Abstract
Field of cancerization
i luftveisepitelet har blitt stadig undersøkt for å forstå tidlig patogenesen av ikke-småcellet lungekreft. Imidlertid er omfanget av feltet av cancerization gjennom lungeluftveiene uklar. Her søkte vi å bestemme differensial genet og mikroRNA uttrykk forbundet med feltet av cancerization i de perifere luftveier epitelceller hos pasienter med lunge adenokarsinom. Vi fikk perifere luftveis tannpuss fra røyker kontroller (n = 13) og fra lungene kontralateral til svulsten hos kreftpasienter (n = 17). Vi utførte genet og mikroRNA expression profilering på disse perifere luftveier epitelceller ved hjelp av Affymetrix Genechip og TaqMan Array. Integrert genet og mikroRNA analyse ble utført for å identifisere viktige molekylære stier. Vi identifiserte 26 mRNA og 5 mirnas som var betydelig (FDR 0,1) oppregulert og 38 mRNA og 12 mirnas som var signifikant nedregulert i kreftpasienter sammenlignet med røyker kontroller. Funksjonell analyse identifisert differensial transcriptomic uttrykk knyttet til tumorigenesis. Integrering av miRNA-mRNA-data inn i interaksjons nettverk analyse viste modulering av det ekstracellulære signalregulerte kinase /mitogen-aktivert protein kinase (ERK /MAPK) reaksjonsveien i den kontralaterale lunge innen cancerization. I konklusjonen, pasienter med lunge adenokarsinom ha kreftrelaterte molekyler og stier i histologisk normalt vises perifere luftveier epitelceller, en betydelig avstand fra selve svulsten. Dette funnet kan potensielt gi nye biomarkører for tidlig deteksjon av lungekreft og nye terapeutiske mål
Citation. Tsay J-CJ, Li Z, Yie T-A, Wu F, Segal L, Greenberg AK, et al. (2015) Molekylær karakterisering av Peripheral Airway Field of Cancerization i Lung Adenocarcinoma. PLoS ONE 10 (2): e0118132. doi: 10,1371 /journal.pone.0118132
Academic Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANKRIKE
mottatt: 14 august 2014; Godkjent: 05.01.2015; Publisert: 23 februar 2015
Copyright: © 2015 Tsay et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data er tilgjengelig fra GEO databasen, deponeringsnummer GSE54495, GSE54541 og GSE54543
Finansiering:. JJT er finansiert av National Institutes of Health stipend T32 ES007267, UO1 CA086137, UL1 TR000038, og Stony-Wold Herbert Fund Fellowship (http: //www.stonywoldherbertfund.com). WNR er finansiert av National Institutes of Health stipend T32 ES007267, UO1 CA086137, UL1 TR000038, RO1 HL090316 og K24 AI080298A. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, er fortsatt tidlig på molekylære endringer dårlig forstått, med mer forskning er nødvendig for å forbedre tidlig diagnostisering og øke overlevelse. Den skuffende lav (15%) 5-års overlevelse av lungekreft gjenspeiler det faktum at de fleste pasienter til stede med avansert sykdom [1]. I motsetning til dette, når lungekreft påvises i fase I og kirurgisk reseksjon, er 10-års overlevelse så høyt som 88% [2]. Tyde tidlig molekylære hendelser i lunge tumorigenesis har potensial til å forbedre den kliniske behandlingen av lungekreft.
Eksponering for miljøgifter, spesielt sigarettrøyk, radon, og asbest, er den viktigste skyldige i å initiere og fremme lunge tumorigenesis . Eksponering for disse forurensninger og verts inflammatoriske responser til irritanter resultere i et histologisk og molekylær felt for skade hele det sentrale og perifere luftveier [3]. Begrepet felt cancerization, først beskrevet av Slaughter et al. i 1953, refererer til deler av histologisk normalt epitel, ved siden av tumorvevet, men med en unormal molekylprofil lik den for selve svulsten [4]. I lungekreft, har studier vist at tilstøtende histologisk normale luftveier epitelceller har mutasjoner i p53, KRAS, og EGFR gener, avvikende promoter metylering, og allel tap [5-11]. I tillegg har studier på microRNAs (mirnas) og deres mål messenger RNA transkripsjoner (mRNA) vist at disse molekylene spiller en viktig rolle i lungekreft initiering og progresjon [12-14]. Differensielt uttrykte mirnas i normale vev og lungekreft har vist seg å målrette protein-kodende tumor-suppressorer og onkogener [15,16]. Tilsvarende har genekspresjonsprofiler i den proksimale luftveisepitel av pasienter med lungekreft gitt innsikt i virkningen av lunge felt av cancerization [17].
