Abstract
epigenetiske hendelser er viktige bidragsytere til patogenesen av kreft, og målretting epigenetiske mekanismer representerer en ny strategi i kreftbehandling. Classic demethylating agenter, slik som 5-Aza-2′-deoxycytidine (Decitabine), hold potensialet for reprograming somatiske kreftceller som viser høy terapeutisk effekt i hematologisk kreft. På den annen side, epigenetisk behandling av faste tumorer gir ofte opphav til uønskede cytotoksiske bivirkninger. Passende leveringssystemer kunne berike Decitabine på stedet av action og forbedre biotilgjengeligheten vil redusere forekomst av toksisitet på friskt vev. I dette arbeidet gir vi prekliniske beviser på en trygg, allsidig og effektiv målrettet epigenetisk terapi for å behandle hormon sensitiv (LNCaP) og hormon ildfast (DU145) prostatakreft. En ny Decitabine formulering, basert på bruk av konstruerte erytrocytt (Erythro-Magneto-Hemagglutinin-virosomer, EMHVs) medikamentleveringssystem (DDS) som bærer dette stoffet har blitt raffinert. Inne i EMHVs, ble medikamentet skjermet fra omgivelsene og fosforylert i sin aktive form. Romanen magnetiske EMHV DDS, utrustet med fusogene protein, forbedret stabilitet gjennomført narkotika og viste en høy effektivitet i å avgrense sin leveranse på stedet av handlingen
in vivo
ved å bruke et eksternt statisk magnetfelt. Her viser vi at Decitabine lastet inn EMHVs induserer en betydelig tumormasse reduksjon i prostata cancer xenograft modeller i en konsentrasjon som er syv hundre ganger lavere enn terapeutisk dose, noe som tyder på en forbedret farmakokinetikk /farmakodynamikk av narkotika. Disse resultatene er relevante for og drøftet i lys av utviklingen av personlige autologe terapier og innovativ klinisk tilnærming for behandling av solide svulster
Citation. Naldi jeg, Taranta M, Gherardini L, Pelosi G, Viglione F, Grimaldi S , et al. (2014) Novel epigenetisk Target Therapy for prostatakreft: En preklinisk studie. PLoS ONE 9 (5): e98101. doi: 10,1371 /journal.pone.0098101
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 30 desember 2013, Godkjent: 28 april 2014; Publisert: May 22, 2014
Copyright: © 2014 Naldi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR) finansiering og av EU midler til POR Creo FESR 2007-2013, BANDO UNICO R S-ANNO 2012 av Regione Toscana-Project akronym Tittel: ACTILA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Caterina Cinti er en PLoS ONE redaksjonell styremedlem, men dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Prostatakreft (PC) er en vanlig diagnostisert kreft i utviklede land, og forekomsten øker dramatisk med alderen [1], [ ,,,0],2]. Til tross for den påviste suksess for hormonterapi, kirurgisk kastrering [3], [4] og strålebehandling [5] – [7], men etter å ha blitt administrert en undergruppe av pasienter med manifest sykdomsprogresjon og ble motstand mot ytterligere hormonell manipulering [8] – [10]. Opptil 20% av PC-pasienter behandlet med radikal prostatektomi har sannsynligheten for å utvikle seg til invasiv kreft med tilbakefall metastatisk forhold innen 5 til 10 år [11]. Median overlevelse av pasienter med metastatisk PC er 12-16 måneder fra diagnosetidspunktet til døden [12]. Ingen kurativ behandling er tilgjengelig på dette stadium av sykdommen. Til tross for intensiv forskningsinnsats, de molekylære mekanismer som prostatakreftceller blir resistente mot hormonbehandling forbli dårlig karakterisert.
epigenetiske forandringer, som involverer hypermethylation av gener i kritiske reaksjonsveier, slik som DNA-reparasjon, metabolisme, og invasjon /metastase, er blitt funnet i prostatakreft gi ny informasjon av patogenesen av denne tumor [13], [14]. Posttranslasjonelle endringer svekker kromatinstruktur endre genuttrykk og føre cellene til metastatisk spredning. Men som epigenetiske modifikasjoner krever ikke endring i DNA-sekvensen de er potensielt reversible. DNA metyltransferaser (DNMTs) involvert i epigenetisk stanse av genuttrykk blir derfor et egnet mål for epigenetiske behandlinger [15] -. [17]
Decitabine (5-Aza-2′-DC) er en klassisk demethylating middel godkjent av FDA for behandling av pasienter med myelodysplastisk syndrom og akutt lymfoblastisk leukemi (ALM) [18]. Imidlertid er fordelaktig av Decitabine behandling er fremdeles usikker for pasienter med faste tumorer som mangel på kjemisk stabilitet i vandig oppløsning og høy forekomst av neutropeni har vært forbundet med bruken av det.
