Abstract
epigenetisk stanse er en av de mekanismer som fører til inaktivering av et tumorsuppressorgen, enten ved DNA-metylering eller histon modifikasjon i en promoter regulerende område. Mitogen induserbar gen 6 (
MIG-6
), hovedsakelig kjent som en negativ feedback-inhibitor av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) familie, er et svulsthemmer-gen som er forbundet med mange humane kreftformer. For å avgjøre om
MIG-6
inaktiveres ved epigenetisk endring, identifiserte vi en gruppe av menneskelig lungekreft og melanom cellelinjer der uttrykket er enten lav eller umulig å oppdage og studert effekten av metylering og av histon deacetylering på sitt uttrykk. DNA metyltransferase (DNMT) hemmer 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-DC) indusert
MIG-6
uttrykk i melanomcellelinjer, men lite i lungekreft linjer. I motsetning hemmer den histondeacetylase (HDAC) trichostatin A (TSA) indusert
MIG-6
uttrykk i lungekreft linjer, men hadde liten effekt i melanom linjer. Men
MIG-6
arrangøren selv synes ikke å være direkte berørt av enten metylering eller histon deacetylering, som indikerer en indirekte reguleringsmekanisme. Luciferaserapportørplasmid analyser viste at et kort segment av exon 1 i
MIG-6
genet er ansvarlig for TSA svar på lungekreft celler; således kan
MIG-6
genet epigenetiske til taushet ved en indirekte mekanisme uten å ha en fysisk endring i dets promoter. Videre våre data tyder også på at
MIG-6
genuttrykk er ulikt regulert i lungekreft og melanom
Citation. Zhang YW, Staal B, Dykema KJ, Furge KA, Vande Woude GF (2012) Kreft-Type forskrift av
MIG-6
Expression av hemmere av Metylering og Histone Deacetylering. PLoS ONE 7 (6): e38955. doi: 10,1371 /journal.pone.0038955
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 27 februar 2012; Godkjent: 15 mai 2012; Publisert: 12 juni 2012
Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Van Andel Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og manuskript
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mitogen induserbar genet 6. (
MIG-6
) (også kjent som gen 33,
ERRFI1
, eller
RALT
) er en umiddelbar tidlig respons gen som uttrykkes i ulike vev og spiller en avgjørende rolle i mange patofysiologiske tilstander [1]. Dets ekspresjon kan bli indusert ved et bredt spektrum av vekstfaktorer, hormoner, eller stress-stimuli, og det er forbundet med forskjellige kroniske tilstander [1], [2]. Studier på mus har vist at
Mig-6
er nødvendig for hud morphogenesis og lunge utvikling, og at det spiller en viktig rolle i å opprettholde felles homeostase [3], [4], [5].
som et cytoplasmatisk stillas adapter, har MIG-6 flere viktige protein-protein interaksjon motiver som kan formidler vekselvirkning med signalmolekyler nedstrøms av reseptor-tyrosinkinaser (RTK’er) [2]. En av de mest fremtredende roller MIG-6 for å regulere signaltransduksjon kommer fra dens evne til direkte å samvirke med epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og andre ErbB-familien, begrenser deres fosforylering og nedstrøms signalisering i en negativ tilbake måte [6], [7], [8], [9]. MIG-6 kan induseres av hepatocytt-vekstfaktor (HGF) og fungerer som en negativ feedback-regulator av HGF-MET signalering [10], [11], noe som indikerer at den har bred rolle som et signal sjekkpunkt for modulering av aktiverte RTK baner i en tidsrammen.
beviset på at
MIG-6
er en tumor suppressor genet er overbevisende. Det er lokalisert i kromosom 1p36, en locus som ofte har tap av heterozygositet i flere humane kreftformer, inkludert lungekreft [12], [13], [14], melanom [15], og brystkreft [16]. Faktisk, nedregulering eller tap av
MIG-6
ekspresjon har blitt rapportert i kreft og er ofte assosiert med dårlig prognose [3], [11], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].
