Abstract
Bakgrunn
Den molekylære mekanismen mellom Helicobacter pylori (H. pylori) infeksjon og magekreft holdt seg stort sett ukjent. I denne studien fant vi ut hvilken rolle miRNA i H. pylori indusert magekreft.
Metoder og resultater
Vi fant at MIR-204 ble redusert i H. pylori positive vev ved qRT- PCR. Knockdown av MIR-204 forbedret invasjonen og spredning evne mage kreftceller in vitro. Luciferase-analyse avslørte at SOX4 var målgenet av MIR-204, som ble funnet oppregulert i H. pylori positive vev. Nedregulering av MIR-204 og over-uttrykk for SOX4 fremmet epitelial-mesenchymale overgangsprosessen.
Konklusjon
Til sammen våre funn viste at MIR-204 kan fungere som en tumor suppressor i H. pylori indusert magekreft ved å målrette SOX4
Citation. Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) Redusert MIR-204 i H. pylori-Associated gastric Cancer Fremmer Cancer Cell Proliferation og invasjon ved målretting SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10,1371 /journal.pone.0101457
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 18 mars 2014; Godkjent: 05.06.2014; Publisert: 01.07.2014
Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Guoxin Zhang ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (nr 81270476) (https://www.nsfc.gov.cn/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og andre ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Hittil har molekylære mekanismer på magekreft er undersøkt, men de har ikke fullt ut forstått [2]. Gastric karsinomer er ment å utvikle seg i henhold til en flertrinnsprosess carcinogenesen, som er sterkt assosiert med infeksjon av bakteriell patogen,
Helicobacter pylori product: (
H. Pylori
) [3].
H. pylori
, som koloniserer magen av 50% av verdens befolkning, har blitt klassifisert som et klasse I karsinogen grunn av sin utløsende rolle i utviklingen av magekreft [4].
Det har blitt rapportert at utviklingen og progresjonen av magekreft kan tilbakeføres til microRNAs (mirnas) [5] – [8]. Mirnas er små, ikke-kodende RNA som regulerer uttrykket av målgener gjennom translasjonsforskning undertrykkelse eller messenger RNA (mRNA) degradering [9]. MiR-204 avvikende uttrykk ble rapportert å assosiere med ulike kreftformer [10], [11]. Men lite er kjent om miRNA-204 funksjon i magekreft. Matsushima utført miRNA rekke studie i H. pylori positive vev og contols og fant at Mir-204 uttrykk var betydelig lavere i H. pylori positive vev [12].
Hos mennesker, sex bestemmende region Y (SRY ) boksen familie, også referert til SOX familie, består av 20 høyt konserverte transkripsjonsfaktorer som spiller viktige roller i utviklingen av prostatakreft [13]. Disse transkripsjonsfaktorer er definert ved en konservert sekvens signatur i høy mobilitet gruppe (HMG) DNA-bindende domene (DBD) [14], [15]. SOX4 er en 47-kDa protein er høyt konservert i virveldyr og klinisk betydning har fått økende oppmerksomhet de siste årene, med en rekke rapporter som tyder på at SOX4 kan bidra til tumorprogresjon [16], [17]. Økt ekspresjon SOX4 er funnet i tumorer i blæren, prostata og tykktarm, og med ikke-småcellet lungekreft [18] – [21]. Deregulert ekspresjon av SOX4 har blitt korrelert med øket cancer celleproliferasjon, celleoverlevelse, apoptose og inhibisjon av tumorprogresjon i magekreft [22]. Dens over-uttrykket har også vært knyttet til dårlig prognose på klinikkene, og det er en markør for å forutsi utfallet av pasienter med magekreft [23].
