Abstract
introduksjon til
microRNAs (mirnas) spiller viktige roller i regulering av biologiske prosesser på post-transkripsjonelle nivå. Deregulering av miRNAs har blitt observert i kreft, og mirnas blir undersøkt som potensielle biomarkører om diagnose, prognose og prediksjon i kreft ledelse. Sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) blir ofte brukt, ved måling miRNA uttrykk. Passende normalisering av RT-qPCR data er viktig for å sikre pålitelige resultater. Hensikten med denne studien var å identifisere stabilt uttrykt mirnas gjeldende som Normaliser kandidater i fremtidige studier av miRNA uttrykket i endetarmskreft.
Materialer og metoder
Vi utførte høy gjennomstrømming miRNA profilering (OpenArray ®) på ti par av laser mikro-dissekert endetarmskreft vev og tilstøtende stroma. En global middeltemperatur uttrykk normalisering strategi ble brukt for å identifisere de mest stabilt uttrykt mirnas for senere validering. I det første validerings eksperiment ble et panel av mirnas analysert på 25 parene av mikro dissekert endetarmskreft vev og tilstøtende stroma. Deretter ble de samme mirnas analysert i 28 par av endetarmskreft vev og normal rektal slimhinne.
Resultater
Fra miRNA profilering eksperiment, MIR-645, MIR-193a-5p, speil 27a og la-7g ble identifisert som uttrykkes stabilt, både i ondartet og stromal vev. I tillegg bekreftet NormFinder høy ekspresjon stabilitet for de fire mirnas. I RT-qPCR basert valideringsforsøk, ingen signifikant forskjell mellom tumor og stroma /normal rektal mukosa ble oppdaget for gjennomsnittet av Normal kandidater MIR-27a, MIR-193a-5p og la 7g (første validering
P
= 0,801, andre validering
P
= 0,321). MiR-645 ble ekskludert fra dataanalysen, fordi det var uoppdaget i 35 av 50 prøver (første validerings) og i 24 av 56 prøver (andre validerings), henholdsvis. Det ble ikke observert signifikant forskjell i uttrykksnivået RNU6B mellom svulst og tilstøtende stromal (første validering), og mellom tumor og normal rektal slimhinne (andre validering).
Konklusjon
Vi anbefaler at uttrykket av MIR-27a, MIR-193a-5p og la 7g som normaliseringsfaktor, når du utfører miRNA uttrykket analyser av RT-qPCR på endetarmskreft vev
Citation. Eriksen AHM, Andersen RF, Pallisgaard N, Sørensen FB , Jakobsen A, Hansen TF (2016) mikroRNA expression profilering for å identifisere og Valider referanse gener for Relativ Kvantifisering av mikroRNA i endetarms kreft. PLoS ONE 11 (3): e0150593. doi: 10,1371 /journal.pone.0150593
Redaktør: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, USA
mottatt: 08.09.2015; Godkjent: 17 februar 2016; Publisert: 03.03.2016
Copyright: © 2016 Eriksen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA-molekyler som virker som negative genet regulatorer på post-transkripsjonsnivået. Disse små RNA består av 18-25 nukleotider, og spiller en viktig rolle i regulering av biologiske prosesser som celle-differensiering, proliferasjon og apoptose. Endringer i miRNA ekspresjons-profiler er forbundet med unormal cellefunksjoner og er blitt observert i en rekke sykdommer, inkludert kreft [1, 2]. Mange mirnas målrette onkogener og tumorsuppressorgener med direkte engasjement i kreftutvikling [3]. På grunn av sammenhengen mellom mange mirnas og kreft, er mirnas etterforskes som potensielle biomarkører om diagnose, prognose og prediksjon i kreft ledelse [2, 4].