MIG-6
ned-regulering i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er forbundet med økt EGFR-signalisering og dårlig differensiert kreft [21], mens tap av dets ekspresjon i ErbB2-amplifisert brystkarsinom gjengir cancer cellene mer motstandsdyktige mot Herceptin, nøytraliserende antistoff mot ErbB2 [16]. I glioblastom,
MIG-6
er identifisert som et enkelt gen innenfor oftest slettet regionen på 1p36.23 locus, og dens uttrykk er nedregulert i 34% av glioblastom prøvene [19]. Mens
MIG-6
nedreguleringen er rapportert i en høy prosentandel av papillær thyroid kreft [22], høy
MIG-6
uttrykk korrelerer med lengre overlevelse, og er forbundet med gunstige kirurgiske utfall for de pasienter [24]. Redusert MIG-6 ekspresjon er også blitt rapportert i hudkreft, endometrial cancer, og hepatocellulært karsinom [3], [20], [23]. Dessuten, selv om slike hendelser er sjeldne, tre mutasjoner i
MIG-6
genet har blitt identifisert i human lungekreft og en i neuroblastom [11], [18]. Ytterligere bevis som støtter
MIG-6
som en tumor suppressor genet oppsto fra mus studier;
Mig-6
-deficient mus er tilbøyelige til å utvikle epiteliale hyperplasi eller tumorer i organer, inkludert lunge, hud, livmoren, galleblæren, og gallegang [3], [11], [20].
epigenetisk endring, en av de mest kjente mekanismer som fører til inaktivering av et svulsthemmer-gen [25], kan resultere fra DNA-metylering eller histon deacetylering i genets promotor [25]. Gitt at nedregulering av
MIG-6
er hyppig observert i mange menneske kreft, spurte vi om
MIG-6
uttrykk ble påvirket av DNA metylering og histon deacetylering. Her viser vi at
MIG-6
arrangøren selv er verken hypermethylated eller påvirket av histon deacetylering. Imidlertid er dets ekspresjon indusert av DNA-metyltransferase (DNMT) inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) i melanomcellelinjer, og ved den histon-deacetylase (HDAC) inhibitor trichostatin A (TSA) i lungekreft linjer. Ved å dissekere sin promoter regulatorisk område ved hjelp av en luciferase reporter analysen identifiserte vi en minimal TSA-respons element i ekson 1 av
MIG-6
som er avgjørende for dens induksjon av TSA i lungekreftceller.
Resultater
MIG-6 uttrykk er forskjellig regulert av fem-aza-st i melanomcellelinjer og TSA i lungekreftcellelinjer
For å finne ut om
MIG-6
uttrykk ble påvirket av epigenetisk endring, må vi først identifisert humane kreftcellelinjer som sin promoter er trolig påvirket av metylering eller histon deacetylering. Som vist i figur 1, har vi funnet fire humane NSCLC-cellelinjer (A427, H226, H522 og H596), og fem melanomcellelinjer (M14, Malme-3M, SK-2, SK-MEL-28, og UACC-257) hvor MIG-6 protein var enten lav eller umulig å oppdage. Vi behandlet da disse cellelinjer med eller uten 5-aza-dC, TSA, eller en kombinasjon av begge inhibitorer.
Hele cellelysatene ble fremstilt fra de angitte cellelinjer, og MIG-6 ble bestemt ved western blot analyse ved anvendelse av anti-Mig-6 polyklonalt antistoff. Som en lastekontroll, ble det samme blot undersøkt med anti-β-actin antistoff.
Til vår overraskelse fant vi at TSA behandling betydelig økt mengden av MIG-6 protein i lungekreft celle linjer, men ikke i melanomlinjer (figur 2A). I motsetning til dette, 5-aza-dC behandling betydelig økt MIG-6-protein i melanomcellelinjer, men ikke i NSCLC lungekreft linjer (figur 2B). For å avgjøre om økningen av MIG-6 protein ble regulert på transkripsjonsnivået, utførte vi RT-PCR-analyse. Som vist i figur 3, og i samsvar med proteinekspresjon,
MIG-6
mRNA-ekspresjon økes med TSA behandling bare i de fire lungecancercellelinjer, og det øker med 5-aza-dC behandling bare i fem melanom linjer. Disse data antyder sterkt at induksjonen av
MIG-6
ekspresjon av 5-aza-dC eller TSA blir regulert på transkripsjonsnivået og differensielt regulert i lungekreft og melanomceller.
helcellelysater ble ekstrahert fra celler behandlet med eller uten 5-aza-dC (10 uM) og /eller TSA (1 uM), og western blot analyser ble utført for å påvise MIG-6 protein. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (A) MIG-6 protein ble indusert av TSA, men ikke med 5-aza-st i lungekreft linjer. (B) 5-Aza-dC, men ikke TSA, indusert MIG-6 i melanomcellelinjer.
