Abstract
Mål
monocytter og makrofager kan infiltrere svulstens mikromiljø og regulere utviklingen av svulster. Denne studien tar sikte på å bestemme frekvensen av ulike undergrupper av sirkulerende monocytter og tumor infiltrerer makrofager (Tims) hos pasienter med tykktarmskreft (CRC).
Metoder
Hyppigheten av ulike undergrupper av sirkulerende monocytter ble karakterisert i 46 CRC-pasienter og 22 friske kontroller (HC) ved flowcytometri. Hyppigheten av ulike undergrupper av makrofager ble analysert i Tims fra 30 tumorvev og i lamina propria mononukleære celler (LPMCs) fra 12 ikke-tumorvev. Konsentrasjonene av plasma cytokiner og karsinoembryonisk antigen (CEA) ble bestemt. Potensialet sammenslutning av disse tiltakene med verdiene av kliniske parametre ble analysert.
Resultater
I sammenligning med at i HC, prosenter av sirkulerende CD14
+ CD169
+ , CD14
+ CD169
+ CD163
+ og CD14
+ CD169
+ CD206
+ monocytter og Tims CD14
+ CD169
+ samt IL- 10
+ CD14
+ CD169
+, men ikke IL-12
+ CD14
+ CD169
+ makrofager var betydelig økt, ledsaget av høyere nivåer av plasma IL-10 i CRC pasienter. Prosentene av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og TIM makrofager ble assosiert med den fasen av sykdommen og positivt korrelert med nivået av plasma IL-10 og CEA i CRC-pasienter.
Konklusjon
Våre data antyder at en økning i hyppigheten av CD14
+ CD169
+ celler kan være forbundet med utvikling og progresjon av CRC og er samtidig økning av begge, pro-tumor (M2 lignende IL-10 produksjon) og anti-tumor (M1-aktig, IL-12 produksjon) av monocytter og makrofager infiltrerende. Hyppigheten av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og infiltrere makrofager kan tjene som en biomarkør for evaluering av sykdomsfremkallende grader av CRC
Citation. Li C Luo X, Lin Y, Tang X , Ling L, Wang L, et al. (2015) en høyere frekvens av CD14
+ CD169
+ Monocytter /makrofager hos pasienter med tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (10): e0141817. doi: 10,1371 /journal.pone.0141817
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: May 22, 2015; Godkjent: 13 oktober 2015; Publisert: 28 oktober 2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de mest utbredte ondartede svulster med høy dødelighet. Dens forekomst er økende i mange land, og CRC påvirker 1,2 millioner mennesker årlig i verden [1]. Tidligere studier har vist at utviklingen og progresjonen av CRC er forbundet med lokal inflammasjon [2-5]. Faktisk forskjellige typer inflammatoriske infiltrater, spesielt for makrofager, er tilstede i de CRC-vev og balansen av protumor og antitumor-inflammatoriske infiltrater er antatt å være kritisk for utvikling, progresjon og invasjon av CRC [3-4, 6]. Derfor vil illustrasjon av ulike typer inflammatoriske infiltrater og deres potensielle funksjoner være av stor betydning for å forstå patogenesen av CRC.
Makrofager, som profesjonelle antigenpresenterende celler (APC) i det medfødte immunsystemet, er de mest tallrike immuncellepopulasjon i svulsten mikromiljøet [7, 8], og spille viktige roller i å regulere vev homeostase og immunstatus. Makrofager i tarmen vev kan være fra deres selvfornyelse [9], og kan også stamme fra migrasjon av monocytter til tarm lamina propria, opprettholde gut homeostase [10, 11]. Makrofager kan klassisk aktivert i M1 celler som uttrykker induserbar salpetersyre oksidase (iNOS), IL-12 og høye nivåer av co-stimulatorer molekyler mens bosatt vev makrofager og tumor-assosiert makrofager er sannsynlig å uttrykke CD163, 206, arginase og IL-10 en M2 fenotype [12-17]. Videre er makrofager, som foreldre monocytter uttrykker CD14, et ko-reseptor for TLR4, som har vært vanlig brukt for å identifisere makrofager og monocytter fra tarmslimhinnen og perifert blod [18, 19]. Monocytter og tumor infiltrerer makrofager (TIM) uttrykker også CD169, sialoadhesin, en celle adhesjonsmolekyl [20] og MAC387, en markør for umodne makrofager [21]. CD169
+ makrofager er viktige aktører i initiering og progresjon av inflammatoriske og autoimmune sykdommer [22]. Videre har CD169
+ makrofager og monocytter vært antatt å dominere pro-betennelse immunitet [22-25]. Tidligere studier har vist at M2 cellene i tumormiljøet er forbundet med progresjon og metastase av kreft [15, 26-27]. I tillegg er CD169
+ makrofager i regionale lymfeknuter i forbindelse med en gunstig prognose i CRC-pasienter [28]. Men hva slags makrofager i tumormiljøet er assosiert med progresjonen av CRC fremdeles kontroversiell. Det har blitt bekreftet at CD169
+ makrofager exit i tykktarmen lamina propria, hovedsakelig rundt krypter og deres utvikling er støttet av vitamin A i mus [29]. Hyppigheten av sirkulerende CD169
+ monocytter og tumor infiltrerer makrofager i Barnekonvensjonen og deres potensial tilknytning til utviklingen av CRC er ikke avklart.
