Abstract
Notch vei bidrar til selvfornyelse av tumor initiere celle og hemming av normal tarm epitelcelledifferensiering. Deregulert uttrykk for Notch1 og Jagged1 er observert i tykk- og endetarmskreft. Hårete /enhancer av split (HMS) familie, de karakteriserte målene for Notch, er involvert i utviklingen av mange kreftformer. I denne studien utforsket vi rollen Hes1 i tumorigenesis av tykktarmskreft. Knocking ned Hes1 indusert CRC celle senescence og redusert invasjonen evne, mens over-uttrykk for Hes1 økt STAT3 fosforyleringsaktivitet og oppregulert MMP14 proteinnivå. Vi ytterligere utforsket uttrykk for Hes1 i human kolorektal kreft og funnet høy Hes1 mRNA uttrykket er assosiert med dårlig prognose i CRC pasienter. Disse funnene tyder på at Hes1 regulerer invasjonen evne gjennom STAT3-MMP14 sti i CRC celler og høy Hes1 uttrykk er en prediktor for dårlig prognose av CRC
Citation. Weng M, Tsao P, Lin H, Tung C , Endre M, Chang Y, et al. (2015) Hes1 Øker Invasion Evne til tykktarmskreftceller via STAT3-MMP14 Pathway. PLoS ONE 10 (12): e0144322. doi: 10,1371 /journal.pone.0144322
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 24 juni 2015; Godkjent: 15 november 2015; Publisert: 09.12.2015
Copyright: © 2015 Weng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Liver Disease Prevention Behandling Research Foundation, Taiwan, til MTW. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen [1] og kirurgisk reseksjon er standard behandling for tidlig stadium CRC. Chemotherapies inkludert oksaliplatin, irinotecan, og flouracil er vilt brukes til å behandle avansert sykdom [2]. Terapi mot vaskulær endotelial vekstfaktorer og deres reseptorer, for eksempel bevacizumab [3], aflibercept [4], og regorafenib [5], forlenge overlevelse av pasienter med fremskredne kolorektal kreft. Men til tross for fremskritt i kirurgiske reseksjoner og systemisk behandling, inkludert adjuvant kjemoterapi, mange pasienter dør fortsatt av CRC, og kolorektal kreft er fjerde i kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [1].
Genetiske og epigenetiske forandringer kjøre initiering og progresjon av adenom-karsinom sekvens i kolorektal cancer [6] og avvikende aktivering av Notch1 signalering er en av de identifiserte veien [7, 8]. Hakk signalering bidrar til selvfornyelse av tumor-celler, initiere utvidelse av tarmstamcellepoolen, og hemming av normal tarm epitelcelledifferensiering [9-11]. Hakk signalering blir aktivert ved binding av to grupper av ligander, taggete (Jagged1, 2) og Delta-lignende (Dll1, 3, 4). Det ble observert høyere ekspresjon av Notch1 og Jagged1 mRNA og deres proteiner i CRC vev sammenlignet med tilstøtende ikke-tumorvevet [12]. Videre Notch1 protein uttrykk var positivt korrelert med tumorstadium [12] og patologi Karakter (høy uttrykk Notch1 i dårlig differensiert karsinom) [8, 13].
En av de mest karakteriserte målene for Notch er hårete /enhancer av split (HMS) familie [14]. Dette målet viser løfte i indusere intestinal tumor celledifferensiering [15]. Overekspresjon av Hes1 har blitt assosiert med utvikling av pankreatisk [14, 16, 17], bryst [18] og ovarie [19] kreft og dens nedregulering resulterer i akselerert differensiering og nedsatt celleformering i flere cancermodeller [20, 21 ]. Til dags dato har det vært snaut data om Hes1 uttrykk i tykk- og endetarmskreft [7, 22, 23]. Siden høy Notch uttrykk er observert i tykktarmskreft og er assosiert med svulsten scenen, var vi interessert i å vite om Hes1 er involvert i tumordannelse av colon adenokarsinom.
I denne studien har vi utforsket uttrykk for Hes1 i human kolorektal kreft og korrelert sitt uttrykk med kliniske resultater. Høy Hes1 mRNA-ekspresjon er assosiert med dårlig prognose i CRC-pasienter. I funksjonsanalyse, fant vi at undertrykkelse av Hes1 uttrykk induserer mer CRC celle senescence og reduserer invasjonen evne CRC cellene gjennom å regulere MMP14 uttrykk.