Sanntids kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR) er allment akseptert som den foretrukne metode for å relativ genekspresjon kvantifisering, siden det er den mest følsomme og reproduserbar metode. Imidlertid er nøyaktigheten og presisjonen av resultatene er avhengig av riktig data normalisering. Referanse gener er nødvendige for å korrigere for ikke-biologiske sample-til-sample variasjoner, som kan bli introdusert i løpet av alle trinn fra prøvepreparering for forsterkning. Bruken av ikke-stabilt uttrykket referanse gener for normalisering kan føre til uriktige konklusjoner. Det er generelt akseptert at en universell referanse gen egnet for alle typer vev ikke eksisterer [5-8]. Den mest nøyaktige metode er å velge stabilt uttrykket referanse gener for hvert enkelt eksperiment i henhold til vevet av interesse [9].
Til tross for et økende antall miRNA ekspresjonsstudier, er litteratur meget sparsom, når det gjelder endetarmskreft og pålitelige Normal kandidater.
Formålet med denne studien var å identifisere stabilt uttrykt mirnas i endetarmskreft vev som skal brukes som Normalisering i fremtidige miRNA uttrykket studier. I denne sammenheng miRNA-Normalisering vil bli referert til som referanse gener. Vi studerte uttrykket profilen til miRNAs i laser mikro-dissekert tumorvev og tilstøtende stromal vev fra prøver av pasienter med endetarmskreft. Først valgte vi de mest stabilt uttrykt mirnas fra vår high-throughput teknologi basert miRNA uttrykket profilering studie på 10 pasienter (OpenArray®, Life Technologies). For det andre, stabiliteten av disse mirnas ble videre undersøkt ved RT-qPCR i endetarmskreft vev fra 25 andre pasienter. Til slutt, analyserte vi stabiliteten av de samme mirnas i endetarmskreft vev og normal rektal mukosa fra 28 sammenlignbare pasienter. Vi inkluderte brukte små kjernefysiske RNA RNU6B i alle våre analyser.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
Pasientene ble tilfeldig valgt fra en kohort av 239 pasienter som gjennomgår reseksjon av endetarmskreft i Vejle Hospital, Danmark fra 1999 til 2008. Inkludering ble oppnådd bare hvis deres histopatologisk diagnose var rektal adenokarsinom, hvis de ikke hadde noen preoperativ kjemoterapi eller strålebehandling, og hvis formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) endetarmskreft vev var tilgjengelig
for miRNA uttrykket profilering analyse, svulstvev fra totalt 10 pasienter (5 mannlige, 5 kvinnelige, median alder 74, range 59-86 år). ble valgt som representerer ulike patologiske tumorstadier (pT1- pT4) og forskjellig mengde av lymfocytter i tumor-mikromiljøet (tabell 1). For det første validerings studien, vev fra en annen 25 rektale kreftpasientene (13 mannlige, 12 kvinnelig; median alder 68 område 49-87 år) ble valgt i henhold til tumorstadium, men uavhengig av antall stromale lymfocytter; femten svulster ble klassifisert pT3 ble ti svulster klassifisert pT4. For det andre valideringsstudie, endetarmskreft vev og normal rektal slimhinne fra 28 andre pasienter (13 menn, 15 kvinner, median alder 70, range 45-89 år) ble inkludert; alle svulster ble klassifisert pT3.
Ifølge The Danish National Committee on helsefaglig forskningsetikk, etisk godkjenning og skriftlig informert samtykke var ikke nødvendig, fordi hensikten med studien var kvalitetsutvikling og ingen kliniske data var videre analysert (forskningsetikkloven gjennomgang av helse forskningsprosjekter, jf § 14, pkt 1). Det er ingen Prøver ble oppsamlet spesielt for formålet med denne studien. Prøvene ble samlet i løpet av standardbehandling. Prosjektet ble gjort anonymt. Vevet brukt i denne studien ble bekreftet ikke å bli inkludert i det danske registeret av menneskelig vev Utnyttelse. Studien er meldt til den danske Datatilsynet.