Selv om betydelig fremskritt har blitt gjort i å profilere de molekylære endringer i feltet av cancerization, lite er kjent om dette feltet effekt i det perifere luftveiene og hvor langt «feltet» strekker seg. Transcriptomic studier på perifere luftveiene av røykere og ikke-røykere har vist endringer i gener som koder for immunitet, apoptose, mucin produksjon og respons på oksidanter og xenobiotics [18,19]. Siden adenokarsinom vanligvis oppstår fra perifere luftveier eller alveolære epitelceller, spesielt Clara celler og type II pneumocytes, bedre karakterisering av molekylære avvik i disse terminalluftveis bronchoalveolar celler kan føre til bedre forståelse av tidlige hendelser i tumorigenesis. Vi antok at ved å bruke high-throughput teknologier samtidig profil miRNA og mRNA uttrykk av perifere luftveier epitelceller i høyrisiko røykere og lungekreftpasienter, kan vi for det første finne høyere orden miRNA-mRNA interaksjoner knyttet til feltet av cancerization og tumorigenesis; og andre, demonstrere effekten av lungefelt cancerization i kontralaterale lunge av svulsten.
Metoder
pasient
Mellom april 2010 og mai 2012 rekrutterte vi 30 pasienter (17 med lunge adenokarsinom og 13 røyker kontroller), og alle signerte informert samtykke. Deltakere inkludert nåværende eller tidligere (slutte 5 år) røykere ( 20 pakke-år), alder 55-75 år, med mistenkelige knuter, som ble henvist til diagnostisk bronkoskopi ved New York University Langone Medical Center og Bellevue Hospital Center. Vi ekskluderte de med tidligere tilfeller av kreft. Sytten personer ble bekreftet å ha diagnosen adenokarsinom etter bronkoskopi. Tretten personer ble klassifisert som kontroll røykere; inkludert røykere med godartede knuter etter normal diagnostisk bronkoskopi og med mer enn tre års stabilitet på CT scan; og normal røyker frivillige uten lunge knuter. Protokollen ble godkjent av New York University Langone Medical Center Institutional Review Board (IRB) og Bellevue forskningskomiteen (BRC) på Bellevue Hospital Center.
Airway epitelcelledifferensiering innsamling og RNA prosessering
gjennom bronkoskopi, samlet vi perifere luftveier epitelceller ved å børste de små luftveiene i lungene kontralateral til mistenkelig nodule, jeg. e. upåvirket lunge. I kontrollene uten knuter, ble brushings samlet inn fra de perifere luftveiene i lingula eller venstre nedre lobe. Tilstedeværelsen av Clara celler på cytologi børste bekreftet prøvetaking av de små perifere luftveiene (se S1 figur i den elektroniske supplement). Den cytologi pensel ble spunnet ned og cellepelleten ble samlet og lagret ved -80 ° C til RNA ekstraksjon.
mikroRNA og mRNA microarray
Vi hentet total RNA ved hjelp av Qiagen miRNeasy Mini Kit (Valencia , CA). For å identifisere målgener ble global genekspresjon profilering utført med Affymetrix (Santa Clara, California) Genechip Human Genome U133 Plus 2.0 Array (HG-U 133 Plus 2.0). Vi brukte TaqMan Array Menneskelig mikroRNA En kort v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) for å profilere miRNA på de samme RNA prøver. Alle microarray data er blitt sendt til Gene Expression Omnibus (GEO) under tiltredelsen tall GSE54495 (mRNA) og GSE54541 (miRNA).