Materiale og metode
Cellekulturer
Menneskelige 293-T-celler og koloncancercellelinjer: HCT116, ble Caco2 og SW48 oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De ble holdt i DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære i en fuktet inkubator.
Reagenser
Plasmid EF.hHES1.Ubc.GFP og plasmid EF.deltaBHES1.Ubc.GFP ble kjøpt fra Linzhao Cheng laboratorium [24] via Addgene Inc. (Cambridge, MA). Den Flag-Hes1 ble generert ved å spalte EF.hHES1.Ubc.GFP med BamHI og Xhol, og innføring av plasmidet spaltet til de multiple kloningsseter av den pcDNA4-TAG-vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stattic ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kontroll siRNA og Hes1 siRNA ble hentet fra Qiagen (Venlo, Nederland). Lipofetamine RNAiMAX (Invitrogen) ble anvendt som et siRNA transfeksjon reagens. Protokollen ble gjort i henhold til produsentens instruksjoner på en endelig konsentrasjon på 10 nM.
Western Blot
Vest-blotter ble utført som tidligere beskrevet [24]. De primære antistoffene som ble brukt var Hes1 (Millipore, Billerica, MA), MMP14 (Abcam, Cambridge, UK), STAT3, fosfor-STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), flagg og Actin (Sigma-Aldrich). Membraner ble deretter inkubert med et spesifikt primært antistoff over natten, vasket, deretter inkuberes med et passende sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase, og utviklet ved hjelp av ECL (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).
RNA ekstraksjon og real- tid polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA fra pasientprøver ble ekstrahert med RNA-ekstraksjon kit (Qiagen) fra vevet homogenisert med Trizol (Invitrogen). Total RNA fra cellelinjene ble ekstrahert med en RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA ble revers transkribert til DNA ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Uttrykk for Hes1 og MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 og MMP14 mRNA ble evaluert ved hjelp av strøm SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems). GAPDH mRNA ble anvendt som en endogen kontroll. Ekspresjon av RNA ble analysert ved anvendelse av 2-ΔΔCt metode. Primere for mRNA uttrykk ble vist i S1 tabell.
spredningsanalyse
Celleviabilitet ble bestemt av MTT [3- (4,5-2-yl) -2,5- diphenyltetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich] assay.
in vitro-assay invasjon
invasive aktivitet ble målt ved anvendelse av en membran invasjon kultursystem i hvilket en polykarbonatmembran med 8 um porer (Millipore , Billerica, Massachusetts) belagt med Matrigel (R 0,05, ** p 0,01, *** p 0,005).
tappe Hes1 genet indusert flere CRC celler inn senescence
Det har blitt rapportert at Hes1 er nødvendig for reversibilitet av mobilnettet quiescence og det hindrer for tidlig alderdom i hvilende fibroblaster [25]. Vi banket ned Hes1 i SW48 og Caco2 celler og observert betydelig mer beta-galaktosidase uttrykk i Hes1 slått ned celler, tyder mer senescence i Hes1depleted celler (figur 1F og 1G).
knockdown av Hes1 genet minsker invasjon gjennom å regulere MMP14
Som flere matriksmetalloproteinaser (MMP) megle invasjonen av kreftceller [26] studerte vi uttrykk for et panel av MMP i tykktarm kreft celler på Hes1 knockdown. Vi har observert at bare MMP14 ekspresjon nivå ble redusert ved Hes1 knockdown på mRNA-nivå i Caco2-celler (figur 2A). Vi fant deretter knock-down Hes1 føre til MMP14 proteinnivået reduksjon i SW48 celler (figur 2B). Motsatt, over uttrykk for Hes1 ført til en økning av MMP14 mRNA uttrykk (Fig 2C). Vi ectopically uttrykt en mutant HES1 genet, som bærer en avkorting på sitt funksjonsdomene, og vi ikke observere økningen i MMP14 i HCT116 og HT29 celler (figur 2C).