Laser mikro-disseksjon
For å spesifikt vurdere miRNA uttrykket i endetarms adenokarcinomceller og i de omkringliggende stroma, laser mikro-disseksjon (LMD) ble utført (figur 1). Tilgjengelige histologiske snitt farget med hematoksylin og eosin ble undersøkt av en patolog for å velge den dypeste invasiv FFPE seksjon fra svulsten. For miRNA ekspresjonsanalyse, ble et likt antall tilfeller med et høyt forhold til en lav mengde av lymfocytter i den tilstøtende stromal vev valgt (tabell 1). I henhold til ovenstående seleksjon, ble seksjoner (8-10 mm) skåret ut fra FFPE-vev og som er festet til rammen lysbilder for membranbaserte LMD, ved bruk av Leica LMD6500 Micro (Leica). Objektglass ble tørket i 45 minutter ved 60 ° C, vasket to ganger i 5 minutter i xylen for å fjerne parafin, rehydrert med en gradert etanolserie (99%, 99%, 96%, 70%), skylt i demineralisert vann, farget for 3 min med hematoksylin, skyllet i 5 minutter i demineralisert vann, og fikk lufttørke. Svulstceller (a) og tumor mikro-miljø stroma (b) ble isolert ved LMD og oppsamlet separat i hettene på 0,5 ml RNase-frie PCR-rør, hvor en dråpe etanol ble tilsatt. For det andre validering eksperiment ble tumorcellene isolert ved LMD, mens den normale rektal mukosa ble fjernet fra skinnene med en skalpell.
Områder i tumorceller er blitt fjernet (piler). Områder som skal fjernes fra stromal vev er merket (røde linjer).
RNA ekstraksjon
RNA ble isolert ved hjelp av miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Siden parafin ble fjernet før LMD ble det første trinnet å tilsette en lyseringsbuffer inneholdende proteinase K, fulgt av en kort inkubasjon ved en høyere temperatur. Dette ble etterfulgt av DNase-behandling og RBC-buffer behandling. Etanol ble tilsatt, og prøven ble applisert på en RNeasy MinElute spinnkolonne, hvor det totale RNA, inkludert miRNA, bundet til membranen ble vasket bort. Til slutt ble total RNA, inkludert miRNA, eluert i 14 mL RNase-fritt vann.
OpenArray® Paneler
OpenArray® Menneskelig mikroRNA Panel (Life Technologies, Foster City, CA, USA) er en høy gjennomstrømming PCR-basert miRNA matrise som muliggjør analyse av mer enn 750 forhåndsdefinerte mirnas på en microfluidic plattform. Enkelt-trådet cDNA ble reverstranskribert fra total-RNA ved hjelp av Megaplex ™ RT-primere, Human Pool A eller B. Hvert RT reaksjon hadde et sluttvolum på 7,5 pl og inneholdt total RNA (3 mL) og reagenser fra TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit ( 4,5 mL) (Life Technologies).
Preamplification (16 sykluser) ble utført med megaplex ™ preamp Grunning Menneskelig Pool A eller B (Life Technologies) og TaqMan preAmp MasterMix (Life Technologies) i henhold til produsentens standardinstruksjoner for lav sample-inngang (LSI). Den PreAmp Produktet ble fortynnet 1:40 i TE-buffer. For å teste resultatet av revers transkripsjon og preamplification før vi gikk videre til OpenArray® ble produktene testet med enkel analyse qPCR for enten MIR-16 (Pool A) eller MIR-151-3p (Pool B). Analysene ble gjort i 20 mL reaksjoner i to eksemplarer ved hjelp av 1,3 mL fortynnet prøve. Begge mirnas ble oppdaget.
For qPCR trinnet, TaqMan® OpenArray® Menneskelig mikroRNA Panels (Life Technologies) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. qPCR ble utført ved hjelp QuantStudio 12K Flex System (Life Technologies). Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer, hvor hver prøve ble analysert på tre forskjellige OpenArray® paneler.
Validering RT-qPCR
Custom TaqMan® Array mikroRNA kort (Life Technologies) ble brukt i henhold til produsentens standardinstruksjoner om LSI. RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Custom Mirna RT Primer Pools leveres sammen med Array kort. Hver RT reaksjon inneholdt 3 pl total RNA og 4,5 mL RT reaksjon mix fra TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit.