Men inntil nylig, er det uklart at om H. pylori-infeksjon kan indusere SOX4 uttrykk gjennom nedregulere MIR-204. Derfor gjennomførte vi vår studie for å undersøke nærmere rollen som MIR-204 og SOX4 i H. pylori indusert kreftutvikling.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Pasienter med eller uten H.
pylori
infeksjon hadde gjennomgått gastroscope på The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu-provinsen i Kina fra mars 2012 og desember 2013. Prøver tatt fra de 250 pasientene (150 noncancerous pasienter og 100 kreftpasienter) ble samlet, og ble identifisert positiv når hurtig urease testen var positiv. Disse utvalgte pasienter ble også bekreftet av
13C pusteprøve. Noncancerous pasienter ble klassifisert i overfladisk gastritt, atrofisk gastritt og dysplasi i henhold til den patologiske klassifisering. Denne protokollen ble godkjent av etisk komité for første tilknyttet sykehuset i Nanjing Medical University, og hver pasient hadde skriftlig informert samtykke.
Cell kultur
SGC-7901 /MKN45 mage kreft cellelinjer ( kjøpt fra ATCC) ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibico) og penicillin (100 U /ml). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2.
bakteriekultur og infeksjonsmodell
H. pylori ble inokulert i platen og dyrket ved 37 ° C i en mikroaerofil atmosfære med 5% O
2, 10% CO
2 og 85% N
2. Etter 3 dager ble den bakterielle resuspendert i RPMI-1640 medium uten FBS og infiserte celler i en MOI på 100. Cellene ble deretter høstet etter 48 timer fra infeksjonen.
Isolering av total RNA og kvantitative RT-PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra innsamlede vev og cellelinjer ved hjelp Trizol (Tarkara, Japan) og deretter både miRNA og mRNA ble revers transkribert til cDNA. Revers transkripsjon ble utført ved anvendelse av revers transkripsjon sett (Takara, Japan). Uttrykket av modne miRNAs og potensielle målgener ble målt ved QRT-PCR med SYBR Grønn PCR Kit (Takara) på Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System og menneskelig U6 RNA ble forsterket som en intern kontroll. Den relative uttrykk forholdet mellom MIR-204 ble beregnet ved 2
-ΔΔCT metode. PCR-reaksjoner ble utført med de følgende primere: for HSA-MIR-204, forover, 5′-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 «og for U6, fremover, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3». Relative uttrykk nivåer av SOX4 mRNA ble undersøkt ved SYBR Grønn real-time PCR (RT-PCR) og normalisert til GAPDH. Primerne for SOX4 var fremover, 5 «AGCCATCTCGGAGGAATA 3» og omvendt, 5 «CAGACAACCGGCCTTTAT 3′; og for GAPDH, fremover, 5»-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 «og omvendt, 5′-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3». RT-PCR ble utført ved hjelp av ABI 7500 Fast Real-Time PCR system (ABI, CA, USA).
Immunohistochemistry
Vev ble fiksert i 4% paraformaldehyde og kuttet fra parafin blokk til 5 mikrometer tykkelse. Etter awoksing med xylen og rehydratisering med en gradert serie av etanol, ble objektglass oppvarmet i autoklav i tre minutter ved anvendelse av citrat natrium-buffer (pH 6,0) og inkuberes med antistoffet SOX4 (Cell Technology signalering) ved 4 ° C over natten. Blokkering serum eller antistoff-fortynningsbuffer ble anvendt som negative kontroller. Antistoffene som anvendes før var de samme som for Western blot-analyse. Bildene er tatt av microsope (Nikon, Eclipse 50i). Antallet positive flekker celler som viser immunoreaktivitets av SOX4 i ti representative mikroskopiske felt ble talt opp, og andelen positive celler ble også beregnet. Prosentandelen scoring av immunreaktive tumorceller ble beskrevet som følger: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), og 3 ( 50%). Intensiteten ble scoret som følger: 0 (negativ), en (svak), 2 (moderat), og 3 (sterk). Ekspresjonsnivået av SOX4 ble målt ved å multiplisere prosentandelen og den intensitet. Høye uttrykk prøvene betyr svulster med en multiplisert poengsum over 4, mens de andre ble vurdert å være lav uttrykk.