Nylig har anti-proliferativ effekt av Decitabine har blitt testet i ulike svulst histotypes som testikkel [19], lunge [20], bryst [21], kolorektal kreft celler [22], CNS svulster [23] og prostata kreft [24] – [26]. Disse oppmuntrende resultater indikerte at Decitabine kan være effektive ved inhibering av progresjon av kreft og indusere celledifferensiering. Til tross for disse
in vitro
rapporter, ble det understreket behovet for å bedre legemiddel stabilitet i løsning og levering effekt, for å minimere giftige bivirkninger og forlenge epigenetiske utfall
in vivo
.
Den bemerkelsesverdige terapeutiske potensialet Decitabine er faktisk hemmet av systemisk ustabilitet [27]. Dens lave terapeutiske indeks og vanskeligheten med å kalibrere steady state konsentrasjon i blodet har påvirket flere kliniske studier.
I de senere år medikamentleveringssystemer (DDSS) har blitt utviklet for å forbedre den spesifikke og lokalisert avgivelse av terapeutiske midler for å målrette tumor vev og samtidig unngå alvorlige toksiske bivirkninger på friske organer [28], [29]. Cellebaserte medikamentleveringssystemer slik som erytrocytter er spesielt attraktive verktøy for avgivelse av flere klasser av terapeutiske midler. Erytrocytter er trygge og biokompatible operatører som kan romme molekyler av forskjellig størrelse, natur og stabilitet, og de er spesielt nyttig for de agenter som viser begrenset vevspenetrasjon eller inaktiveres raskt ved intravenøs
in vivo
administrasjon [30] – [32]. Videre erytrocytter også fungere som sirkulerer bioreaktorer konvertere en pro-narkotika i sine aktive former.
En roman erytrocytt-basert medikamentleveringssystem, utrustet med både super-paramagnetiske nanopartikler (NPS) inne i erytrocytter og en fusogene glykoprotein den filamentøst hemagglutinin (FHA), innført i de cytoplasmiske membraner av erytrocytter (Erythro-Magneto-hemagglutinin-virosomer, EMHVs), ble nylig patenterte (WO2010 /070620 (A1)).
det har vist seg at disse EMHV forbedret kinetikk av terapeutiske forbindelser inn i målet celler
in vitro
. Effektiv narkotika intracellulær frigjøring oppnås i vertsceller på grunn av tilstedeværelsen av fusogene glykoprotein på EMHV membraner [33], [34].
Den magnetiske natur av dette stoffet levering systemet tillater EMHV å være rettet mot de ønskede vev /organer
in vivo
ved anvendelse av et eksternt magnetfelt.
Her har vi testet en target «epigenetisk terapi», basert på bruk av lavdose 5-Aza-2′-dC lastet inn EMHVs i to prostatakreft modeller. Menneskelige prostata adenokarsinom LNCaP celler som reagerer på hormonbehandling og DU145, hormon ildfaste celler, har blitt brukt [35]
in vitro Hotell og
in vivo
i xenograft tumormodeller. Vi viser at den farmakologiske anticancer aktivitet av 5-Aza-2′-DC er sterkt økt med vår EMHVs leveringssystemet både
in vitro Hotell og
in vivo
tyder dens mulig søknad i fremtidige kliniske studier .
Materialer og metoder
Reagenser
superparamagnetiske nanopartikler (NPS) ble kjøpt fra nano-screenMAG, Chemicell, Berlin, Tyskland. Filamentøst hemagglutinin fra
Bordetella pertussis plakater (FHA), 5-aza-2′-deoxicytitidine (5-aza-2′-dC), HPLC-kvalitet acetonitril, N «, N»-dimetylheksylamin (DMHA), cytidin -5 «trifosfat dinatrium salt (CTP) og 2»-deoxyuridine (du) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, Milano, Italia. Metanol og ammonium acetat ble kjøpt fra Carlo Erba, Milano, Italia.