Total RNA ble isolert fra celler behandlet med eller uten 5-aza-dC (10 pM ) og /eller TSA (1 uM), og
MIG-6
ekspresjon ble bestemt ved hjelp av RT-PCR-analyser.
GAPDH
ekspresjon ble anvendt som en intern kontroll. (A) TSA økt
MIG-6
mRNA i fire lunge kreft cellelinjer. (B)
MIG-6
mRNA i fem melanomcellelinjer ble økt med 5-aza-dC.
MIG-6 arrangøren verken hypermethylated eller direkte berørt av histon deacetylering
Gitt at
MIG-6
uttrykk ble indusert av 5-aza-st om melanom linjer, spurte vi om sin promoter ble hypermethylated i disse cellene. Vi hentet genomisk DNA fra både lungekreft og melanom cellelinjer og undersøkt DNA metylering i 596-bp
MIG-6
promoter regulatoriske regionen, som inneholder rikelig CpG områder (figur 4). Til vår overraskelse, lungekreft cellelinjer (figur 4A) og melanom cellelinjer (figur 4B) var lik i å ha svært få denaturert CpG områder i
MIG-6
promoter regulatoriske regionen, noe som indikerer at induksjon av
MIG-6
av 5-aza-st i melanom var uavhengig av DNA metylering i sin promoter. Disse resultatene ble bekreftet ved direkte sekvensering av PCR-produktene amplifisert fra bisulfitt-behandlet DNA (data ikke vist).
MIG-6
promoteren ble amplifisert fra bisulfitt-konverterte DNA og klonet inn i en TOPO TA-kloningsvektor. Statusen til
MIG-6
promoteren metylering i (A) lungecancercellelinjer og (B) melanom-cellelinjer ble evaluert ved sekvensering av 10 tilfeldig plukket kolonier fra hver linje til denaturert cytosinrestene. Hver rød søyle representerer et CpG nettsted. De åpne ovaler indikere unmethylated CpG områder og de solide ovaler indikere denaturert nettsteder. EBC-en cellelinje ble brukt som en negativ kontroll for å vise basal metylering status for MIG-6 promoter.
På samme måte, vi spurte om
MIG-6
promoter ble påvirket av histon deacetylering. Ved kromatin immunoprecipitation assay (chip), fant vi at TSA behandling ikke øke bindingen av acetyl-histon H3 til
MIG-6
promoter i lungekreft linjer eller i melanom linjer (figur 5), indikerer at
MIG-6
arrangøren ble ikke direkte berørt av histon deacetylering heller.
cellene ble behandlet med eller uten TSA (1 mm) i 24 timer, og en chip-analysen ble utført ved hjelp av anti-acetyl histon H3-antistoff. Som en negativ kontroll ble normalt kaninserum anvendt for immunopresipitering. DNA-fragmentene tverrbundet og co-immunopresipitert med acetylert histon H3 var renset og brukt for PCR forsterkning av arrangører av
MIG-6 Hotell og
GAPDH
. EBC-1-cellelinjen ble brukt som en negativ kontroll for å vise det basale histon deacetyleringen status av MIG-6-promoteren.