I denne studien har vi preget hyppigheten av ulike undergrupper av CD14
+ CD169
+ celler av sirkulerende monocytter og i tims ved flowcytometri og detekterte nivåer av plasma-IL-10 og IL-12, så vel som carcinoembryonic antigen (CEA) i CRC-pasienter. Videre analyserte vi potensialet sammenslutning av de prosenter av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter og Tims med nivåene av cytokiner og CEA samt kliniske parametre i CRC pasienter. Vi fant betydelig økt prosenter av CD14
+ CD169
+ i både sirkulerende monocytter og Tims av CRC pasienter. I tillegg er prosentandelene av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og tims var forbundet positivt med de patogene stadier av CRC og korrelert med nivåene av plasma-IL-10 og CEA i CRC pasienter. Således våre data understøtter ideen om at en økning i hyppigheten av CD14
+ CD169
+ celler kan være forbundet med utvikling og progresjon av CRC og er samtidig økning av både pro-tumor (M2-aktig, IL -10 produserende) samt anti-tumor (M1-aktig, IL-12 produserende) monocytter og tumor infiltrerer makrofager.
Materialer og metoder
fag og prøver
den skriftlige samtykke ble innhentet fra de enkelte deltakerne. Den eksperimentelle protokollen ble etablert, i henhold til retningslinjene i Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av Human Etisk komité Jilin University (Jilin universitet, Changchun, Kina). Totalt 46 pasienter med CRC ble rekruttert ved innleggelse tjeneste av Institutt for tykktarms Anal Surgery, ble det første sykehuset, Jilin universitet fra februar 2013 til desember 2014. Enkelte pasienter diagnostisert med positiv fekal okkult blod test, histologisk undersøkelse på biopsied tumorvev oppnådd under koloskopi, og en computertomografi (CT) scan. Individuelle tumorprøver ble evaluert for sin svulst klassifisering, histologiske karakterer, og lymfeknutemetastase status av patologer i en blindet måte og iscenesatt, ifølge svulsten-node-metastaser (TNM) klassifikasjonssystem av International Union mot Kreft (Edition 7) [ ,,,0],30]. For lagdeling analyse, pasienter med stadium I /II av CRC ble vurdert på et tidlig stadium, mens de med stadium III /IV av CRC ble vurdert på avansert stadium. Enkelte pasienter ble ekskludert hvis hun /han fått strålebehandling, cellegift, eller immunterapi. I tillegg ble pasientene også ekskludert hvis hun /han hadde dårlig fysisk tilstand. Ytterligere 22 alders og kjønnssammenlignbare friske personer og 12 ikke-tumor fagene ble rekruttert ved Fysisk Eksamen Center og en annen avdeling ved samme sykehus. Alle deltakerne hadde ingen historie av kreft, autoimmune sykdommer, siste smittsomme sykdommer, inflammatoriske tarmsykdommer og familiær polypose. Blodprøver ble tatt fra 46 nye utbruddet CRC pasienter og 22 friske kontroller (HC). Kirurgiske colorectal reseksjon vevsprøver ble oppnådd fra 30 CRC pasienter og 12 ikke-tumor kontroller, som gjennomgikk kirurgisk fjerning av blandet hemorroider. Inflammasjon kan være forbundet med utvikling av hemorroider. Men en tidligere studie funnet ut at hemorroider synes ikke å være forbundet med en økt risiko for analkreft [31] og arten av betennelse mellom miljøene i CRC og hemoroider er annerledes. Det er rimelig å benytte disse vevene som den ikke-tumorkontroll i vårt studium. De demografiske og kliniske data for de enkelte deltakerne ble samlet inn fra sykehus poster og gjennomgått av erfarne kirurger. Deres demografiske og kliniske egenskaper er vist i tabell 1.
Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMC)
Fasting venøse blodprøver ble samlet inn fra enkeltaktører, og en del av blod ble anvendt for fremstilling av perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra tetthetssentrifugering ved bruk av Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). De resterende blodprøver ble sentrifugert for å forberede plasmaprøver.
Isolering av lamina propria mononukleære celler (LPMCs) og Tims
lamina propria mononukleære celler (LPMCs) ble isolert fra de 12 ikke-tumor pasienter og tims ble isolert fra 30 ferskt resekterte kirurgiske tumorprøver, slik som beskrevet tidligere med mindre modifikasjoner [29, 32]. Kort sagt ble den ferske resekterte mucosa eller CRC vev behandles innen 30 minutter etter oppsamling og inkubert i kalsium- og magnesium-fri Hanks «balanserte saltløsning (HBSS, Sigma-Aldrich) inneholdende 2,5% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 1 mM ditiotreitol (Sigma-Aldrich) på is. Vevene ble inkubert i kalsium- og magnesium-fri HBSS-buffer inneholdende 5 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 2,5% varme-inaktivert FBS, 0,1% volum /volum β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ved 37 ° i 25 minutter under konstant omrøring for å fjerne slim og epitelceller. Deretter ble de gjenværende segmentene skåret i små biter og spaltet med 250 ug /ml DNAse (Roche) og 125 ug /ml liberaseTM (Roche) i HBSS ved 37 ° C i 30 minutter under konstant omrøring. Etter sentrifugering ble cellene resuspendert med RPMI-1640 og filtrert gjennom en 40 um cellefilter, etterfulgt av å laste på overflaten av Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Etter sentrifugering ved 800 g for 20 min, ble LPMCs og Tims utvinnes fra grensesnittet og vasket med PBS to ganger for flowcytometri.
Flowcytometri analyse
For å bestemme frekvensen av ulike undergrupper av CD14
+ celler, PBMC eller LPMCs (10
6 celler /tube) ble farget med Alexa Fluor 647-anti-CD169 (Biolegend), APC-H7-anti-CD14 (BD PharMingen), BV421-anti- CD163 (BD PharMingen) og PerCP-Cy5.5-anti-CD206 (Biolegend) ved 4 ° C i 30 minutter hhv. Deretter ble cellene fiksert, og permeabilisert ved hjelp av permeabiliseringen oppløsning (BD Biosciences), etterfulgt av intracellulær farging med FITC-konjugert anti-MAC387 (Abcam).
Lipopolysakkarid (LPS) kan aktivere monocytter eller makrofager ved å interagere med TLR4 og CD14 og indusere dannelsen av cytokiner så som IL-6, IL-10 og IL-12 [33-34]. For å detektere funksjons, PBMC eller LPMCs (10
6 celler /brønn) ble stimulert i duplikat med 50 ng /ml lipopolysakkarid (LPS) og forbolmyristatacetat (PMA) og 1,0 ug /ml ionomycin (Sigma-Aldrich ) i 10% FBS RPMI-1640 medium ved 37 ° C i 2 timer i 5% CO
2 og utsatt for Brefeldin A (GolgiPlug; BD Biosciences) i ytterligere 4 timer, som tidligere beskrevet i vårt laboratorium (21). Etter å ha blitt vasket, ble farget med Alexa 647 Fluor-anti-CD169, APC-H7-anti-CD14, faste, og permeabilisert ved hjelp av permeabiliseringen løsningen, etterfulgt av intracellulær farging med PE-CF594-anti-IL-10 (JES3-9D7 , BD Biosciences) eller PE-anti-IL-12 (BD PharMingen). De samsvar mus isotype kontroll av APC-H7-IgG1, FITC-IgG1, PE-Ig2a, PerCP-Cy5.5-IgG1, PE-CF594-IgG1 og Alexafluor-IgG1 fungert som kontrollene. De mononukleære celler ble inngjerdet i henhold til celle størrelse og intern struktur. For bedre å skille positive fra negative befolkningen, utførte vi Fluorescens Minus One (FMO), der, ble cellene inkubert med alle de fluorokromer bortsett fra en som ble målt (CD14, CD169, CD163). Hyppigheten av ulike undergrupper av CD14
+ mononukleære celler ble bestemt ved flowcytometri analyse på en BD FACSCalibur (Becton Dickinson) og dataene ble analysert ved hjelp FlowJo 7.6.2 programvare.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
konsentrasjonene av plasma IL-10 og IL-12p70 i enkelte deltakerne ble bestemt ved ELISA ved hjelp av humane IL-10 og IL-12p70 ELISA kits, i henhold til produsentens instruksjoner (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Karakterisering av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter i CRC pasienter
for å bestemme den potensielle rolle sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter i utviklingen av CRC, en gruppe av CRC pasienter og alder og kjønn-matchet HC ble rekruttert. Som vist i tabell 1, var det ingen signifikant forskjell i fordelingen av alder og kjønn, antall hvite blodlegemer og monocytter mellom pasienter og HC. Videre var det ingen signifikant forskjell i tumor plassering og deres differensial karakterer mellom pasienter med tidlig og avansert CRC. Som forventet, pasientene viste betydelig høyere nivåer av plasma CEA enn HC (P 0,05).