5 pl RT produktet ble preamplified (14 sykluser) med Custom PreAmp Primer Pools (følger med Array kort) og TaqMan PreAmp Mastermix i 25 pl reaksjoner. Den PreAmp Produktet ble fortynnet 1: 4 i TE-buffer. qPCR analyser ble utført ved hjelp av TaqMan® Universal Master Mix II NoAmpErase® UNG og Applied Biosystems 7900 HT Real-Time PCR System. Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer.
Begge validering eksperimenter fulgt den samme fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor.
Dataanalyse
Høy throughput data generert fra TaqMan® OpenArray® RT-qPCR ble analysert ved hjelp av Expression Suite Software versjon 1.0.3 (Life Technologies), en data-analyse verktøy som utnytter den komparative Cq (ΔΔCq) metode for å kvantifisere relativ genekspresjon over et stort antall gener og prøver. Relativ kvantifisering (RQ) -også kalt Fold Change (FC) -ble beregnet fra CQ verdier i henhold til ligningene: (a) ΔCq = Cq (miRNA) -Cq (global middeltemperatur); (B) ΔΔCq = ΔCq (tumor) -ΔCq (stroma); og (c) RQ = 2
-ΔΔ
Cq
, hvor Cq er definert som PCR syklus nummeret som fluorescens møter terskelen i forsterkning plottet.
Expression Suite utfører en uparet t-test for biologiske gruppesammenligninger, forutsatt at CQ verdier for begge gruppene følger en normalfordeling.
for å analysere uttrykk stabiliteten av referansen genet kandidater, programmet NormFinder [10] ble brukt i henhold til utviklerens anbefalinger. NormFinder beregner en stabilitet verdi for et panel av referansen genet kandidater som kombinerer den inter- og intra-gruppe uttrykk variasjon. De laveste verdiene indikerer de mest stabilt uttrykte referanse gener. Gjennomsnittsverdier av triplikate CQ-verdier ble omdannet til lineære verdier for Norm Finder og statistiske analyser, ved ligningen lineære verdi (Cq) = 2
–
Cq
, forutsatt at utvidelseseffektiviteten for referanse genet analysene er nær 100%. Statistiske analyser ble utført ved hjelp NCSS 2007 (NSCC LLC, Kaysville, UT, USA). I valideringsforsøk, ble Wilcoxon Rank Sum-test brukes til å teste for forskjeller i median, når man sammenligner tumor og stroma (første validering) og tumor og normal slimhinne (andre validering). P-verdier under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant for alle testene.
Resultater
Identifikasjon av kandidat referanse gener ved hjelp av Expression Suite Software
Vi profilerte et panel av mer enn 750 mirnas og kontroller på 10 par endetarmskreft vev og tilstøtende stromal vev. I utgangspunktet en global middeltemperatur uttrykk normalisering strategi ble brukt for å identifisere de mest stabilt uttrykt mirnas [2]. Data ble ekskludert fra videre analyser, hvis CQ-verdiene oversteg 35 og /eller forsterkningen stillingen var under 1,24.
Fra Expression Suite dataanalyse, de fire referanse genet kandidater la-7g, MIR-193- 5p, MIR-27a, og MIR-645 (tabell 2) ble valgt ut fra følgende kriterier: (a) Relativ kvantifisering (RQ) nær 1: 1 (hvor referansen biologiske gruppen er stromal vev); (B) miRNA detektert i mer enn 70% av alle replikater av alle prøvene; (C) Cq-verdier mellom 18 og 28; (D) ingen intensjoner inkludert miRNA som et mål i vår fremtidige prosjekter. I tillegg har vi sett på p-verdi, vurderer en høy p-verdi ble antydet ingen stor forskjell mellom vev grupper og ingen store spredningen av CQ verdier innenfor gruppene.