MIG-6 transkripsjon indirekte reguleres av en faktor (er) som er påvirket av metylering eller histon deacetylering
Siden de ovenstående data tyder på at
MIG-6
induksjon ikke er direkte regulert, så vi for en sekundær mekanisme, med hemmere induserer uttrykk for en transkripsjonsfaktor (er) eller co-faktor (er) som i sin tur regulerer
MIG-6
uttrykk. Derfor undersøkte vi svarene på
MIG-6
promoter regulatoriske region til hemmere via luciferase reporter analysen. En
MIG-6
promoter reporter plasmid ble konstruert ved å sette inn en 1,383-kb genomisk DNA fragment (bestående av
MIG-6
promoter, dens oppstrøms regulatoriske region, og nedstrøms ekson 1 og del av intron 1) foran et luciferase reporter-gen. Testing av reporter i både lungekreft og melanom cellelinjer, fant vi at TSA betydelig forbedret
MIG-6
promoter aktivitet i lungekreftceller, men viste ingen slik effekt i melanom celler (figur 6). Denne informasjonen var i tråd med vår tidligere western blot og RT-PCR-analyser. 5-aza-dC, men så ut til å ha noen effekt på rapportøraktivitet i enten melanom eller lungekreft linjer (figur 6). Disse data indikerer at mens den TSA-responsive element er innenfor det 1,383 kb-regionen i
MIG-6
, er sannsynligvis utenfor denne regionen 5-aza-dC-reagerende element.
Lung kreft og melanom-cellelinjer ble transient transfektert med luciferase-rapportør plasmider, enten pGL3-Basic eller pGL3-P (-1076 /+ 307), etterfulgt av behandling med eller uten 5-aza-dC eller TSA. Den pU6B-
Renilla
reporter ble co-transfektert for normalisering. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Feilstolpene representerer standardavvik. Studenten t-test
p
verdi indikerer en statistisk signifikant forskjell mellom de mock-behandlede og TSA-behandlede prøver.
En liten del av ekson 1 i MIG-6 er avgjørende for TSA respons i lungekreft
Vi utførte en rekke sletting analyser på 1,383 kb
MIG-6
promoter regulatoriske regionen for å bestemme minimal regionen nødvendig for induksjon av TSA i lungekreft celler. Sletting fra 5′-enden til det proksimale området av det
MIG-6
promoter resulterte i en reduksjon av den basale promoteraktivitet, mens responsen på TSA ble i det vesentlige opprettholdt (figur 7A). Sletting fra 3′-enden til den transkripsjonelle initieringssete av
MIG-6
resulterte i fullstendig tap av respons på TSA (figur 7B), som indikerer at den TSA responselementet ble nedstrøms for
MIG- 6
promoter. Ytterligere delesjons analyser viste et lite segment i ekson 1 med utgangspunkt i den transkripsjonelle initieringssete som var avgjørende for TSA respons (figur 7C). Som oppsummert i figur 7D, er den minimale TSA responselementet i løpet av de første 50 nukleotider av ekson 1, med den distale 20-nukleotid-segmentet med den høyeste aktiviteten.
(A-C) Forskjellige lengder av
MIG-6
promoter reguleringsområdet ble satt inn i pGL3 vektor. Luciferase reporter analysen ble utført i A427 lungekreftceller transient transfektert med pGL3-Basic eller den angitte reporter bærer
MIG-6
promoter element. Cellene ble deretter behandlet med eller uten 5-aza-dC eller TSA. Den pU6B-
Renilla
reporter ble co-transfektert for normalisering. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Feilstolpene representerer standardavvik. (D) Skjematisk fremstilling av TSA-respons element i
MIG-6
promoter regulatoriske regionen. Pilen indikerer transkripsjonsstart nettstedet; den røde boksen indikerer exon 1. Skyggen i grønt er den 50-bp element i ekson 1 som er mest sannsynlig ansvarlig for TSA respons i lungekreftceller, som vi betegnet som minimal TSA-respons element.
spekulert i at det eksisterer en kritisk transkripsjonsfaktor bindende motiv i den minimale TSA responselementet. Vi utførte mutasjon analyser av 50-nukleotid-segmentet for å lokalisere potensielle transkripsjonsfaktorbindingsmotiv (er) (figur 8A). Sammenlignet med villtype-P (-76 /+ 50) reporter, mutasjon i m4 og m5 elementer resulterte i en betydelig reduksjon av rapportøraktivitet, som reaksjon på TSA, mens mutasjon i andre elementer hadde mindre effekt (figur 8B). Dette resultatet stemmer overens med slettingen analyser, som M4 og M5 elementer befinner seg i den distale 20-nukleotid-segment som, når den er slettet, resulterte i et bratt fall-off i TSA respons. Vi genererte en annen mutant reporter m11 hvor halvparten av sekvensene i både M4 og M5 ble mutert (figur 8A). Vi fant at den m11 mutant hadde en mye større reduksjon i TSA respons (figur 8C), noe som indikerer at disse sekvensene er avgjørende for binding av en ennå ikke identifisert transkripsjonsfaktor som regulerer MIG-6 genekspresjonen indusert av TSA i lungekreft .