Analyse av microarray mRNA og miRNA data
Affymetrix array-data var analysert ved GeneSpring GX versjon 12.6.1 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, USA) ved hjelp av lineære modeller for mikroarray data (LIMMA). Mirna TAQMAN array-data ble normalisert basert på komparative CT representasjon ved hjelp av den globale normalisering metoden. DAVID 6,7 ble anvendt for funksjonell anrikning analyse av mRNA-data. Gene sett Enrichment Analysis (GSEA) ble brukt for å vurdere overensstemmelse mellom de data og
a priori
definert sett av gener. DIANA-mirPath [20] ble utført på miRNA TAQMAN array-data for Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) pathway analyse. Hierarkiske heatmaps ble generert med komplett kobling clustering metode og squared euklidsk avstand tiltak. Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) ble anvendt for å identifisere topp biologiske funksjoner og sykdoms /lidelser, og for å generere trasé regulert fra integrerte mRNA-miRNA data (https://www.ingenuity.com). Mirna spådd mål for integrert analyse ble generert basert på TargetScan 6,2 (www.targetscan.org) eller Miranda (microRNA.org). (S2 Fig for totale studie design). Vi brukte støttevektormaskiner (SVM) for å utvikle multivariate molekylære signaturer av lunge innen cancerization fra forskjellig uttrykt miRNA og mRNA etter leave-one-out kryssvalidering protokollen.
Kvantitativ Real-time Revers transkripsjon PCR-analyse
Vi isolert total RNA ved hjelp av Qiagen miRNeasy Mini Kit (Valencia, CA) ifølge selskapet protokollen, og utført kvantitativ sanntid-polymerase chain reaction på fire mRNA (ASCL1, AMOTL2, CLCN3, og MAP3k8) og fire mirnas (MIR-486-3p, MIR-483-5p, MIR-374a, og miRNA-375).
statistiske metoder og grafer
Vi brukte GeneSpring og MATLAB (De MathWorks, Inc .) for å beregne LIMMA-verdi, student
t
-test
p
-verdi, Benjamini-Hochberg False Discovery Rate (FDR) for justering av flere sammenligninger, og brett endring (FC) for hvert enkelt gen /miRNA probe. Sammenheng mellom fenotype og miRNA /mRNA ble vurdert ved hjelp av både korrelasjonskoeffisient og delvis korrelasjonskoeffisient forutsetning av alder, kjønn og røykestatus. Differensial uttrykk sammenligning ble gjort mellom tidlig stadium I og II adenokarsinom vs. sent stadium III og IV adenokarsinom. Pearsons korrelasjon ble anvendt for å beregne korrelasjon mellom RT-PCR og microarray plattformer. Rank-order analyse ble brukt for å sammenligne miRNA-mRNA korrelasjon. Areal under kurven ble generert ved hjelp av Mann-Whitney U statistikk teori.
(Se S1 Metoder for mer detaljert beskrivelse)
Resultater
Demografiske og kliniske karakteristika
av de 30 fagene rekruttert til denne studien, 17 ble diagnostisert med lunge adenokarsinom etter innledende bronkoskopi og 13 ble bestemt til å være røyker kontroller, gratis for lungekreft. De kliniske kjennetegn ved disse fagene er vist i tabell 1. De fleste av forsøkspersonene var menn, kaukasiske og hadde en betydelig røyking historie ( 30 pakke år), og de fleste kreftformer var stadium III-IV lunge adenokarsinom
Gene Expression i Peripheral Airways Kontralateralt til tumor
for å karakterisere forskjeller i genuttrykk som finnes innen cancerization i lungekreftpasienter sammenlignet røyker kontroller, samlet vi perifere luftveier epitelceller fra luftveiene fjernt fra svulsten,
i
.
e
. i kontralaterale lunge, som vi kaller den kontralaterale perifere luftveier. RNA prøver ble hentet og kjørt på Affymetrix HG-U 133 Plus 2.0 chip. Etter å ha justert for alder, kjønn og røykestatus, brukte vi FDR korreksjon på 0,10 som terskelen. 64 mRNA i den kontralaterale perifere luftveis-epitelceller ble funnet å bli uttrykt forskjellig mellom lungekreftpasienter og røyker kontroller (S1 Table); de 30 beste mRNAer er vist i fig. 1A. Av disse 64 mRNA, 38 mRNA ble nedregulert i lungekreftpasienter, hvorav de 5 beste mRNA var CHGB, B4GALT1, ZNF434, GLB1, og ASCL1 (
p
≤0.0001). Av de 26 mRNA som var oppregulert, INSIG1, SGK223, RND3, TUFT1, DPYD, og AMOTL2 var den mest betydningsfulle (
p
≤0.0001). Fig. 1B-C viser individuelle prikkplotter for hver av de 30 beste mRNA identifisert som signifikant forskjellig mellom saker og kontroller. Disse funnene tyder på mulige forskjeller i underliggende biologiske prosesser.