For å legge til en ny regel akseptert metode, et panel av 10 mirnas, alle møte de ovennevnte kriterier ((a) – (d)), ble analysert ved bruk av Norm Finder (tabell 3). RQ varierte fra 1: 0.8 til 1: 1.2 (hvor referanse biologisk gruppen var stroma). P-verdien ble ikke vurdert når du velger mirnas for denne analysen. RNU6B ble inkludert i denne analysen. Undersøkelsen identifiserte la 7g, MIR-193a-5p, MIR-27a, og MIR-645 blant en gruppe mirnas med lav og nesten like stabil verdi, noe som indikerer høy uttrykk stabilitet. RNU6B viste en 10 ganger høyere stabilitet verdi, noe som indikerer lavere uttrykk stabilitet enn de andre referanse genet kandidater. Omstilling fra to biologiske grupper (tumor og stromaceller) til tre grupper (tumor, stromaceller med lav mengde av lymfocytter, og stromaceller med høy mengde av lymfocytter) hadde bare mindre virkning på stabilitetsverdiene (data ikke vist).
RT-qPCR-basert validering av referansen genet kandidater i svulsten og tilstøtende stroma
uttrykk mønstre av la-7g, MIR-193a-5p, MIR-27a, MIR-645 og RNU6B var videre analysert på 25 parene av endetarmskreft og tilstøtende stromal vev. Fordi MIR-645 ble kun påvist i 15 av 50 prøver, var dette miRNA eliminert fra ytterligere dataanalyser. La-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a viste forskjellige, men målbare uttrykk nivåer og alle av dem ble uttrykt i alle 50 prøver. Rå CQ nivåer varierte 20,1 til 28,9 for la-7g, 23,2 til 31,1 for MIR-193a-5p, og 19,7 til 26,4 for MIR-27a. For RNU6B rå Cq nivå varierte 12,0 til 23,6. Boksplott vist for aritmetisk gjennomsnitt av la-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a, og for RNU6B i figur 2. Det aritmetiske gjennomsnittet av CQ verdier for la-7g, MIR-193a-5p og speil 27a, og CQ verdier for RNU6B ble omgjort til lineære verdier, og Wilcoxon Rank Sum-test for forskjell i median ble utført. Vi har observert en signifikant forskjell for RNU6B (
P
= 0,004) mellom tumorvev og tilstøtende stromal vev, mens ingen signifikant forskjell ble påvist for middelverdien av de andre tre referanse gen kandidater: la-7g, MIR -193a-5p og MIR-27a (
P
= 0,801).
uttrykk av referansen genet kandidater i endetarmskreft vev (n = 25) og tilstøtende stromal vev (n = 25) ( A), og i endetarmskreft vev (n = 28) og normale rektal mukosa (n = 28) (B). Verdiene er gitt som kvantifisering sykluser (CQ). Bokser (grønne, kreft vev, blå, stromal vev, grå, normal slimhinne) representerer øvre og nedre kvartil med medianverdier som horisontale linjer. Whiskers skildre 1,5 x det interkvartile området. Uteliggere blir ikke vist. P-verdier er ifølge Wilcoxon Rank Sum Test for forskjellen i medianverdier. RNU6B viste en signifikant forskjell mellom tumor og stroma (A), og mellom tumor og normal slimhinne (B). Det er ingen vesentlig forskjell i at uttrykket nivået av la-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a mellom tumor og stroma (A), og mellom tumor og normal slimhinne (B).