Forrige studie har vist at CD14
+ monocytter representerer 80-90% av totalt sirkulerende monocytter [35] . Den CD14
+, CD169
+ og CD163
+ celler ble inngjerdet i henhold til tilsvarende isotype kontroller og FMO kontroller (S1 Fig). Vi analyserte frekvensen av ulike undergrupper av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter fra CRC pasienter og HC ved flowcytometri (Fig 1A og 1B). Kvantitativ analyse viste at prosentandelen av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter fra pasientene var betydelig høyere enn fra HC (18.21% vs 1,42%, P 0,0001, figur 1C). Derfor betydelig økt prosentandel av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter eksisterte i CRC-pasienter.
Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble oppnådd fra de enkelte fag og farget med anti-CD14 og anti- CD169. Hyppigheten av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter ble karakterisert ved strømningscytometri. Cellene ble inngjerdet i utgangspunktet på mononukleære celler og deretter på CD14
+ celler. Deretter prosenter av CD14
+ CD169
+ monocytter ble bestemt. For å karakterisere ulike undergrupper av CD14
+ CD169
+ monocytter, ble PBMC farget med fluorescerende antistoffer mot CD14, CD169 og CD163, CD206 eller MAC387. Cellene ble separert på CD14
+ CD169
+ monocytter og prosenter av CD14
+ CD169
+ CD163
+, CD14
+ CD169
+ CD206
+ og CD14
+ CD169
+ MAC387
+ makrofager ble bestemt. Dataene er representative diagrammer av flowcytometri og uttrykt som verdiene av de enkelte fag. De horisontale linjene indikerer median for enkelte grupper. (A) Flowcytometri analyse av CD14
+ CD169
+ monocytter /makrofager. (B) Flowcytometri analyse av ulike undergrupper av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter /makrofager. (C) prosenter av CD14
+ CD169
+ monocytter. (D) Hyppigheten av CD14
+ CD169
+ CD163
+ makrofager. (E) Hyppigheten av CD14
+ CD169
+ CD206
+ makrofager. (F) Hyppigheten av CD14
+ CD169
+ MAC387
+ makrofager.
Videre karakterisering indikerte at andelen av CD14
+ CD169
+ CD163
+ celler i totalt sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter fra CRC pasienter var betydelig høyere enn i HC (74,27% vs. 60,14%, P 0,0001, figur 1D). Videre er hyppigheten av sirkulerende CD14
+ CD169
+ CD206
+ monocytter totalt sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter fra CRC-pasienter var også signifikant høyere enn i HC (3,35% vs. 0,82%, P 0,0001, figur 1E). I kontrast til prosenter av sirkulerende CD14
+ CD169
+ MAC387
+ monocytter totalt sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter i CRC pasienter var lavere enn i HC (76,31% vs 80,15%, P = 0,0041, figur 1F). Kollektivt, CRC pasienter viste en ubalanse i ulike undergrupper av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter.