A) Bruke Affymetrix Gene Chip HG U133 Plus 2.0, Topp 30 differensierte mRNA i perifere luftveier innen cancerization av kreftpasienter (svart strek) vs. perifere luftveier røyker kontroller (grå linje) er vist. 13 mRNA ble sterkt oppregulert og 17 mRNA var sterkt nedregulert i perifere luftveier innen cancerization. Genekspresjon gangers forandring er vist som gjennomsnittet uttrykk i forhold til en referanseverdi. Tabellen nedenfor viser FDR verdigrunnlaget Benjamini-Hochberg multippel testing og log2 ganger endring verdi av kreftpasient i forhold til røyker kontroll. B) Individuell prikkplott av kreftpasienter (n = 17) sammenlignet med røyker kontroller (n = 13) med oppregulert mRNA. C) Individuell prikkplott med nedregulert mRNA.
For å ytterligere evaluere de biologiske prosesser i den perifere luftveier innen cancerization, vi spilte DAVID bioinformatiske funksjonell berikelse analyse fra ovenfor genet listen. Funksjonell Kommentar analyse (S2 Table) med en «medium» klassifisering stringens genereres en liste over biologiske prosesser som de beste betingelsene inkludert apoptose (fold berikelse = 3,9, p-verdi = 0,01), programmert celledød (fold berikelse = 3,9, p verdi = 0,01), disakkarid metabolske prosessen (fold berikelse = 133,1, p-verdi = 0,01), celledød (fold berikelse = 3,3, p-verdi = 0,02), og celleproliferasjon (fold berikelse = 3,9, p-verdi = 0,04). Apoptose, programmert celledød, og celledød gener inkludert TNS4, BAD, AHR, B4GALT1, og PLG. Celleproliferasjon gener inkludert CALCA, TUSC2, ASCL1, INSIG1, og BAD. Disse differensielt uttrykte biologiske prosesser i den kontralaterale perifere luftveier, hvorav mange er viktige i tumorgenese, tyder på at vev langt fra tumor kan også ha unormale molekylære uttrykk. Vi utførte GSEA bruker offentlig tilgjengelige datasett. Vi identifiserte konkordant forhold med 10 gensettene (FDR 0,1) i C4 beregnings gensettene, kreft genet nabolag samling av Broad Institute Molecular Signaturer Database (MSigDB). Disse gensettene er involvert i apoptose (MORF_DAP, MORF_CSNK2B, MORF_PHB), DNA-reparasjon (MORF_DDB1), og onkogener MYC (MORF_NME2) og RAS (MORF_RAN). (S3 figur, S3 tabell). Vi har også identifisert 14 gensettene (FDR 0,1) i de C4 beregnings gensettene, kreft moduler samling av MSigDB (flere detaljer i S4 tabell). Topp 5 gensettene er vist i S4 fig. Både David og GSEA identifisert lignende biologiske prosesser i den perifere luftveier innen cancerization, hvorav mange er knyttet til lungekreft patogenesen.
neste brukte kvantitativ RT-PCR for å bekrefte våre Affymetrix microarray resultater. Først validert vi to av de mest vesentlig endret genene, ASCL1 og AMOTL2, i en undergruppe av 20 pasienter (13 lungekreftpasienter og 7 kontroller). De ulike genuttrykk deteksjonsmetoder produsert tilsvarende
p
-verdier og kaste endringer (Fig. 2A). ASCL1 ble betydelig redusert i kreft sammenlignet med kontrollen ved 0.32-fold, p = 0,003 (RT-PCR) vs. 0,36 ganger
p
= 0,0001 (Affymetrix microarray). AMOTL2 ble betydelig økt i kreft i forhold til kontroll med 1,2 ganger,
p
= 0,006 (RT-PCR) vs. 1,7 ganger,
p
= 0,0001 (Affymetrix microarray). Likeledes har vi brukt RT-PCR for å vurdere ekspresjon av to andre tilfeldig utvalgte gener, CLCN3 og MAP3k8, og fant gangers endring i samme størrelse og retning ved hjelp av de to metoder (Fig. 2B). CLCN3 ble redusert i kreft sammenlignet med kontrollen ved 0.80-fold,
p
= 0,09 (RT-PCR) vs. 0,84 ganger,
p
= 0,01 (microarray). MAP3k8 ble økt i kreft sammenlignet med kontrollen ved 1.51-fold,
p
= 0,11 (RT-PCR) vs. 1,57 ganger,
p
= 0,001 (microarray). Korrelasjons tomter mellom RT-PCR data og microarray data for de enkelte fag er vist i S5 Fig.