Celleproliferering assasy
Celleproliferering ble undersøkt ved hjelp av vannløselig tetrazoliumsalt analysen bruker Cell telle Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). I korte,-celler (1,5 x 10
3 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners kulturplater i triplikat og inkubert i 4 dager ved 37 ° C /5% CO2 i en fuktig inkubator. Levedyktige celler ble kvantifisert ved hver 24 timers intervall ved å måle OD450 hjelp mikroplateleser. (Epoch; BioTek, Winooski, VT)
Cells (2 × 10
6) ble fiksert med 75% etanol ved 4 ° C natten over og deretter vasket med kald PBS og behandlet med RNaseI, etterfulgt av farging med propidiumjodid i 30 min i mørket. Cellesyklusanalyse ble deretter utført av flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, Sparks, MD).
Celler ble trypsinert og belagt på 6-brønners plater (500 celler /brønn) og dyrket i 2 uker. Koloniene ble farget med 1% krystallfiolett i 30 min etter fiksering med 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Antallet kolonier, definert som 50 celler /koloni ble tellet. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. Dataene ble beregnet ved hjelp av paret t-test.
Cellemigrering assay (sårhelende)
A sårhelende assay ble anvendt for å vurdere evnen til tumorcelle motilitet. I korthet ble celler (1 * 10
6 /brønn) ble sådd ut i seks-brønns plater, dyrket over natten, og transfektert med MIR-204 etterligner eller inhibitor, pcDNA-SOX4 eller pcDNA-NC. På nå konfluens, ble cellelaget skrapet med en steril plastspiss og deretter vasket med dyrkningsmedium to ganger og dyrket igjen i opp til 48 med serum redusert medium inneholdende 1% FBS. Gapet nedleggelsen ble målt og dataene ble sammenfattet på grunnlag av sextuple analyser for hvert forsøk.
Cell invasjon analysen
Cell invasjonen aktivitet ble vurdert ved hjelp av cellekultur inserts belagt med basalmembran matrix (BD Biosciences , Bedford, MA) i henhold til produsentens anvisninger. Kort fortalt ble totalt 1 × 105 celler i 0,2 ml serumfritt RPMI-1640 medium seeded på en Transwell apparat. RPMI-1640 inneholdende 10% FBS (600 ul) ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering av cellene i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator, ble celler på den øvre overflaten av innsatsen fjernes ved å gni med en bomullspinne. Cellene som invaderte til bunnflaten av innsatsen ble løst i 100% forkjøling metanol i 30 minutter, beiset i 0,5% krystallfiolett i 30 min, deretter skylt i PBS og underkastet mikroskopisk undersøkelse. Cellene ble tellet under mikroskop i fem tilfeldige felt og den relative invasjonen og migrasjon ble tolket som gjennomsnittlig antall celler ± standardavvik per felt.
Western blotting
Totalt proteiner ble utarbeidet og kvantifisert ved hjelp et proteinanalyse (BCA-metoden, Thermo, USA). Proteiner ble fraksjonert ved hjelp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran, blokkert i 5% tørrmelk ved romtemperatur i 1 time, og immunfarget med antistoff ved 4 ° C over natten ved anvendelse av anti-SOX4 ( 1:1000, CST, USA), anti-N-cadherin (1:1000, CST, USA) og anti-E-cadherin (1:1000, CST, USA). Anti-GAPDH (1:5000, Sigma, USA) ble anvendt som en kontroll lasting. Resultatene ble visualisert gjennom en kjemiluminescerende deteksjonssystem (Pierce ECL Underlag Western blot deteksjonssystem, Thermo, Pittsburgh, PA) og deretter eksponert i Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA).