(A) sekvenser av P (-76 /+ 50) som inneholder
MIG-6
promoteren og minimal TSA-respons element vises. For hver mutant reporter konstruksjon (m3-M11), ble understreket sekvensen mutert til GAATTC. (B og C) en luciferase reporter-analysen ble utført i A427 lungekreftceller ved forbigående transfeksjon av den angitte reporter plasmid med eller uten TSA behandling. Feilstolpene representerer standardavvik og alle analysene ble utført i tre eksemplarer.
Andre gener forskjellig regulert av fem-aza-DC og TSA i lungekreft og melanom celler
neste spurt om det var andre gener forskjellig reguleres av 5-aza-dC og TSA i lungekreft og melanom celler. Vi utførte DNA microarray-analyser på prøver som stammer fra A427 lungekreft og M14 melanom celler behandlet med 5-aza-DC og /eller TSA. Figur 9A viser gener som viser et uttrykk mønster som ligner på den fra
MIG-6
(som er angitt som
ERRFI1
i varmen-kartet) som respons på enten 5-aza-dC eller TSA behandling (figur 9A). En annen gruppe av gener syntes å være nedregulert, det motsatte av
MIG-6
uttrykk (figur 9B).
Mikromatrise-analyser ble utført på RNA prøver fra A427 lungekreftceller og M14 melanom celler behandles med eller uten 5-aza-dC (10 uM) og /eller TSA (1 uM). Varme Kartene viser (A) genene hvis uttrykk mønster var lik som
MIG-6
, og (B) genene hvis uttrykk ble nedregulert av behandling, i motsetning til
MIG -6
uttrykk.
MIG-6
genet er merket med en stjerne, og vises som alternativ symbol,
ERRFI1
.
Blant de oppregulert genene var de koding for transkripsjonsfaktorer som EGR1 og STAT1, MIG-6-induserbar genet
HBEGF
, og gener som koder for histonproteinene (9A). Selv om disse genene ble uttrykt forskjellig i A427 og M14 celler (figur 9A), videre analyser viste at
EGR1 plakater (men ikke flere andre gener vi undersøkte) vises et uttrykk mønster lik som
MIG- 6
på tvers av de fire lungecancercellelinjer og fem melanomlinjer (figur 10). Dermed
MIG-6
var ikke den eneste genet forskjellig regulert i lungekreft og melanom celler. Kanskje det er vev spesifikke faktorer (enten transkripsjonsfaktorer eller transkripsjonsfaktor co-aktivatorer /co-repressors) som reagerer forskjellig på 5-aza-DC og TSA, som fører til forskjells induksjon av
MIG-6 Hotell og
EGR1
i lungekreft og melanom celler.
uttrykk for
EGR1
ble bestemt ved RT-PCR. (A) TSA indusert
EGR1
uttrykk i NCI-H226, NCI-H522, NCI-H596, og A427 lunge kreft cellelinjer. (B) 5-Aza-dC indusert
EGR1
uttrykk i M14, Malme-3M, SK-2, SK-MEL-28, og UACC-257 melanom cellelinjer.
GAPDH
uttrykk ble brukt som en intern kontroll (se figur 3).
Diskusjoner
MIG-6
, en tumor suppressor gen har blitt funnet nedregulert i mange humane krefttyper. For å finne ut om nedregulering av
MIG-6
uttrykk ble påvirket av epigenetisk modifikasjon i sin promoter, vi behandlet lungekreft og melanom cellelinjer med hemmere av metylering og histon deacetylering og deretter bestemmes hvordan disse hemmere påvirket
MIG-6
uttrykk. Intriguingly, har vi funnet at DNMT inhibitor 5-aza-dC spesifikt indusert
MIG-6
ekspresjon i melanomceller, men ikke i lungecancerceller, mens den HDAC-inhibitoren TSA indusert i motsatt mønster (figur 2 og 3). Til tross for både inductions blir regulert på transkripsjonsnivået, var vi overrasket over å finne at
MIG-6
arrangøren var verken hypermethylated eller direkte berørt av histon deacetylering (figur 4 og 5), noe som indikerer at en indirekte mekanisme kan være ansvarlig for differensial induksjon. Faktisk har 5-aza-dC også blitt rapportert å indusere ekspresjon av flere andre gener hvis promotorer er ikke direkte berørt av metylering i leukemiceller [26], som tyder på at 5-aza-dC kan ha en bredere betydning for regulering av gen uttrykk via en metylering uavhengig.