RT-qPCR-basert validering av referansen genet kandidater i tumor og normal slimhinne
Som andre validering, de uttrykk mønstre av la-7g, MIR-193a-5p, MIR-27a, MIR-645 og RNU6B ble analysert i løpet av 28 parene av endetarmskreft vev og normale rektal mukosa. MiR-193a-5p, MIR-27a og RNU6B ble påvist i alle 56 prøver. La-7g ble påvist i 55 prøver og uoppdaget i en prøve med normal rektal slimhinne. Fordi MIR-645 ble bare påvist i 32 av 56 prøver, ble dette miRNA ikke tatt med i den videre analyse av data. Raw CQ nivåer varierte 18,2 til 29,5 for la-7g, 20,9 til 34,7 for MIR-193a-5p, 18,7 til 29,5 for mi-27a, og 14,3 til 29,7 for RNU6B. Boksplott vist i figur 2. Ingen signifikant forskjell ble påvist for det aritmetiske gjennomsnitt av la-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a (
P
= 0,321) mellom svulstvev og normal slimhinne , mens for RNU6B, observerte vi en signifikant forskjell (
P
= 0,031).
Diskusjoner
bruk av pålitelige referanse gener for normalisering er av stor betydning, når du utfører RT-qPCR basert forskning. Normaliserings prosedyre kompenserer for variasjoner i RNA-ekstraksjon yield, reverse-transkripsjon avkastning, og effektiviteten av utvidelsen, og dermed muliggjør sammenligning av miRNA uttrykk nivåer på tvers av ulike prøvene [11].
Det er allment akseptert, at en enkelt , universell referanse gen ikke finnes, og det er blitt hevdet at den mest nøyaktige normaliseringen blir oppnådd ved å velge referanse gener som tilhører den samme klassen av RNA som de undersøkte gener. Videre anbefales det å søke etter stabilt uttrykte gener i hver eksperimentell system [12, 13].
Davoren
et al
. rapportert den første systematisk identifisering av referansen genet kandidater til miRNA RT-qPCR eksperimenter brystkreft i 2008 [5]. I 2010 Chang
et al
. rapporterte deres identifisering av referansen genet kandidater til miRNA RT-qPCR i tykktarmskreft [6], der de identifiserte de seks mest stabilt uttrykt mirnas som la-7a, MIR-16, MIR-26a, MIR-345, MIR-425 og MIR-454.
for å finne bestemt informasjon om referanse gener for miRNA uttrykket studier i endetarmskreft, utførte vi et søk i PubMed. Ved hjelp av mesh begrepene «microRNAs» og «endetarmskreft», fant vi 9 artikler om endetarmskreft uttrykk studier, publisert før i februar 2015, og som inkluderte informasjon om bruk av referanse gener. (Tabell 4; [3, 14-21])
Dette søket viser at små nukleære RNA var vanlige referanse gener i endetarmskreft eksperimenter, hvor RNU6B ble foretrukket. Men ved bruk av disse små RNAer som referansegener kan være problematisk, til tross for de viser stabil ekspresjon nivåer i normalt vev, har de vist forskjellige ekspresjonsnivåer i kreftvevet sammenlignet med normalt vev [4]. I tillegg detaljer om utvalg og validering av de benyttede referanse gener og hvorvidt de ble stabilt uttrykt over undersøkte vev er ofte ikke gitt. Ingen av studiene benyttet en miRNA som referanse genet.
Videre, ifølge Peltier
et al
., Den mest brukte referansen genet i endetarmskreft eksperimenter, RNU6B, ble vist å være en av de minst stabilt uttrykt RNA arter [8].
Så langt vi kjenner til, er dette den første OpenArray® basert og påfølgende RT-qPCR-validert identifisering av egnede referanse gener i endetarmskreft prøver alene. Fordi, så langt har RNU6B vært den mest brukte endogen kontroll i endetarmskreft studier, besluttet vi å inkludere det i våre eksperimenter for sammenligning. Vi profilert uttrykk for menneskelige mirnas (inkludert RNU6B) på 10 par endetarmskreft vev og tilstøtende stromal vev. Siden referanse genene kommer til å bli brukt for normalisering i fremtiden RT-qPCR analyser av endetarmskreft biopsier som bare inneholder kreftceller og tilstøtende stromal vev, gjorde vi ikke inkluderer normal rektal slimhinne i de innledende analysene. Ved å bruke den globale middeltemperaturen uttrykk verdi for normalisering, identifiserte vi de mest stabilt uttrykt mirnas: la-7g, MIR-193a-5p, MIR-27a og MIR-645. Den globale gjennomsnitts normalisering har tidligere vist seg å være bedre enn andre tilnærminger av normalisering i å redusere tekniske variasjoner og viser biologiske endringer [2].