Fremstilling av 5-Aza-2′-DC-lastet EMHVs (A-EMHVs)
Menneskelige erytrocytter ble utarbeidet av gradient sentrifugering ved 400 g i 30 minutter og deretter vasket to ganger i 1 x PBS (1,37 M NaCl, 57 mM KCl, 54 mM Na
2HPO
4, 45 mM KH
2PO
4, pH 7,4). 2 x 10
9 erytrocyttene ble lysert i 250 ul lyseringsbuffer 1 (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, 1 mM MgCl
2 pH 7,2) i 60 minutter ved 0 ° C. Den isotonisitet ble deretter gjenopprettet ved å tilsette 130 mL av forsegles buffer (65 mL 10X PBS pH 7,4 og 65 mL 15 mM MgCl
2 pH 7,4), supplert med to mikrogram av FHA, 0,1 mg 100 nm super-paramagnetisk NPs og 75 ug av 5-aza-2′-dC.
Suspensjonen ble inkubert i 45 minutter ved 37 ° C under mild omrøring for å fremme forsegles og får utviklet erytrocytter lastet med 5-aza-2′- dC (A-EMHVs). A-EMHVs ble deretter oppsamlet ved sentrifugering ved 8000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Suksessivt erytrocytt suspensjonen ble vasket to ganger med 1 x PBS ved sentrifugering ved 8000 g i 15 minutter ved 4 ° C, resuspendert i 1 x PBS og konservert ved 4 ° C inntil bruk.
Cellekultur
LNCaP og DU145 prostatakreftcellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og holdt i kulturmedium RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, i nærvær av 100 U /ml penicillin-streptomycin, ved deleforhold på 1:03 to ganger i uken. Disse prostata kreft celler ble brukt for både
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter.
Confocal Laser Scanning Mikroskopi (CLSM) analyse
DU145 cellene ved en tetthet på 1,5 x 10
5 ble sådd i 6-brønns mikrotiterplater. På bunnen av kulturplater dekkglass ble plassert på hvilken cellene ble lar å vokse inntil 60-80% konfluens. Etter 24 timer ble kulturmediet erstattet med media inneholdende 1,5 x 10
8 A-EMHVs. I en prøve, ble friskt medium erstattet med ingen tilsetning av EMHVs å visualisere naive cellestrukturen (kontroll). Etter 6, 24 og 48 timers inkubering, ble dekkglassene hentet og cellene ble vasket i 1 x PBS-buffer og fiksert med 4% paraformaldehyd. Cellekjerner ble telleren farvet med DAPI, vasket med 1 x PBS og hele dekkglass er montert på et objektglass ved anvendelse av anti-fading medium. Fluorescens og lyse-feltet bilder ble tatt av CSLM, Leica TCS SP5 invertert mikroskop system, utstyrt med kilder som avgir fra UV til synlig. DAPI fluorescens ble påvist ved hjelp av eksitasjon ved 405 nm og opptak emisjon ved 454 nm, mens den røde fluorescens superparamagnetiske NPs var spent på 543 nm og utslipps ble påvist ved 613 nm.