Analyse av CD14
+ CD169
+ makrofager i colorectal svulster
Perifere monocytter migrere inn i organer og vev til å regulere betennelse. For å forstå betydningen av ulike undergrupper av CD14
+ CD169
+ makrofager i utviklingen av CRC, de prosenter av ulike undergrupper av CD14
+ CD169
+ makrofager i LPMCs fra 12 ikke-kreftpasienter og i tims fra 30 CRC-pasienter ble analysert ved flow-cytometri (figur 2A). Selv om tidligere studier har vist at makrofager i tarmen lamina propria kan uttrykke ulike nivåer av CD14 [18, 36], en brøkdel av CD14
+ makrofager ble presentert i lamina propria (S1 figur A), og vi fokuserte på denne populasjonen av tarmmakrofager. Den CD14
+, CD169
+ og CD163
+ celler i LPMCs eller Tims ble inngjerdet i henhold til FMO kontroller i S1 fig. Prosentandelene av CD14
+ CD169
+ makrofager i tims var betydelig høyere enn den i LPMCs av ikke-tumorpasienter (25,36% vs. 1,83%, P 0,0001, fig 2B). Videre analyserte vi prosenter av CD14
+ CD169
+ CD163
+ eller CD14
+ CD169
+ CD206
+ celler i LPMCs eller Tims av flowcytometri (Fig 2C) . Prosentene av CD14
+ CD169
+ CD163
+ eller CD14
+ CD169
+ CD206
+ makrofager i Tims var betydelig høyere enn i LPMCs (78,05% vs. 64,21 %, P 0,0001, 3,85% vs. 1,63%, P 0,0001, figur 2D og 2E). Interessant, vi også oppdaget en betydelig høyere andel av CD14
+ CD169
+ CD163
+ eller CD14
+ CD169
+ CD206
+ makrofager i Tims enn i sirkulerende monocytter av CRC pasienter (data ikke vist), noe som tyder på at perifert blod CD14
+ CD169
+ monocytter kan migrere inn i lamina propria og ble M2-lignende celler.
i alt 30 nye kirurgiske CRC tumorvev var fordøyd for karakterisering av tumor-infiltrerende makrofager (tims). I tillegg ble 12 lamina propria vev fra ikke-tumorpasienter spaltet for karakterisering av makrofager i alt lamina propria mononukleære celler (LPMCs). Deretter ble cellene farget med anti-CD14, CD169 og CD163 eller CD206. Hyppigheten av CD14
+ CD169
+, CD14
+ CD169
+ CD163
+ og CD14
+ CD169
+ CD206
+ makrofager i LPMCs og Tims ble bestemt ved flow-cytometri. Dataene er representative diagrammer eller uttrykt som verdiene av de enkelte fag. De horisontale linjene indikerer median for enkelte grupper. (A) Flowcytometri analyse av CD14
+ CD169
+ i LPMCs og Tims. (B) Den prosenter av CD14
+ CD169
+ makrofager i LPMCs og Tims. (C) Flowcytometri analyse av CD14
+ CD169
+ CD163
+ og CD14
+ CD169
+ CD206
+ makrofager totalt CD14
+ CD169
+ LPMCs og Tims makrofager. (D) Hyppigheten av CD14
+ CD169
+ CD163
+ makrofager i LPMCs og Tims. (E) Hyppigheten av CD14
+ CD169
+ CD206
+ makrofager i LPMCs og Tims.
En høyere frekvens av IL-10
+ CD14
+ CD169
+ monocytter og makrofager i CRC pasienter
Tidligere studier har vist at IL-10
+ M2 celler er assosiert med utvikling av CRC [26, 37-38]. For å bestemme funksjonen av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter og tims, ble de isolerte celler stimulert in vitro, og de prosenter av IL-10
+ eller IL-12
+ CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims ble bestemt ved flowcytometri (fig 3A). Prosentene av IL-10
+ CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims totalt CD14
+ CD169
+ celler fra CRC pasienter var betydelig høyere enn det fra ikke-tumor pasienter (3,79% vs 0,76%, P 0,0001 for sirkulerende monocytter, 7,12% vs. 1,23%, P . 0,0001 for Tims figur 3B). I motsetning til dette var det ingen signifikant forskjell i frekvens av IL-12
+ CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og tims mellom de CRC-pasienter og ikke-tumor fag (0,24% vs. 0,22%, P = 0,2854 for sirkulerende monocytter, 0,37% vs. 0,36%, P = 0,4729 for Tims figur 3C).. Videre analyse av CD14
+ CD169
– celler avslørt er det ingen signifikant forskjell i hyppigheten av IL-10
+ eller IL-12
+ CD14
+ CD169
– celler totalt CD14
+ CD169
– celler mellom CRC pasienter og ikke-kreft fag i denne populasjonen (IL-10: 0,017% vs. 0,024%, P = 0,6428 for sirkulerende monocytter, 0,018% vs. 0,014% , P = 0,8125 for Tims, IL-12: 0,019% vs. 0,013%, P = 0,1628 for sirkulerende monocytter, 0,015% vs. 0,013%, P = 0,8678 for Tims S2 figur).. Enda viktigere prosentene av CD14
+ CD169
+ IL-10
+ celler ble positivt korrelert med prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims i CRC pasienter (R = 0,5375, P = 0,0001 for sirkulerende monocytter, R = 0,5637, P = 0,0009 for Tims, fig 3D og 3E). Derfor CRC pasienter viste en høyere frekvens av IL-10
+ CD14
+ CD169
+ makrofager.