Plasmid konstruksjon
Prediksjon av MIR-204 bindingssteder ble utført ved hjelp TargetScan programvare (https://www.targetscan.org). 3′-UTR sekvens av SOX4 som ble spådd til å samhandle med MIR-204 eller en mutant sekvens med den anslåtte målse ble satt inn KpnI og SacI områder av pGL3 promotervektor (Invitrogen). De ble kalt pGL3-SOX4 og pGL3-SOX4-mut. Cellene ble sådd ut på seks-brønns plater og ble transfektert med 100 ng av pGL3-SOX4 eller pGL3-SOX4-mut, og Mir-204 etterligner (50 nm) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., CA, USA). Vi normalisert forskjellene i transfeksjonseffektivitet ved ko-transfeksjon av et Renilla luciferase vektor PRL-SV40 (5 ng).
SOX4 genet, ble syntetisert (innkjøpt fra GenScript, Piscataway, NJ) med restriktiv fordøyelse ved hjelp av Mlu I og subklonet PLV-GFP plasmid, og oppkalt PLV-GFP-SOX4. Rekombinant lentivirus ble generert fra 293T-celler ved bruk av kalsiumfosfat utfelling. SGC-7901 cellelinjer ble transfektert med lentivirus ved hjelp av polybren (8 ug /ml).
luciferase-aktivitet analyse
Cellene ble dyrket i 24-brønners plater og transfektert med 0,2 ug av enten bred- type eller mutant PGL-SOX4 plasmid inneholdende ildflueluciferase, sammen med 0,01 ug av den PGL-SOX4 vektor (Invitrogen) inneholdende Renilla luciferase og 1 ug oligonukleotider. Transfeksjon ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). Relativ luciferaseaktivitet ble beregnet 48 timer post-transfeksjon av den doble luciferase reporter Assay (Promega). Alle transfeksjon eksperimenter ble utført i triplikat og gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Statistisk analyse
t-test eller enveis variansanalyse ble benyttet for statistisk analyse når det passer. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). En to-tailed verdi av P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
MiR-204 er abnormt nedregulert i
H.. pylori
positive vev og celler
uttrykk for utvalgte mirnas etter tidligere microarray data [10] ble påvist i 75 par av H. pylori positive og negative normalt vev, og 50 par av H. pylori positive og negative tumorvev ved real-time PCR. Vi fant at MIR-204 var en av de mest betydningsfulle mirnas nedregulert på H. pylori-infeksjon (figur S1A, Figur 1A, B). I tillegg ble MIR-204 uttrykkes på lavere nivåer i flere alvorlig gastritis (figur 1C). Vi ytterligere i forhold til uttrykk i tumorvev med normalt vev, uavhengig av H. pylori status og funnet ut at MIR-204 ble uttrykt betydelig lavere i tumorer (figur S1B). Vi delte pasientene med tumor i henhold til ulike TNM stadier og T2-T4 og M1 pasienter uttrykt betydelig lavere Mir-204 enn T1 og M0 pasienter (figur S1C, S1D). Vi har også undersøkt Mir-204 uttrykk i celler infisert med H. pylori, og vi fant at uttrykket av MIR-204 var betydelig lavere i flere H. pylori infiserte celler enn kontroll (figur 1D, Figur S1E).
(A) Et uttrykk nivåer av MIR-204 i humane H. Pylori positive vev og normalt vev i forhold til U6 ble bestemt ved QRT-PCR. (B) Et uttrykk nivåer av MIR-204 i H. pylori positive og negative tumorvev. (C) Uttrykket nivåer av MIR-204 i CG, CAG og dysplasi i H. pylori positive vev og H. pylori negative vev. (D) Uttrykket nivåer av MIR-204 i H. pylori infiserte celler. (* P 0,05).