Væskekromatografi-massespektrometri ( HPLC-MS) analyse av 5-Aza-2′-dC lastet inn EMHVs
for å kvantifisere den totale mengden av 5-Aza-2′-dC inne i modifiserte erytrocytter, 2 × 10
9 fersk fremstilt i A-EMHVs ble lysert i 200 ul lyseringsbuffer 2 (155 mM NH
4Cl, 10 mM KHCO
3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) i 10 minutter ved romtemperatur og deretter sentrifugert ved 12000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble overført til en Microcon sentrifugal filteranordning med MWCO 30 000 Da (Amicon YM-10, Millipore, Vimodrone MI, Italia) og deretter sentrifugert ved 14 000 g i 2 timer ved 4 ° C. Filtrerte prøver ble oppbevart ved -80 ° C inntil analyse. HPLC-systemet som ble anvendt var en Dionex 3000 Ultimate serie LC (Sunnyvale, CA, USA) koblet til en lineær ionefelle LTQ-Orbitrap massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, USA), som er utstyrt med en elektrospray ione kilde. Data ble ervervet og behandlet med Excalibur 2.1-programvaren. Forbindelsene ble separert på en Mediterranea Sea18 revers-fase-kolonne (150 mm, 2,1 mm indre diameter og 5 um partikkelstørrelse) fra Teknokroma (Analytical Technology S.r.l., Brugherio Milano, Italia). Kolonnen ble satt til en strømningshastighet på 0,25 ml /minutt, ved en temperatur på 36 ° C, og prøvevolumer på 10 ul ble injisert. Den mobile fase bestod av 5 mM ammoniumacetat (løsningsmiddel A) og acetonitril (løsningsmiddel B). De første 13 minuttene var en isokratisk kjøre med løsemiddel A; mellom 13 og 20 minutter hvor mange prosent av mobilfase B var økt til 35%, opprettholdt i 2 minutter, og deretter den opprinnelige den mobile fase ble re-etablert i løpet av 2 minutter. Massespektrometer ble operert i positiv elektrospray-modus og kollisjonsenergien var 35 eV. Overgangene overvåkes var m /z 229 — 113 for 5-Aza-2′-DC; m /z 219 — 103 for guanylurea derivater; m /z 247 — 131 for formulerte derivater av 5-aza-2′-dC. For å søke etter mulige fosforylerte formene for 5-Aza-2′-dC, 2 × 10
9 nylagde A-EMHVs var igjen ved 37 ° C i 24 timer. Suksessivt ble prøver ble lysert og filtrert som beskrevet ovenfor, og 400 ng av CTP ble tilsatt til prøvene som interne standarder. Den mobile fasen bestod av 20 mM DMHA pH 7,0 (løsningsmiddel A) og metanol-vann 80:20 (løsningsmiddel B). De første 12 minuttene var en isokratisk løp med 10% løsemiddel B; mellom 12 og 15 minutter hvor mange prosent av mobil fase B ble øket til 80%, ble opprettholdt i 1 minutt og deretter den innledende den mobile fase ble re-etablert i løpet av 2 minutter. Massespektrometer ble operert i negativ elektrospray-modus og kollisjonsenergien var 15 eV. Overgangene overvåkes var m /z 482 — 384 for CTP; m /z 467 — 369 for 5-Aza-2′-dC trifosfat; m /z 387 — 289 for 5-Aza-2′-dC difosfat; m /z 307 — 208 for 5-aza-2′-dC-monofosfat svarende til eliminering av et nøytralt molekyl av H
3PO
4. For kalibreringskurve, ble seks forskjellige CTP standardløsninger anvendes. Den toppareal-forhold på sample /CTP ble anvendt for kvantisering.
Cytofluorimetric (FACS) analyse
LNCaP og DU145-celler ved en tetthet på 1,5 x 10
5 ble sådd i 6- brønners mikrotiterplater for cellesyklus analyser. Etter 24 timer ble kulturmediet erstattet med media inneholdende: intet medikament (CTRL); gratis 5-Aza-2′-dC ved doser 6,8 mikrogram eller 120 ng; 1,5 x 10
8 A-EMHVs (inneholdende ca. 120 ng 5-aza-2′-dC).
Etter 24, 48 og 96 timers inkubering, kontroll og behandlede celler ble høstet og analysert ved hjelp FACS. Kjerner ble farget med 10 ug /ml propidiumjodid (PI) i hypotonisk oppløsning (1 x PBS inneholdende 0,1% natriumsitrat og 0,1% Triton X-100) i 30 minutter ved 4 ° C i mørke for vurdering av cellesyklusfaser.
apoptotiske celler ble oppdaget av Annexin V test (BioVision). De behandlede og ubehandlede celler ble suspendert i 1 x bindingsbuffer og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter med Annexin V-FITC og propidium jodid (PI) ble tilsatt for kjerner farging følge produsentens instruksjoner.
Flow-cytometri ble utført ved hjelp av Becton Dickinson FACScan CentroII og data ble analysert ved FlowJo programvare.
Dyr
for de eksperimenter utført på dyr innretningen av Marshall University, medfødte atymiske BALB /c naken mus, homozygot for
nu Twitter /
nu
allel, ble avlet i huset. Kolonien 8 til 12 uker gamle hannmus ble utviklet fra avlsdyr hentet fra Charles Elver Laboratories (Wilmington, MA). Disse dyrene ble brukt for LNCaP xenograft eksperimenter.