Senere bruk av NormFinder bekreftet høy uttrykk stabilitet for de fire mirnas, som var alt om ti ganger mer stabil enn den som ofte brukes referanse-genet RNU6B. Siden mengden av stromale lymfocytter gjorde ingen vesentlige forandringer av stabilitetsverdiene, konkluderte vi at mengden av lymfocytter som ikke påvirker uttrykket nivåer av disse mirnas, og antall lymfocytter i stromal rommet ikke ble tatt hensyn til i valideringsforsøk .
Vår første validering forsøket ble utført i en større kohort av 25 par av vev og bekreftet ingen signifikant forskjell (
P
= 0,801) i gjennomsnittlig uttrykk verdi for la-7g, speil 193a-5p og MIR-27a mellom endetarmskreft vev og tilstøtende stromal vev. Fraværet av en signifikant forskjell beviser ikke et tilsvarende ekspresjonsnivå mellom tumorvev og tilstøtende stromal vev; Men på den annen side en høy p-verdi taler for likestilling eller mindre forskjeller. Den betydelige forskjellen i uttrykket av RNU6B mellom svulstvev og tilstøtende stroma (
P
= 0.004) er i samsvar med tidligere resultater [8]. MiR-645 ble ekskludert, fordi det ikke var representert i alle prøvene.
For ytterligere å validere resultatene, gjorde vi en ny validering i en kohort av 28 par av endetarmskreft vev og normal rektal slimhinne. Som i de to innledende forsøk, fant vi ikke en signifikant forskjell (
P
= 0,321) mellom aritmetisk gjennomsnitt av uttrykket nivåer av la-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a i endetarms kreftvev og den sammenrommet (i dette tilfelle den normale rektal slimhinne), mens en signifikant forskjell ble påvist for ekspresjonsnivået av RNU6B (
P
= 0,031). Som i den første valideringsstudie, ble MIR-645 uoppdaget i en betydelig del av prøvene (24 av 56), og derfor fortsatt ikke egnet som en referanse genet i denne innstillingen.
MiR-645 var bredt oppdaget i OpenArray®, men ikke i de to valideringsforsøk. Fordi det var ingen forskjeller i de grunnleggende egenskapene mellom prøvene brukes i identifisering forsøket og den påfølgende valideringer, er sannsynlig å være forårsaket av plattformen forskjeller i oppklaringsprosenten. De store variasjonene i påvisning av MIR-645 i de ulike plattformene understreker viktigheten av å validere resultatene fra en high-throughput metoden.
Ifølge www.miRBase.org, la-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a ikke tilhører samme miRNA-familier, noe som reduserer sjansen for at de kan være co-regulert. Valg av tre referanse gener møte Vandesompele
et al
. Anbefaling om å bruke minst tre riktige referanse gener for å beregne en normaliseringsfaktor [12].
I konklusjonen, basert på en høy -throughput RT-qPCR miRNA profilering studie og to påfølgende RT-qPCR basert valideringsforsøk, anbefaler vi middelverdien av la-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a som normaliseringsfaktor, når du utfører miRNA uttrykket analyser av RT-qPCR på endetarmskreft vev.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Data fra den innledende profilering eksperiment (OpenArray®)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150593.s001 plakater (XLSX)
S2 Table. Data fra den første validerings eksperiment (tumor og stroma)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150593.s002 plakater (XLSX)
S3 Table. Data fra andre validering eksperiment (tumor og normal rektal mukosa)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150593.s003 plakater (XLSX)
Takk
Vi er veldig takknemlig for teknisk bistand fra Birgit Røed Sørensen, Pia Nielsen, Tina Brandt Christensen og Lone Hartmann Hansen.