MiR-204 undertrykker migrasjon /invasjon og spredning av magekreftceller i SGC-7901 og MKN-45 celler
Vi transfektert SGC7901 og MKN45 celler med HSA-Mir-204 etterligne /hemmer oligonukleotider og undersøkte effekten på cellulær proliferasjon og migrasjon /invasjon. For det første, utførte vi QRT-PCR for å bekrefte effektiviteten av transfeksjon, som antydet i fig. 2A, transfeksjon av celler med Mir-204 etterligner /hemmer viste signifikant økning /reduksjon av Mir-204 uttrykk sammenlignet med deres negativ kontroll (NC /Inc). Sårheling analysen viste at over-uttrykk for MIR-204 kan undertrykke celle migrasjon, mens knockdown indusert cellemigrasjon, med betydelig nærmere gap enn kontroll (figur 2B). Konsekvent, Matrigel invasjonen analysen viste også at overuttrykk av MIR-204 svekket celle invasjon, mens knockdown av det kunne reversere hengivenhet (figur 2C). Vi utførte også MTT analyse og fant at veksten av celler transfektert med MIR-204 inhibitor ble betydelig økt sammenlignet med kontroller mens celler med Mir-204 etterligner ble viste forskjellige (figur 3A, B). Vi har også undersøkt om cellesyklusen vil bli påvirket av den knockdown /over-ekspresjon av MIR-204 ved bruk av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse av propidium-jodid-fargede celler. Knockdown av MIR-204 resulterte i en betydelig økning i prosentandelen av celler i G2 fasene mens overekspresjon viste den motsatte effekt (figur 3C). Kolonidannelse analyser viste at hemming av MIR-204 betydelig økt vekst på cellelinjer (figur 3D). Vi sammenlignet også cellefunksjonene trans med Mir-204 etterligner med ligner og H. pylori infeksjon. Vi fant ut at Mir-204 etterligner kunne undertrykke celle migrasjon, invasjon og spredning på H. pylori infeksjon (figur S2). Disse resultatene sammen viste at nedregulering av MIR-204 indusert av H. pylori-infeksjon fremme migrering /invasjon og spredning av magekreft cellelinje in vitro.
(A) MiR-204-nivå i celler transfektert med MIR-204 etterligner, MIR-204 inhibitor, negativ kontroll (NC) og inhibitor negativ kontroll (Inc). Resultatet ble validert ved real-time PCR. (B) Bildene er fotografert på 0 h (øverst) og 24 timer (lavere) etter såret ble vist på forstørrelse av x200. C. Cellene ble behandlet med Mir-204 etterligner, MIR-204-hemmer, NC og økes til 24 timer. De representative bilder av invasive celler på bunnen av membranen farget med krystallfiolett ble visualisert som vist. De kvantifisering av cellemigrering ble presentert som prosent migrerte celle tall. Alle forsøk ble utført in triplo, og presentert som gjennomsnitt ± SD. * Angir signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,05). Hver uavhengig eksperiment ble utført 3 ganger.
(A) Celler transfektert med MIR-204 hemmer og viabilities ble bestemt med CCK-8 analysen. (B) Celler transfektert med Mir-204 etterligner og viabilities ble bestemt med CCK-8 analysen. (C) Effekt av MIR-204 etterligner, eller inhibitor av cellesyklus av magecancerceller ved strømningscytometri. (D) Colony analyse etter celler transfektert med Mir-204 etterligner og hemmer. (* P 0,05).