Dyr brukes i forsøk utført ved «Toscana Life Sciences» animal anlegget var atymiske Nude-Foxn1
nu
hannmus, 6 ukers alder, kjøpt fra Harlan Laboratories (Udine, Italia). Disse dyr ble benyttet for DU145-xenografter.
I begge tilfellene ble dyrene plassert i mikroisolatorer i autoklavert bur med polyesterfiber filterdeksler under bakteriefrie forhold. All mat, vann og sengetøy ble sterilisert og dyrene ble opprettholdt i en omgivelsestemperatur på 23 ± 2 ° C i rom med en 12 timers lys /mørke syklus.
X-ray imaging
atymiske BALB /c Nude mus ble injisert med 1,5 × 10
8 EMHVs suspendert i 150 ul 1X PBS.
etter EMHVs halevenen injeksjon, ble en gruppe dyr utsettes for ytre magnetfelt ved å plassere to jord magneter på den nedre laterale mageregionen i 30 minutter (EMHVs-MF), mens mus ble holdes under 2% isofluorane anestesi. Neodinium magneter (rund 5,0 mm) med ca tvangsmulkt kraft av 1000 KOersted, ble brukt. En kontrollgruppe av mus ble injisert i halevenen med EMHVs som tidligere beskrevet, men ingen ekstern magnetisk felt ble påført (EMHVs-NMF). En time etter behandling ble musene avlivet ved CO
2 kvelning og akkumulering av jernholdige kulene ble bestemt ved røntgenstråle-avbildning. Den bildeanalyse ble utført ved hjelp av en Philips DigitalDiagnost direkte digital radiografi system med flat detektorteknologi (Philips, Hamburg, Tyskland) med en dose på 60 kVp 5 mas.
Tumor xenograft prosedyrer
Begge atymiske BALB /c Nude og Nude-Foxn1
nu
mus ble bedøvet med 2,5% isofluran under manipulasjon
innstillingen av modellene. LNCaP eller DU145 cellene ble konsentrert til 7 × 10
6 eller 4,5 × 10
6 henholdsvis i 1X PBS og injisert subkutant 01:01 med MatrigelTM basalmembran matrix (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i den venstre flanken av hver mus (totalvolum 200 mL). Når xenotransplantater begynte å vokse, deres størrelser (mm
3) ble målt to ganger i uken med digital målepunkt, og volumet ble kalkulert ved hjelp av standardformelen: lengde x bredde
2/2. Tumor xenotransplantater fikk lov til å vokse om lag opp til 100 mm
3 og dette volumet ble valgt som den innledende fasen for start av behandling. Mus ble randomisert (n = 6), bedøves og klargjøres for injeksjon i halevenen med den valgte behandlingen. Før hver injeksjon ble tumorer målt og sammenlignet med de tilsvarende opprinnelige volum, for å normalisere dataene (X = 100 x volum
1 /volum
0). Randomisering: Mus ble tildelt syv forskjellige grupper i både eksperimentelle innstillinger (LNCaP eller DU145 xenografter) og de ble behandlet som følger: 1X PBS (CTRL); 85 ug 5-aza-2′-dC (2,5 mg /kg) (A1); 120 ng 5-Aza-2′-DC (A2); 1,5 × 10
8 losset EMHVs i fravær av statisk magnetfelt (EMHVs-NMF); 1,5 × 10
8 losset EMHVs og statisk magnetfelt brukes på tumor (EMHVs-MF); 1,5 × 10
8 EMHVs inneholder 120 ng 5-Aza-2′-DC (A-EMHVs-NMF); 1,5 × 10
8 EMHVs inneholder 120 ng 5-Aza-2′-DC og statisk magnetfelt brukes på tumor (A-EMHVs-MF)
Injeksjon protokollen. Mus ble annenhver uke gitt intravenøst med 150 mL behandling per vaksinasjon, over 3 uker. Etter hver injeksjon i disse grupper valgt som skal behandles også med statisk magnetfelt (EMHVs-MF og A-EMHVs-MF), ble to magneter (1000 KOersted) påført på xenograft massen i 30 minutter for å sikre intra-tumor akkumulering. Mus var da lov å utvinne og overvåkes for tegn på stress. Ved slutten av behandlingsforløpet eller når tumorvolumet nådde ca 400 mm
3, musene ble avlivet ved CO
2 kvelning og prostata tumormassen, lever, nyrer ble høstet og lagret ved -80 ° C inntil ytterligere analyse.
morfologiske og immunhistokjemisk analyse av tumorxenotransplantater
Frosne prøver lagret ved -80 ° C var likevekt ved -20 ° C over natten før seksjonering av cryostat (MICROM HM 500 W) etter embedding i oktober
Etterfølgende serielle frysesnitt av 5-6 mikrometer tykkelse ble oppnådd fra midten (største) parti av hver prøver, plasseres på positivt ladet objektglass, tørket i luft i noen få minutter og deretter fiksert med kald aceton . To til fire seksjonene ble farget med Mayers hematoksylin for histopatologisk undersøkelse.