Mange DNMT hemmere og HDAC hemmere er for tiden i kliniske studier for sine anti-kreft egenskaper [27], [28], [29]. Selv om de fleste av disse epigenetiske stoffene er fortsatt i tidlig utvikling og utsiktene for at de kan brukes klinisk for kreftbehandling gjenstår å bli vurdert, vil det evaluering avhenger av vår forståelse av hvordan de fungerer og hvilke resultater som kan forventes. 5-Aza-dC og TSA blir sett på som potente og spesifikke inhibitorer for metylering og histon deacetylering, henholdsvis [27], [28], [30], og de har blitt mye brukt for å undersøke epigenetisk endring av mange tumorsuppressorgener. Disse hemmere vanligvis føre til globale endringer i genuttrykk ved ombygging kromatin via direkte konvertering metylert DNA til unmethylated DNA eller unacetylated histoner til acetylert staten, og dermed gir enkel tilgang til transkripsjon maskiner til genet arrangører. Men noen hemmere gjøre mer, og deres anti-kreft egenskaper kan være mye mer komplisert. For eksempel er mange ikke-histon cellulære proteiner som transkripsjonsfaktorer er også substrater av HDAC, og deres transkripsjonelle aktivitet kunne bli påvirket av HDAC-inhibitoren TSA så vel [29].
fleste tumorsuppressorgener er epigenetiske stilnet enten ved DNA metylering og /eller histon deacetylering i sine arrangører [25]. Så vidt vi vet, er det ingen rapport som viser at ekspresjonen av slike gener kan differensielt regulert av inhibitorer av histon metylering eller deacetylering i en cancer-spesifikk måte uten at epigenetiske modifikasjoner i promoteren. Reguleringen av
MIG-6
av disse hemmere, som vi viser her, avslører en ny mekanisme som en tumor suppressor gen kan epigenetiske brakt til taushet i en indirekte og vev-spesifikk måte. Våre luciferase-rapportøranalyseresultatene indikerte at reguleringen av
MIG-6
ekspresjon i melanoma og i lungekreft ble mest sannsynlig mediert av forskjellige faktorer. Vi har identifisert en minimal TSA responselement i exon 1 i
MIG-6
proksimalt til dens promoter (figur 7 og 8), mens plasseringen av 5-aza-dC responselement er fortsatt usikkert (figur 6) .
Vi spekulerer i at TSA respons element i
MIG-6
genet er mest sannsynlig regulert av en faktor som uttrykk påvirkes av histon deacetylering i sin promoter eller som protein aktivitet er direkte regulert ved acetylering /deacetylering (Figur 11A). Denne faktoren vil bli aktivert i lungekreftceller ved TSA behandling, men ikke i melanomceller. Innenfor den minimale TSA-responselement som vi identifisert i
MIG-6
gen ekson 1 (figur 7), er det antatte DNA-bindende sekvenser for transkripsjonsfaktor aktivator protein-2 (TFAP2), som har fem familie medlemmer og binder seg til konsensus-sekvensen 5′-GCCNNNGGC-3 «[31], [32]. Når den antatte TFAP2 bindingsseter ble mutert, observerte vi en betydelig nedgang i TSA-respons (figur 8), noe som indikerer at disse sekvensene er avgjørende for TSA-medierte regulering. Det vil være interessant å se om TFAP2 eller annen faktor (er) binder seg til disse sekvensene og regulerer MIG-6 genuttrykk. Som for 5-aza-DC, er dens respons element sannsynlig utenfor testet 1,383 kb
MIG-6
promoter reguleringsområdet (figur 6); det vil si, det er enten direkte påvirket ved metylering i sin DNA-sekvenser eller indirekte er mediert av en annen transkripsjonregulator hvis promotor er modifisert ved metylering i melanomceller (figur 11B). Omfattende studier vil være nødvendig for å finne ut hva disse faktorene er og hvordan de kontrollerer
MIG-6
uttrykk.