PBMC og Tims ble isolert fra de enkelte fag og stimulert med LPS og PMA /ionomycin . Cellene ble farget med anti-CD169 og anti-CD14 i 30 minutter, faste, og permeabilisert, etterfulgt av intracellulær farging med anti-IL-10 eller anti-IL-12. Cellene ble først inngjerdet på CD14
+ CD169
+ celler og prosenter av CD14
+ CD169
+ IL-12
+ M1 og CD14
+ CD169
+ IL-10
+ M2 celler i PBMC eller Tims fra enkelte fag ble bestemt ved flowcytometri. Nivået av plasma-IL-10 og IL-12 i de enkelte fag ble bestemt ved hjelp av ELISA. Dataene er representative diagrammer eller uttrykt som verdiene av den enkelte pasient. De horisontale linjene indikerer median for enkelte grupper. (A) Strømningscytometri-analyse. (B) Prosentandelene av CD14
+ CD169
+ IL-10
+ M2-celler. (C) Prosent CD14
+ CD169
+ IL-12
+ M1 celler. De horisontale linjer angir de medianverdiene. (D) Potensialet assosiasjon mellom prosenter av sirkulerende CD14
+ CD169
+ IL-10
+ celler og CD14
+ CD169
+ celler i CRC pasienter. (E) Potensialet assosiasjon mellom prosenter av Tims CD14
+ CD169
+ IL-10
+ celler og CD14
+ CD169
+ celler i CRC vev. (F) Nivåene av plasma IL-10. (G) De nivåer av plasma-IL-12. (H) Korrelasjonen av plasma IL-10 nivåer med prosenter av CD14
+ CD169
+ IL-10
+ monocytter i PBMC fra CRC pasienter. (I) Den korrelasjon mellom nivåene av plasma-IL-10 og CEA i CRC-pasienter.
Vi målte konsentrasjoner av plasma-IL-10 og IL-12 i de enkelte fag ved hjelp av ELISA. Som vist på figur 3F og 3G, konsentrasjonen av plasma-IL-10, men ikke IL-12, i CRC-pasienter som var betydelig høyere enn i det HC (P 0,0001). Konsentrasjonene av plasma-IL-10 ble positivt korrelert med prosentandelene av sirkulerende IL-10
+ CD14
+ CD169
+ monocytter (R = 0,6018, P 0,0001, fig 3H), og nivåene av plasma CEA i CRC-pasienter (R = 0,413, p = 0,0043, fig 3I).
Lagdeling analyser av frekvensen av CD14
+ CD169
+ monocytter og makrofager i CRC-pasienter
Deretter stratifisert vi pasientene, i henhold til deres svulst patologisk TNM etapper, og vi fant ut at prosentandelen av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter var signifikant lavere hos pasienter med tidlig stadium av CRC enn de med avansert stadium av CRC (11.81% vs 15,91%, P = 00 003, figur 4A). Tilsvarende prosenter av CD14
+ CD169
+ makrofager i Tims fra pasienter med tidlig stadium av CRC var betydelig lavere enn i de med avansert stadium av CRC (22.45% vs 26,93%, P 0,0001, figur 4A). I tillegg er prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter fra pasienter med tidlig stadium eller avansert stadium av CRC var betydelig lavere enn i Tims fra den samme gruppen av pasienter (P 0,00001, P 0,0001 henholdsvis, fig 4A). Prosentene av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter var positivt korrelert med prosenter av CD14
+ CD169
+ makrofager i Tims fra pasienter med tidlig (R = 0,4361, P = 0,0073. Fig 4B) eller avansert stadium (R = 0,8191, P = 0.0001.Fig 4C) fra CRC.