Etter vasking i 1 x PBS og inkubering i H
2o
2 ved romtemperatur for å blokkere endogen peroksidase, delen ble inkubert med fortynnet normal blokkerende serum fremstilt fra de arter som det sekundære antistoff blir gjort. Platene ble inkubert i fuktig kammer over natten ved 4 ° C med primære humane reaktive antistoffer for Ki67 (klon SP6, kanin monoklonalt antistoff, Thermoscientific) ved en fortynning 1:200 og DNMT3b (klon 52A1018, monoklonalt antistoff fra mus, IMGENEX) ved fortynning 1 :150. Etter 30 min sekundært biotinylert antistoff og 30 min Vectastain Elite ABC reagens glassene ble deretter inkubering med peroksidase-substrat-oppløsning (DAB). Lysbilder ble kontra med Mayers hematoksylin for 1 min, og montert i vandig Mount Rask (Bioptica). Mikroskopisk undersøkelse ble utført fra 2x til 40x forstørrelse under en Olympus BX43 lysmikroskop tilkobles et videokamera for digital oppkjøp og bildeanalyse (DP20 Olympus). Verdiene av DNMT3b og Ki67-positive kjerner ble uttrykt som prosentandelen av positive eller negative celler over telle minst 500 totale celler ved 20x opprinnelig forstørrelse.
Statistisk analyse
cellecyklusen faser er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av minst n = 3. Tre-Ways ANOVA ble anvendt for å sammenligne virkningen av forskjellige behandlinger (CTRL, 6,8 ug 5-aza-2′-dC; 120 ng 5-aza-2′-dC; 1,5 × 10
8 A-EMHVs) på cellesyklus faser (sub G1, G0-G1, S, G2-M) og One-Way ANOVA ble brukt til å sammenligne effekten av A-EMHVs behandling på utvalgte tidspunkter (24 , 48 og 96 timer).
De apoptotiske celler ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av minst n = 3. Statistisk analyse ble utført med One-Way ANOVA uavhengig for tidlig og sent apoptose på loggtransformerte data for å bedre normalisering. Parvise sammenligninger ble testet ved anvendelse av Tukey s ærlig betydelig forskjell kriterier.
in vivo
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av n = 6. en-Way ANOVA ble brukt til å sammenligne tumormasse reduksjon i evalueringen av xenograft implantatet etter å ha valgt behandling ved hjelp av data som samles inn ved den siste injeksjonen. For å beskrive tumormasse reduksjon rate (50%) hos mus etter utvalgte behandlinger, ble Kaplan-Meier analyse anvendt fulgt av log-rank test.
Etikk uttalelser
Menneskelige røde blodceller ble oppnådd fra transfusjons poser samlet inn fra anonyme friske frivillige donorer, som har gitt sitt skriftlige samtykke utført i samsvar med italiensk regjering lov. Det var ikke nødvendig godkjennelse fra en Institutional Review Board (etikkutvalg) siden verken direkte menneskelig deltakelse eller involvering av humane studier har vært forutsett i dette arbeidet. Prøvene har blitt gitt av Azienda Ospedaliera Universitaria Senese.
Den prekliniske Studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i det internasjonale retningslinjer for håndtering av forsøksdyr og bruk 3R til eksperimenter (i henhold til NIH og EU-kommisjonens anbefalinger)
protokoller for dyreforsøk ble godkjent av etikkomiteen av Marshall University (Huntington, WV, USA) (Permit Number:. # 458 /2010) og av etiske komiteer i Toscana biovitenskap og Istituto Superiore di Sanita (ISS) på vegne av italienske helseministeren (Permit Number: # CNR-270111 exp1 /prot1). Animal trivsel ble overvåket i henhold til Langford et al, 2010. [36] «
Resultater
Karakterisering av romanen kreft formulering i erytrocytt-basert medikament leveringssystem
Å forbedre ytelsesprofil av 5-aza-2′-dC pro-medikament, med hensyn til kjemisk stabilitet, farmakokinetikk og farmakodynamikk, utviklet magnetiske erytrocytter bærer (EMHVs) ble anvendt som medikamentleveringssystem (DDS). Kinetikken for EMHV DDS internalise og dens toksisitet, så vel som effektivitet og effekt av denne nye anticancer 5-aza-2′-dC formulering ble testet for det første
in vitro
i hormonsensitiv (LNCAP) og resistente (DU145) prostata kreftceller.