(A) I lungekreftceller, kan TSA indirekte regulere
MIG-6
gjennom to mekanismer. Den første kan være at TSA hemmer histon deacetylering i formidler av genet
X
, noe som resulterer økt produksjon av X protein som øker
MIG-6
genuttrykk ved å knytte med TSA-respons element i exon 1. Det andre kan være at direkte acetylering av protein X påvirket av TSA resulterer i økt transkripsjon av
MIG-6
. (B) I melanomceller, regulering av
MIG-6
uttrykk med 5-aza-DC kan være direkte eller indirekte. 5-Aza-dC kan hemme DNA-metylering i promotoren av genet
Y
, noe som fører til oppregulering av sitt produkt, og dermed indirekte forsterke
MIG-6
uttrykk; eller det kan direkte hemme DNA metylering utenfor testet 1,383 kb
MIG-6
promoter regulatoriske regionen, noe som gir enkel tilgang til en transkripsjonen co-aktivator for å forbedre
MIG-6
uttrykk. «P» angir promotoren av hvert gen; «E1» indikerer exon 1 av
MIG-6
genet.
Kreft-type regulering av genekspresjon av hemmere av metylering og histon deacetylering er ikke unikt for
MIG -6
. Andre gener som
EGR1 product: [33] er også forskjellig regulert i lungekreft og melanom celler ved disse hemmere (se figur 9 og 10). Det gjenstår å fastslå hvorvidt-som
MIG-6
promoter-
EGR1
arrangøren verken hypermethylated eller påvirket av histon deacetylering i disse cellene. Hvis disse egenskapene er de samme i de to arrangører, vil det være interessant å se om de er regulert av samme faktor (er) eller via ulike mekanismer.
Vi rapporterer her at
MIG-6
uttrykk er forskjellig regulert av hemmere av metylering og histon deacetylering i lungekreft og melanom celler uten fysiske epigenetiske forandringer i sin promoter.
MIG-6 plakater (og muligens
EGR1
) kan tjene som verdifulle biomarkører for bestemmelse av sensitiviteten /egnetheten av en krefttype for behandling med DNMT og /eller HDAC-inhibitorer i klinikken.
Materialer og metoder
humane cellelinjer
Den menneskelige lungekreft cellelinjer A427, NCI-H292, NCI-H2122, NCI-H596, og SK-MES-1 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). EBC-en var fra Health Science Research Resources Bank (Tokyo, Japan). NCI-H226 og NCI-H522 ble oppnådd fra NCI-60-cellelinjer (NCI-Frederick). De ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. Den menneskelige melanoma cellelinjer A375, C8161R, Malme-3M, M14, SK-2, SK-MEL-28, SK-MEL-103, SK-MEL-147, UACC-62, og UACC-257 ble vennlig levert av Dr . Matthew VanBrocklin (Nevada Cancer Institute, Las Vegas, Nevada) [34] og vedlikeholdes i RPMI supplert med 5% FBS og 1% penicillin /streptomycin.
Plasmider
En serie av DNA-fragmenter avledet fra
MIG-6
promoter reguleringsområdet ble satt inn i
Bgl
II og
Kpn
setene i promotor mindre luciferase reporter pGL3-Basic (Promega, Madison , WI) for å skape plasmidene pGL3-P(−1076/+307),–P(−533/+307),–P(−106/+307),–P(−76/+307),–P(−76/+255),–P(−76/+245),–P(−76/+177),–P(−76/+139),–P(−76/+50),–P(−76/+31),–P(−76/+20),–P(−76/+10), og-P (-76 /-1). Alle innsatte fragmenter ble amplifisert ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av
PFU
turbo-DNA-polymerase (Stratagene, La Jolla, CA), og de resulterende plasmider ble sekvensert for å bekrefte nøyaktigheten av innleggene.
