-fremkalt apoptose av S66 ezrin mutantene (fig 4C og 4D). Likeledes er inhibering av PKA, ved bruk av inhibitoren H89, etterlignet effekten av ezrin S66A uttrykk, om enn i en mindre grad, og økt TRAIL-fremkalt apoptose, mens aktivering av PKA ved hjelp av forskolin eller 8-Bromoadenosine 3 «, 5»- cyklisk monofosfat (8B) redusert for TRAIL-fremkalt apoptose in SW480 celler (figur 4C og 4D). Det bør bemerkes her at i overensstemmelse med resultatene oppnådd med ezrin serin 66 fosforylering mutanter og dens sterkest evne til å utløse PKA aktivering (figur 4B), Fas-ligand-fremkalt celledød, i motsetning til TRAIL, ikke ble vesentlig endret ved farmakologiske PKA regulatorer (Fig 4C og S6 fig). PKA-indusert fosforylering av ezrin på S66 er blitt vist å regulere dets interaksjon med WWOX (WW domene-inneholdende oksidoreduktase) [26], et tumor suppressor protein [27] som regulerer apoptose indusert ved den mitokondrielle nivå [28]. Interessant, mens begge tykktarm carcinoma-cellelinjer SW480 og HCT116 uttrykke WWOX, to pankreatiske cellelinjer, MIA PACA-2 og PANC-1, så vel som SK-HEP-1 leverkreft cellelinje (figur 5A) ikke gjør det, og ektopisk ekspresjon av ezrin vekt i MIA Paca-2 eller SK-HEP-en klarte å regulere apoptose indusert av Fasl eller TRAIL (fig 5B). Videre verken S66A eller S66D ezrin mutanter, som i SW480 celler fremviser den mest slående regulatoriske fenotype, modulert apoptose indusert av TRAIL (Fig 5C). På den annen side, WWOX stanse hemmet apoptose fremkalt av TRAIL både i Mock og S66A SW480 uttrykkende celler, men ikke i celler som uttrykker S66D (figur 5D). Disse resultater antyder at effekten av ezrin i død-reseptor-fremkalt apoptose er mest sannsynlig indirekte, og at regulering av ezrin fosforylering av serin 66 av PKA er sannsynlig å målrette WWOX pro-apoptotiske potensial, forklarer i det minste delvis ezrin evne til å kontrollere apoptose indusert av død-reseptorer.
(A) Sperre SW480-celler ble stimulert i 30 minutter med forskolin og celleekstrakter ble analysert ved immunblot hjelp av selektive PKA eller PKC substrat-antistoffer, så vel som et anti-fosfo-S133 CREB antistoff. (B) Foreldre SW480 celler ble analysert som ovenfor etter stimulering med TRAIL eller Fasl som angitt i 15 til 120 minutter. (C) Sperre SW480 celler ble forbehandlet eller ikke i 30 minutter med indikerte konsentrasjoner av forskolin, etterfulgt av 6 timer stimulering med 100 eller 500 ng /ml Fasl eller TRAIL. Apoptose ble kvantifisert ved farging Hoechst. (D) Sperre SW480-celler ble forbehandlet eller ikke i 30 minutter med 100 pM H89 eller 20 minutter med 4 mM 8B, etterfulgt av 6 timer stimulering med 100 eller 500 ng /ml TRAIL. (C og D) Data representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forskjellige eksperimenter. (** P 0,01; *** P 0,001 respektive å kontrollere eller H89 stimulerte celler; ns står for ikke statistisk relevant)
(A) WWOX uttrykk nivåer i angitte cellelinjer ble analysert. av immunoblot. HSC70 ble her brukt som en lasting kontroll. (B) VSV-ezrin WT ble uttrykt ectopically i WWOX-mangel celler SK-HEP-1 og MIA Paca-2. Ekspresjonsnivåer ble analysert ved immunblot og apoptose i de tilsvarende cellelinjer etter Fasl (100 ng /ml) eller TRAIL (500 ng /ml) stimulering ble analysert ved Hoechst farging. (C) S66A og S66D ezrin mutantene ble uttrykt i MIA PACA-2. Ekspresjonsnivåer ble analysert ved immunblot som ovenfor, og celle følsomhet for TRAIL-fremkalt celledød ble kvantifisert ved metylenblått. (D) SW480-celler som uttrykker enten ezrin vekt- eller ezrin S66A eller S66D ble transfektert med krafse (SCR) eller WWOX (WOXX) si-RNA i 4 timer og følsomhet for apoptose fremkalt av TRAIL ble kvantifisert ved farging Hoechst. Data representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forskjellige eksperimenter. (** P 0,01; * P 0,05 respektive til Scr siRNA transfekterte celler; ns står for ikke statistisk relevant).
Diskusjoner
Mens bidrag ezrin i Fas signale har blitt grundig studert, lite er kjent om TRAIL, med unntak av en fersk studie der ezrin ble foreslått å svekke både Fas ligand- og TRAIL-indusert celledød i svulsten T-cellelymfom cellelinje H9 [14]. I den studien, ble ezrin foreslått for å inhibere hjel reseptor-mediert celledød i type I celler, som er uavhengig av den mitokondrielle vei, men ikke i type II celler [14] som er avhengige av mitokondriene [29]. I våre hender, ezrin negative regulerende funksjon var ikke strengt begrenset til type I celler, siden Fas ligand- og TRAIL-indusert celledød ble hemmet av ezrin overekspresjon både i SW480 og HCT116 cellene, anses som type I og type II, henholdsvis.
ezrin-mediert TRAIL-indusert celledød regulering var verken relatert til endringer i TRAIL DISC komponent rekruttering eller forskjells aktivering av initiator caspases innenfor DISC, inkludert caspase-8.