internalisering av EMHVs holderen inn tumorcelle
in vitro
.
den kinetiske av EMHVs intern i begge LNCaP og DU145 prostata kreft celler ble bekreftet av Confocal Laser Scanning Mikros analyse ( CSLM) ved å overvåke fordelingen av frigjorte fluorescerende NPS (grønt) inn i cytoplasma av målceller (fig. 1). Et eksempel på DU145 naive celler er vist i fig. 1A. Intern allerede finner sted i 6 timer etter behandling, da EMHVs ble funnet inne i cytoplasma i DU145 cellene. På dette stadiet EMHVs fremdeles beholde sin intakt membran og deres innhold av NPS (Fig. 1B). I likhet med det som finnes i vårt tidligere arbeid [33], etter internalisering av membran EMHV sikringer med membran av vertscellen som frigjør den fluorescerende innholdet i hele cytoplasmiske plass (fig. 1C-E). Senest tidspunkter (48-96 timer) en bred spredning fluorescens av NPs er synlig i cytoplasma selv om vertsceller vises morfologisk sunt og ingen cytotoksiske effekten er synlig (fig. 1D-E).
Representant CLSM bilder av EMHVs internalisering og frigjort nanopartikkelfordeling (grønn fluorescens signal, B-E) i vertscellens cytoplasma ved flere tidspunkter er avbildet. Naive celler (A) er rapportert som kontroll. I (B), etter 6 timers behandling, er en intakt EMHV til stede i cytoplasma (pil). Etter 24 timer (C) partiklene syntes å ha blitt løslatt fra EMHVs. I bildene tatt ved 48 (D) og 96 (E) timer, nanopartikler synes å ha homogent fordelt gjennom hele cytoplasmaet. Mangel på toksisk effekt av erytrocytt medikamentleveringssystem behandlingen ble evaluert ved FACS-analyse (F) der celle profil av de behandlede celler (EMHVs) på utvalgte tidspunkter viser ingen signifikante endringer i sub-fase distribusjoner med hensyn til kontroll (CTRL).
Mangel på toksisitet av EMHV bærere på cellemodeller.
Giftigheten av EMHV DDS mot vertsceller ble vurdert ved å analysere cellesyklus faser av målceller. Ved behandling med ubelastede EMHVs i 48 og 96 timer, ingen skift i LNCaP og DU145 celle fasefordelingen var detekterbar og cellene beholdt sin normale cellesyklus for varigheten av behandlingen (fig. 1F). Dette funnet tyder på at EMHVs medikamentleveringssystemet ikke utøve noen toksiske effekt på kreftceller per se.
Kjemisk stabilitet av 5-Aza-2′-dC inn EMHV bioreaktor system (A-EMHVs).
5-aza-2′-dC er et pro-legemiddel, og det krever å bli aktivert ved fosforylering til et nukleosid-trifosfat før de utøver inhibering av DNA-metylering [37].
Nylig har det blitt vist at erytrocytter fungere som bioreaktorer på grunn av deres enzymatiske systemer [34]. Dette gjør dem egnet for innkapsling av pro-medikamenter som senere vil bli omdannet til det aktive medikamentet [38]. Last 5-aza-2′-dC pro-legemiddel inn EMHV bioreaktor system ble oppnådd i henhold til en standardisert protokoll (se materialer og metoder). HPLC-MS ble benyttet for å kvantifisere den totale mengden av medikament inne i DDS (A-EMHVs) og for å detektere nærværet av dets aktive fosforylerte former. Kromatogrammet av prøvene inkubert i 24 timer ved 37 ° C fremhevet en blanding av forskjellige fosforylerte former av 5-Aza2′-dC (fig. 2). Di- og tri-fosfat former av fosforylert 5-Aza2′-dC Elute ved RT 16.6 og 16.5 henholdsvis RT (Fig. 2B og 2C). Figur 2D viser toppen av cytidin thriphosphate (CTP, RT: 16,5), en intern standard som vi har lagt til våre prøver som kontroll. Det ser ut til at tri-fosfat form av 5-Aza2′-dC overbears de andre fosforylerte formene som beviser den høye effektiviteten av EMHVs som bioreaktorer. Vi fant at 1,5 x 10
8 A-EMHVs plass til omtrent 120 ng av totalt medikament, og at de aktive fosforylerte former av 5-aza-2′-dC representerer 50% av den totale loaded medikament inn i A-EMHVs.