(A) En serie av MMP mRNA uttrykk på siRNA Hes1 transfeksjon i Caco2 celler. (B) MMP14 protein nedgang på siRNA Hes1 transfeksjon i SW48 celler (C) MMP14 mRNA uttrykk på Hes1 og mutant Hes1 overekspresjon i HCT116 og HT29 celler. (* P 0,05, ** p 0,01)
Hes1 regulert MMP14 uttrykk avhenger STAT3 sti
Det ble rapportert at Hes1 aktiverer signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon 3 (STAT3) pathway [27, 28], og som styrer STAT3 MMP1 ekspresjon i tykktarmskreftceller [29, 30]. Vi vurderte derfor om STAT3 aktivitet spiller en rolle i HES1 regulering av MMP14 i tykktarm kreft celler. Hes1 uttømming av siRNA knockdown redusert MMP14 protein uttrykk i Caco2 og SW48 celler. Hes1 uttømming resulterte i en reduksjon av STAT3 fosforylering og ingen endring av den totale STAT3 i Caco2 og SW48-celler (figur 3A og 3B). Ectopically overekspresjon en FLAG merket konstitutivt aktiv STAT3 plasmid, resulterte i økte MMP14 protein nivåer i HCT116-celler (fig 3C og 3D). Ektopisk overekspresjon av Hes1 økt MMP14 uttrykk samt STAT3 phosphyorylation i HCT116 cellene. Videre ble STAT3 fosforylering og MMP14 proteinekspresjon redusert når cellene ble behandlet med stattic, en STAT3 aktiverings inhibitor (figur 3E og 3F). Våre funn tyder på at HES1 regulere MMP14 uttrykk gjennom opptil regulerende STAT3 aktivitet i tykktarm kreft celler.
Hes1 og MMP14 uttrykk er relatert til tumor stadium
Som Notch1 uttrykket er assosiert med tumor stadium, vurderte vi uttrykk for Hes1 i menneskelige CRC vev. Vi analyserte 74 parede human kolon adenokarsinom og deres tilstøtende ikke-tumor kolon vev fra National Taiwan University Hospital pasient kohort (tabell 1). Vi har oppdaget at ekspresjonsnivået av Hes1 (figur 4A) eller MMP14 mRNA (figur 4B) var relatert til tumorstadiet.
(A) Hes1 mRNA (
p
= 0,06 ved en vei ANOVA) og (B) MMP14 mRNA uttrykk (
p
= 0.60 etter en måte ANOVA) ble ikke korrelert med tumorstadium.
Høy uttrykk for Hes1 i CRC er assosiert med kortere overlevelse
Vi videre undersøkt om Hes1 og MMP14 uttrykk korrelerer med pasientens overlevelse. Hes1 mRNA uttrykk og MMP14 mRNA uttrykk var positivt korrelert i svulstvev (korrelasjon coefficiency = 0,238, p = 0,035). Høy Hes1 uttrykk i svulstene ble korrelert med kortere overlevelse ganger (figur 5A). Høy MMP14 ble også korrelert med kortere overlevelse (figur 5B).
Pasientene ble delt inn Hes1 /MMP14 lave og høye grupper basert på median ERH /MMP14 uttrykk og deres overlevelse ble plotting ved hjelp av Kaplan-Meier analyse ( uptick indikerer sensure hendelser). (A og B) CRC pasient med høy Hes1 og MMP14 ekspresjon er assosiert med dårlig overlevelse. (C og D) I undergruppen av pasienter med stadium I-III CRC, høy Hes1 og MMP14 uttrykk signifikant assosiert med dårlig overlevelse. (E og F) I undergruppen av pasienter med stadium IV CRC, Hes1 og MMP14 uttrykk er ikke forbundet med å overleve.
Vi videre stratifisert disse pasientene i henhold til deres metastatiske sykdommer. For pasienter med tidlig eller lokalt avansert sykdom, ble høy Hes1 eller høy MMP14 uttrykk forbundet med betydelig kortere overlevelse. Men Hes1 og MMP14 uttrykk nivåer var relatert til overlevelse for pasienter med metastaserende sykdommer (Fig 5C-5F). Som MMP spiller en rolle i kreftinvasjon og metastase, kan det være mindre prognostisk for pasienter med svulster som allerede ble metastasized på diagnose
I henhold til den multivariable Cox regresjonsanalyse, Hes1 (HR, 2,41;. 95% CI , 1,07 til 5,43) og MMP14 (HR 2,36, 95% KI, 1,02 til 5,46) forble positivt assosiert med dødsfall fra tykk- og endetarmskreft. Metastase ble også signifikant assosiert (HR, 10,05; 95% CI, 4,11 til 24,60) med dødsfall fra tykk- og endetarmskreft (tabell 2). Når det gjelder samspillet mellom Hes1 og metastasering, pasienter present høy Hes1 fortsatt hadde en økt risiko for å dø av tykktarmskreft.