MiR-204 oppregulert SOX4 uttrykk i magekreft
Vi identifiserte nedstrøms målene for MIR-204 ved beregnings prediksjon å belyse de mekanismer som MIR-204 trykt magekreftcelle invasjon. Blant hundrevis av gener spådd av online miRNA mål prediksjon hjemmeside (Starbase, https://starbase.sysu.edu.cn/), forcused vi vår oppmerksomhet på SOX4. SOX4 hadde blitt rapportert å regulere magekreft progresjon og EMT eller fungere som en underliggende funksjonelle mål av MIR-204. Å identifisere prediksjon, gjennom QRT-PCR og immunhistokjemi, fant vi at SOX4 var oppregulert i H. pylori positive vev. Dets ekspresjon var også høyere i enn CAG CG i H. pylori positive vev. (N = 75, p 0,05, figur 4A-C) som ble inverst korrelert med MIR-204. Ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse av SOX4-MIR-204 mRNA uttrykk, fikk vi en statistisk signifikant invers korrelasjon (figur S3A, R = -0,849, p = 0,002). Ved hjelp av immunhistokjemi, vi oppdaget også at SOX4 uttrykk var signifikant assosiert med mage histologi (p 0,05, tabell 1). In vitro, fant vi også at SOX4 mRNA og proteinnivå ble oppregulert i magekreftceller infisert av H. pylori (figur S3b, S3C). Vi så bestemt ekspresjon av SOX4 i respons til endringene i MIR-204 uttrykk. Western blot og QRT-PCR-analyser viste at over-ekspresjon av MIR-204 kunne gi en betydelig ned-regulere mRNA og protein ekspresjon av SOX4, mens effekten av knockdown av MIR-204 var motsatt (figur 3D). Vi fant også at uttrykket av EMT markører, N-cadherin og E-cadherin, ble også endret relatert til Mir-204 uttrykk (figur 4E), som foreslo at MIR-204 kan påvirke EMT prosessen.
mRNA nivåene av SOX4 relativt til GAPDH i human H. pylori positive vev (A) inkludert CG og CAG og normale vev (B) ble evaluert ved QRT-PCR. Data ble presentert som scattergram av medianen. * Signifikant forskjellig sammenlignet med den til kontroll (P 0,05). (C) SOX4 protein ekspresjon i H. Pylori positive og negative vev ble detektert ved immunohistokjemisk farging. (D) SOX4 protein og mRNA nivåer i celler transfektert med negativ kontroll (NC), Mir-204 etterligner; MIR-204 hemmer og Inc ble analysert gjennom Western-blotting og QRT-PCR. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Gjennomsnittlige verdier av integrert optisk tetthet (IOD) ble vurdert ved å analysere fem felt per lysbilde og registrert i histogrammet. (E) E-cadherin og N-cadherin proteinnivåer i celler transfektert med negativ kontroll (NC), Mir-204 etterligner; MIR-204 hemmer og Inc ble analysert gjennom Western-blotting. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Data er representert som gjennomsnitt ± SD. * Viser P . 0,05
SOX4 er et direkte mål gen av MIR-204 i magekreftceller
Selv SOX4 har vært ansett som et direkte mål for speil 204, er det uklart om MIR-204 kan direkte gjenkjenne 3′-UTR av SOX4 mRNA. Ifølge spådd målområdet fra Targetscan, klonet vi 3′-UTR fragment som inneholder spådd området inn i pGL3 luciferase reporter vektor (pGL3-SOX4). 3′-UTR fragment med mutert sekvens innenfor den anslåtte målområdet ble også klonet som kontroll (pGL3-SOX4-mut). Resultatene viste at ko-transfeksjon med MIR-204 etterligner og den pGL3-SOX4 vektor redusert luciferaseaktivitet i SGC-7901-celler. Imidlertid gjorde MIR-204 etterligner ikke ha effekt på luciferase-aktivitet når cellene ble transfektert med pGL3-SOX4-mut vektor (figur 5). Disse data antydet at SOX4 genet var en av de direkte mål av MIR-204.