(A) kromatogrammene for 5-Aza-2′-dC mono-fosfat; (B) di-fosfat (RT: 16,6); (C) tri-fosfat (RT: 16,5) og (D) indre standard CTP (RT: 16,5).
Den anti-proliferativ aktivitet av A-EMHVs
in vitro
.
den anti-proliferativ effekt av A-EMHV i indusere cellesyklus og apoptose ble testet i både prostatakreft modeller: hormonfølsom LNCaP celler og androgen uavhengig prostatakreft DU145 cellelinje hvor tradisjonelle terapeutiske tilnærminger hemmet av mangel på respons til hormonbehandling og PSA-antigen ekspresjon på cellemembranen.
effekten av 1,5 x 10
8 A-EMHVs behandling, inneholdende omtrent 120 ng indre 5-Aza2′-dC, har vært sammenlignet med den av fri 5-aza-2′-dC anvendt i en dose på 2,5 uM (totalt 6,8 ug) skaleres ned fra den terapeutiske dosen som brukes i klinikker. Vi sammenlignet også effekten av den samme mengde av 5-aza-2′-dC inneholdt inne i A-EMHVs (120 ng) anvendt som fri medikamentløsning.
I hormon responsive LNCaP-celler (fig. 3A) , A-EMHVs behandling induserte en betydelig anrikning i sub G1 som tyder på en mulig aktivering av apoptotisk respons (fig. 3A). Dette skiftet var allerede påvises ved 48 timer etter behandling (figur 3A midtre panelet.) Og nådde statistisk signifikans på 96 timer (ANOVA p 0,05). En tilsvarende dreining mot under G1 fordeling ble oppnådd også ved bruk av 6,8 ug av fri 5-aza-2′-dC (ANOVA p 0,05), men denne dosen er mer enn 50 ganger høyere enn den 5-aza-2′-dC lastet i A-EMHVs. Videre, er effekten av 6,8 ug fri 5-aza-2′-dC-behandlingen synes å ha et senere angrep sammenlignet med A-EMHVs. Dette er sannsynligvis på grunn av det faktum at 5-aza-2′-dC, innkapslet i den EMHVs lett slått inn fosforylerte formene forbedring av 5-aza-2′-DC farmakokinetikk /farmakodynamikk. Særlig lave doser av fri 5-aza-2′-dC (120 ng) ikke utøver under G1 skift effekt og cellesyklusen fordelingsprofil var ikke forskjellig fra kontroller opp til 96 timer.
1,5 x 10
8 A-EMHVs behandling, inneholdende 120 ng interne 5-Aza-2′-dC, ble sammenlignet med 6,8 mikrogram gratis 5-Aza-2′-dC og 120 ng gratis 5-Aza-2′-dC behandlinger på 24 (øverst) 48 (midten) 96 (nederst) timer. Ubehandlede celler ble anvendt som kontroll (CTRL). I begge LnCap (A) og DU145 (B) cellelinjer, A-EMHVs behandling induserte en betydelig anrikning i under G1 cellefordeling (sorte stolper) som allerede er detekterbar ved 48 timer etter behandling (A og B midtpanelet, henholdsvis) som varer inntil 96 timer (* ANOVA p 0,05). Ligner skifte mot sub G1 fordeling ble også oppnådd ved bruk av 6,8 mikrogram av fri 5-Aza-2′-DC (§ANOVA p 0,05), men bare oppdaget på 96 timer. Ingen endring i cellesyklusfordeling ble oppdaget for gratis 120 ng 5-Aza-2′-DC, ikke ulik fra kontrollene.
En lignende trend mot sub G1 fasen ble beskrevet i hormonresistent DU145 cellelinje