Alle pGL3-P (-76 /+ 50) mutante journalister ble opprettet ved hjelp av en QuikChange seterettet mutagenese Kit (Stratagene) ved mutere hver av seks opprinnelige nukleotider i en
EcoRI
restriksjonsenzymsete (GAATTC ), som ble bekreftet ved sekvensering. Primerne som brukes for å lage hver mutant reporter er som følger: for pGL3-P (-76 /+ 50) m3, 5′-TAGCGGGAGCGCGAGAATTCAAGAGGCGCCTGCG-3 «(sense) og 5′-CGCAGGCGCCTCTTGAATTCTCGCGCTCCCGCTA-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m4, 5»-GAGCGCGAGCCAGCAGAATTCGCCTGCGCAGATCT-3 «(sense) og 5′-AGATCTGCGCAGGCGAATTCTGCTGGCTCGCGCTC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m5, 5»-AGCCAGCAAGAGGCGAATTCGCAGATCTGCGATCT-3 «(sense) og 5′-AGATCGCAGATCTGCGAATTCGCCTCTTGCTGGCT-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m6, 5»-GCGGCGACGGCGGTCGAATTCGAGGCAGAGTGCTA-3 «(sense) og 5′-TAGCACTCTGCCTCGAATTCGACCGCCGTCGCCGC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m7, 5»-CGGCGGTCCGGTGCGAATTCGAGTGCTAGCGGGAG-3 «(sense) og 5′-CTCCCGCTAGCACTCGAATTCGCACCGGACCGCCG-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m8, 5»-CCGGTGCGAGGCAGAATTCTAGCGGGAGCGCGA-3 «(sense) og 5′-TCGCGCTCCCGCTAGAATTCTGCCTCGCACCGG-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) M9, 5»-GAGGCAGAGTGCTAGAATTCGCGCGAGCCAGCAAG-3 «(sense) og 5′-CTTGCTGGCTCGCGCGAATTCTAGCACTCTGCCTC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) M10, 5»-GAGTGCTAGCGGGAGAATTCGCCAGCAAGAGGCGC-3 «(sense) og 5′-GCGCCTCTTGCTGGCGAATTCTCCCGCTAGCACTC-3′ (antisense); og for-P (-76 /+ 50) M11, 5»-GCGAGCCAGCAAGAGAATTCTGCGCAGATCTGCG-3 «(sense) og 5′-CGCAGATCTGCGCAGAATTCTCTTGCTGGCTCGC-3» (antisens). Understrekingen indikerer
EcoRI
sete for hver mutant.
Western Blot analyse
For å forberede proteinlysatene ble cellene behandlet med eller uten 5-aza-DC (10 iM) i 3 dager eller TSA (1 uM) for en d i fullstendig vekstmedium. For kombinasjonen av de to, ble cellene behandlet med 5-aza-dC i 2 dager, etterfulgt av TSA behandling i 1 d. Helcellelysater ble ekstrahert i RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP 40, 0,5% deoksykolat, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM natriumortovanadat, og Complete Proteinase inhibitor Cocktail tabletter), kvantifisert ved hjelp av en DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA), og justert med samme volum 2 x Laemmli-prøvebuffer (Sigma, St. Louis, MO). Proteinet ble kjørt på en 10% Tris-glysin gel (Invitrogen, Grand Island, NY), overført til en PVDF-membran, og probet med anti-MIG-6 [11] eller anti-β-aktin-antistoff (Sigma).
RNA Utarbeidelse og RT-PCR analyse
Ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen), ble totalt RNA isolert fra hverandre cellelinje behandlet med 5-aza-dC og /eller TSA og fra kontroller, som detaljert over. For revers transkripsjon (RT) -PCR, ble først-kjede cDNA først syntetisert fra 1 ug RNA ved hjelp av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen), etterfulgt av PCR-amplifikasjon under anvendelse av 5% cDNA for hver reaksjon. Følgende er primerne anvendt for amplifikasjon av hvert gen: for
MIG-6
, 5′-ATGTCAATAGCAGGAGTTGCTG-3 «(sense) og 5′-GTCTAAGGAGAAACCACATAGG-3» (antisense); for
GAPDH
, 5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3 «(sense) og 5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3» (antisense);