Potensialet MIR-204 bindingssetet på 3′-UTR av SOX4 mRNA ble beregnings spådd av Targetscan. Celler ble ko-transfektert med Mir-204 etterligner (eller negativ kontroll) med pGL3-SOX4 (eller pGL3-SOX4-mut) vektor. Luciferase-aktivitet ble normalisert ved forholdet mellom ildflue luciferase og Renilla signaler. * Viser P . 0,05
Over-uttrykk for SOX4 har effekten av MIR-204 på magekreftceller invasjon
For å bestemme SOX4 som funksjonell effektor av MIR-204 i magekreft invasjon, vi over-uttrykt SOX4 ved trans med lentivirus og undersøkt dens virkninger i mage kreftceller. Over-ekspresjon av SOX4 i cellelinjen ble bekreftet ved Western-blotting (figur 6A). Vi fant også at E-cadherin ble nedregulert mens N-cadherin var oppregulert etter PLV-SOX4 transfeksjon. Gjennom sårtilheling og Matrigel invasjonen assay, så oppdaget vi at over uttrykk for SOX4 betydelig forfremmet celler migrasjon og invasjon (figur 6B og 6C). For ytterligere å demonstrere at MIR-204 indusert tap av SOX4 trykkes spredning og invasjon av gastrisk kreft celler, ble celler transfektert med MIR-204 etterligner og SOX4 over-ekspresjonsvektor sammen, og resultatene viste at undertrykkelsen av migrasjon, invasjon og spredning av MIR-204 ble svekket (figur S4).
(A) SOX4, N-cadherin og E-cadherin protein uttrykk ble analysert ved Western blotting i celler ved transfeksjon med lentivirus, kontroll plasmid, og Mock. GADPH ble vist som internkontroll. (B) sårtilheling analysen av disse bildene på 0 h (øverst) og 24 timer (lavere) etter såret ble vist på forstørrelse av x200. (C) SOX4 over-uttrykt og NC grupper var henholdsvis farget. De representative bilder av invasive celler på bunnen av membranen farget med krystallfiolett ble visualisert som vist. De kvantifisering av cellemigrering ble presentert som prosent migrerte celle tall. Alle forsøk ble utført in triplo, og presentert som gjennomsnitt ± SD. * Angir signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,05). Hver uavhengig eksperiment ble utført 3 ganger.
Diskusjoner
Magekreft er en verdensomspennende sykdom med høy forekomst, særlig i Sørøst-Asia [21]. Den 5-års overlevelse for magekreft er ganske lav. Noen av de magekreftpasienter var H. pylori beslektet. Derfor er det nødvendig omhyggelig undersøke patogenesen og utvikle nye og mer målrettede behandlinger for H. pylori relatert magekreft.
mirnas er en stor familie av genet regulatorer som negativt regulerer deres mål-mRNA i en sekvens-spesifikk måte. mirnas kan også fungere som tumor suppressors eller onkogener [22]. Nyere bevis antydet at mirnas spille viktige roller i flere biologiske prosesser knyttet til kreft, inkludert celledifferensiering, spredning, tumorignesis, angiogenese, invasjon og metastasering [23]. MiR-204 har blitt rapportert å virke som en tumor suppressor og lavt-nivå ekspresjon av MIR-204 er assosiert med en dårlig prognose fenotype hos pasienter med kreft [24], [25]. Imidlertid var det få studier som undersøker MIR-204-funksjonen i H. pylori relaterte magekreft. Her var vi de første til å presentere bevis for at MIR-204 var signifikant nedregulert i H. pylori positive vev (normale og tumorvev) og at overuttrykk av MIR-204 trykt SOX4 protein uttrykk og vekst av celler avledet fra mage tumor.
Vi først kvantifisert uttrykk for MIR-204 i H. pylori-infeksjon vev og kontroller, og vi fant ut at Mir-204 uttrykk er betydelig lavere i H. pylori infiserte pasienter. Vi fant også at uttrykket er relatert til histologi av pasientene, det er, er det uttrykk for MIR-204 signifikant lavere hos H. pylori positive pasienter med kronisk atrofisk gastritt enn kronisk ikke-atrofisk gastritt. Dette uttrykket mønster viste at muligheten for at MIR-204 er knyttet til forskjellige typer gastritt og mer alvorlige pasientene var, jo lavere ekspresjon av MIR-204 var. Basert på Mir-204 uttrykk nivå, valgte vi SGC-7901 og MKN45 celler for den etterfølgende henholdsvis gevinst-of-funksjon og tap-av-funksjon studier. Resultatene tyder på at nedregulering av MIR-204 i magekreft celle er knyttet til dens progresjon. Selv om et stort antall av humane mirnas er blitt rapportert, mange av deres mRNA-mål står uidentifisert [9]. I denne studien brukte vi en kombinert bioinformatikk og eksperimentell tilnærming til å identifisere at SOX4 er den funksjonelle nedstrøms målet på MIR-204.