Diskusjoner
homeostase av selvfornyelse, spredning og differensiering av stilk og stamceller er regulert av Notch, WNT, FGF og the Hedgehog signalveier [31-33]. I tarmen, er disse reaksjonsveier også involvert i villi formasjon og kolorektal tumor utvikling [9, 34, 35]. Wnt veien viser kryss regulatoriske interaksjoner med Notch vei [36, 37]. APC
Min (multiple intestinal neoplasi) mus, hvori APC-genet bærer en trunkering mutasjon ved kodon 850 og den WNT veien er feilregulert, kan utvikle hundrevis av tynntarmen og kolon polypper [38]. Hakk aktivering er nødvendig for colonic adenom dannelse i APC
Min mus [10]. Hemming av Hes1 i APC
Min mus er redusert tumor celleproliferasjon og har ført til tumor celledifferensiering i intestinale epitelceller [15].
Hes1 spiller en viktig rolle i CRC kreftutvikling. Det binder direkte til promoteren til genet HATH1 og undertrykker Hath1 uttrykk [39]. Hath1 er en tumor suppressor som hemmer spredning og forankring uavhengig evne til tykktarmskreftceller [40, 41] og fremmer tarm sekretorisk celledifferensiering [42]. Det er velkjent at Hes1 forhindrer for tidlig alderdom i hvilende fibroblaster [25]. Her, demonstrerte vi at reduserende Hes1 i tykktarmskreftceller ikke påvirker celleproliferasjonen men økt beta-galaktosidase-ekspresjon, noe som indikerer at Hes1 uttømming induserer tykktarmskreftcelle senescens. Nedregulering av Hes1 indusert senescence har også blitt rapportert i hepatocellulært cellene gjennom å regulere CDKN1C /p57 [43].
Deretter preges vi at Hes1 fremmet celle invasjon ved å øke MMP14 uttrykk. MMP14 er en nøkkel protease i cellemigrering /invasjon og angiogenese [44, 45]. Høy uttrykk for MMP14 ble rapportert i lungekreft og gliom [46, 47]. Hes1 samhandler med STAT3 og fremmer sin fosforylering [28]. Videre STAT3 ble rapportert å oppregulerer MMP-2 og MMP-9-ekspresjon og aktivitet via direkte binding til deres promoter [48-50]. I denne studien har vi også observert at STAT3 overekspresjon økt uttrykk av MMP14 (fig 3). Våre funn tyder på at oppregulering av MMP14 ved Hes1 i CRC-celler er avhengig av STAT3 bane.
Til slutt ble det observert at både høy Hes1 og MMP14 ekspresjon var korrelert med dårlig overlevelse. Lignende resultat ble funnet i undergruppen av pasienter med tidlig eller lokalavansert CRC, men ikke hos pasienter som svulsten har spredning. I Veenendaal studie, observerte de høyere Hes1 uttrykk i grunnskolen tykktarm kreft, men tapte uttrykk i regionale og fjernmetastaser [23]. Dette funnet foreslått redusert Notch aktivitet i videregående kolorektal tumorer og kan forklare hvorfor Hes1 uttrykket nivået ikke er assosiert med overlevelse når svulsten har metastasied i vår studie. I motsetning til dette, Reedijk et al. tidligere rapportert at høy Hes1 er relatert til overlevelse av CRC pasienter ved å analysere 130 microarray data fra US National Cancer Institute Colon Cancer Family Registeret. Høy uttrykk ble definert som den øverste kvartil av Allred score [7]. Selv Reedijk er resultat konflikter med våre funn, svulsten scenen, høyt uttrykk definisjon og metodiske tilnærmingen er forskjellig i disse to studiene. Den virkelige prognostisk rolle Hes1 i CRC garanterer ytterligere bekreftelse.
I konklusjonen, avvikende aktivering av Notch veien hemmer celledifferensiering og bidrar til kreftutvikling. Hes1 er en viktig transcriptional repressor og essensielle regulatorer for Notch veien. Her viste vi at overekspresjon av Hes1 øker celle invasjon evne gjennom STAT3-MMP14 veien. Hes1 uttrykk er korrelert med MMP14 uttrykk i CRC og er en prediktor for pasientens overlevelse. Målrette det Notch-Hes1 veien kan utnyttes for terapeutiske formål i Notch aktivert kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. (A) Celleviabilitet endring på siRNA Hes1 transfeksjon i SW48 cellene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0144322.s001 plakater (TIF)
S1 Table. Primere for RT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0144322.s002 plakater (docx)
Takk
Vi vil gjerne takke Prof. Linzhao Cheng for allernådigst gi Hes1 og delta-Hes1 plasmider via Addgene.