CRC pasienter ble stratifisert så tidlig (i /II, n = 21) eller avansert stadium (III /IV, n = 25) og prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims i enkelte pasienter ble analysert. Videre mulig sammenheng mellom prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter eller Tims og nivåene av plasma CEA i enkelte grupper av pasienter ble analysert. Dataene er gjennomsnittet av de enkelte fag. (A) Prosenter av CD14
+ CD169
+ monocytter i PBMC (n = 21 for tidlig stadium, n = 25 for avansert stadium av CRC pasienter) og prosenter av CD14
+ CD169
+ makrofager i Tims fra tidlig (n = 14) eller avansert (n = 16) stadium av CRC pasienter. De horisontale linjene indikerer median for enkelte grupper. (B) Korrelasjonen mellom prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims i tidlig fase av CRC pasienter. (C) Korrelasjonen mellom prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims i avansert stadium av CRC pasienter. (D) Korrelasjonen mellom nivåene av plasma CEA og prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter i CRC pasienter. (E) Korrelasjonen mellom nivåene av plasma CEA og prosenter av CD14
+ CD169
+ Tims i CRC-pasienter.
Nivåene av plasma CEA forblir en verdifull biomarkør for evaluere CRC progresjon [39]. Derfor undersøkte vi potensialet foreningen blant prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims med nivåene av plasma CEA i CRC pasienter. Vi fant at nivåene av plasma CEA ble positivt korrelert med prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter (R = 0,7655, P 0,0001, figur 4D) og CD14
+ CD169
+ makrofager i Tims (R = 0,5768, P = 0,0009; figur 4E) i CRC pasienter. Sammen prosenter av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims ble positivt assosiert med patologiske stadier av CRC i denne pasientgruppen.
Diskusjoner
For å evaluere markør potensialet CD14
+ CD169
+ celler i sykdomsfremkallende progresjon av CRC, undersøkte vi fenotype og klinisk relevans av sirkulerende CD14
+ CD169
+ monocytter og Tims i CRC pasienter. Våre data indikerer at sirkulerende CD14
+ CD169
+ M2-lignende monocytter og Tims akkumulert i svulster og korrelert med nivået av plasma IL-10 og CEA i CRC pasienter. Åpenbart var hyppigheten av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims forbundet med sykdomsfremkallende stadier av CRC. Så langt vi kjenner til, dette var den første rapporten som en betydelig høyere andel av sirkulerende CD14
+ CD169
+ M2-lignende monocytter eller Tims var assosiert med sykdomsfremkallende progresjon av CRC hos mennesker.
inflammatoriske infiltrater i svulsten mikromiljøet er avgjørende for utviklingen og metastasering av svulster [7, 8]. Tidligere studier har vist at alternativt aktiverte makrofager M2 kan delta i den patogene prosessen med forskjellige typer av faste tumorer ved å fremme angiogenese og metastase og inhibering av antitumoraktivitet [16, 40-41]. I denne studien har vi oppdaget en betydelig høyere frekvens av sirkulerende og tumor infiltrerer CD14
+ CD169
+ CD163
+ og CD14
+ CD163
+ CD206
+ M2-lignende makrofager i CRC pasienter. Disse funnene tyder på at perifere monocytter kan migrere inn i tumorvev og regulere tumorvekst og immunitet. Prosentene av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims hos pasienter med avansert stadium av CRC var betydelig høyere enn de med tidlig stadium av CRC. Disse dataene videre indikert at hyppigheten av CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter og Tims var assosiert med sykdomsfremkallende grader av CRC. Våre data utvidet tidligere observasjoner på inflammatorisk sykdom og foreslår at CD169
+ kan uttrykkes av makrofager i tumorvev [23-25, 42]. Faktisk har CD169
+ makrofager blitt oppdaget i normal tykktarm lamina propria [29]. Gitt at CD169 er et adhesjonsmolekyl det er mulig at CD14
+ CD169
+ sirkulerende monocytter kan migrere og aktiveres i svulsten miljøet for å regulere progresjon og metastasering av CRC. Våre resultater var forskjellig fra en tidligere observasjon at CD169
+ makrofager i regionale lymfeknuter var assosiert med en gunstig prognose i CRC pasienter [28].