SOX4 er over-uttrykt i ulike kreft og var nært korrelert med tumorinvasjon og metastase [ ,,,0],16] – [19]. Det er også en av medlemmene i EMT-transkripsjonen indusere [26]. EMT er en nøkkel utviklingsprogram som ofte blir aktivert i løpet av progresjon av kreft, og kan fremme resistens overfor terapi [27]. Zhang et al [20] viste at overekspresjon av SOX4 i menneskelige mammary epitelceller førte til oppkjøp av mesenchymale egenskaper, og forbedret celle migrasjon og invasjon. Videre SOX4 positivt regulert ekspresjon av kjente EMT induktorer og aktivert TGF-β veien for å bidra til EMT [28]. Til dags dato er EMT et attraktivt mål for terapeutiske intervensjoner, gir et nytt grunnlag for utviklingen av carcinoma mot dedifferensierte og flere ondartede tilstander [29]. Vår studie først viste at H. pylori infeksjon forårsaket MIR-204 nedregulering kan føre til magekreft ved EMT prosess.
For å konkludere, våre bevis indikerte at MIR-204 ble nedregulert, mens SOX4 var opp- regulert i H. pylori infeksjon og magekreft. Ektopisk MIR-204 uttrykk redusert SOX4 uttrykk på mRNA og proteinnivået i magekreft cellelinje. Vi demonstrerte også at MIR-204 var direkte bundet til det 3′-UTR av SOX4. MiR-204 uttrykk hemmet EMT via undertrykkelse av SOX4. Videre kan MIR-204-EMT sti som vi identifiserte utnyttes i en terapeutisk tilnærming for behandling av H. Pylori relaterte kreftformer.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. product: (A) Ekspresjon av 5 mirnas i H pylori-positive og negative vev ble detektert ved QRT-PCR. (B) uttrykk nivåer av MIR-204 i tumor og kontroll vev. (C) Uttrykket nivåer av MIR-204 i henhold til TNM etapper. (D) Uttrykket nivået av MIR-204 i tre slags H. pylori infiserte celler. (* P 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Celler transfektert med Mir-204 etterligner og etterligner med H. pylori infeksjon og (A) viabilities ble bestemt med CCK-8-analyse (B) Bildene er fotografert på 0 h (øverst) og 24 timer (lavere) post-såret ble vist ved en forstørrelse på X200 (C) de representative bilder av invaderende celler på bunnen av membranen farget med krystallfiolett ble visualisert som vist. (* P 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s002 plakater (TIF)
Figur S3. product: (A) Den relative mRNA-ekspresjon av MIR-204 og SOX4, normalisert med U6 og GAPDH, ble vurdert i 15 prøver av H. pylori positive og negative vev ved QRT-PCR. (B) En invers korrelasjon av SOX4 og MIR-204-ekspresjonsnivåer ble kontrollert (R = -0,920, p = 0,001). (C) Ekspresjon av SOX4 mRNA ble bestemt ved QRT-PCR i H. pylori infiserte celler. (D) Ekspresjon av SOX4 proteinnivået ble bestemt ved western blot i H. pylori infiserte celler. (* P 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Celler transfektert med MIR-204 etterligner og etterligner med PLV-SOX4 og (A) viabilities ble bestemt med CCK-8-analyse (B) De representative bilder av invaderende celler på bunnen av membranen farget med krystallfiolett som ble visualisert vist. (C) Bildene er fotografert på 0 h (øverst) og 24 timer (lavere) etter såret ble vist på forstørrelse av x200 (* p 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s004
(TIF)