A) To svært viktige differensielt uttrykte gener (ASCL1 og AMOTL2) oppdaget av microarray i de perifere luftveier epitelceller kreftpasienter sammenlignet med røykere kontroller, ble bekreftet med RT-PCR, produsere lignende p-verdi og brett endring. B) To tilfeldig utvalgte gener (CLCN3 og MAP3k8) ble bekreftet med RT-PCR for å produsere ganger endring i samme retning og med samme størrelsesorden som det som ble sett med microarray. Genekspresjon ble uttrykt som middel ± standardfeil og av tekniske midler. C-D) Tre oppregulert miRNA og en fjerde nedregulert miRNA var velger for RT-PCR bekreftelse miRNA uttrykket. MIR-486-3p, MIR-483-5p, og MIR-374a var oppregulert og MIR-375 ble nedregulert i de perifere luftveier innen cancerization i lungekreftpasienter sammenlignet røyker kontroller; ganger endring mellom kreftpasienter og røyker kontrollene var i samme retning. MiRNA uttrykk ble uttrykt som middel og ± standardfeil av midler.
Det er interessant å merke seg at når vi sammenlignet våre prøver basert på tumorstadium, analyse av stadium I /II (tidlig) vs. stadium III /IV (sen) produserte ikke statistisk signifikante mRNA (FDR 0,1); noe som antyder at patogenesen av feltet av cancerization kan være forskjellig fra den til tumormetastase. Det er mulig at denne studien ikke kan drives for å analysere genekspresjon forskjeller mellom tumorstadier; Alternativt er det mulig at ingen forskjeller ble oppdaget fordi det var ingen direkte metastaser til kontralaterale lunge i våre fag.
mikroRNA uttrykk i Peripheral Airways Kontralateralt til Tumor
Vi brukte samme RNA prøver hentet fra kontralaterale perifere luftveier epitelceller lungekreftpasienter og røyker kontroller for å profilere miRNA uttrykket bruker TaqMan Array Menneskelig mikroRNA En kort v2.0. Justert for alder, kjønn og røykestatus, og ved hjelp av FDR 0,1 filter, 17 mirnas ble funnet å være forskjellig uttrykt (fig. 3A). Av disse 17 mirnas (S5 Table), 12 mirnas var nedregulert i lungekreftpasienter; MIR-224, MIR-708, MIR-221, og MIR-328 var den mest betydningsfulle. Av de 5 mirnas som var oppregulert i tilfeller med lungekreft, MIR-483-5p, MIR-374a, og MIR-486-3p var den mest betydningsfulle. Fig. 3B-C viser individuelle prikkplotter for hver av de 17 miRNAs. Forskjeller i miRNA uttrykket mellom kreftpasienter og røyker kontroller tyder på at modulering av miRNAs kan aktivere biologiske mekanismer knyttet til tumorigensis
A) Bruke TaqMan miRNA Array, 5 mirnas var svært (FDR. 0,1) oppregulert i perifere luftveier innen cancerization av kreftpasienter (svart strek) vs. perifere luftveier røyker kontroller (grå bar). 12 mirnas (FDR 0,1) ble sterkt nedregulert. Mirna ganger endring er vist som betyr uttrykket i forhold til en referanseverdi. Tabellen nedenfor viser FDR verdigrunnlaget Benjamini-Hochberg multippel testing og log2 ganger endring verdi av kreftpasient i forhold til røyker kontroll. B) Individuell prikkplott av kreftpasienter (n = 17) sammenlignet med perifere luftveier røyker kontroller (n = 13) med oppregulert miRNAs. C) Individuell prikkplott med nedregulert mirnas.
For å utforske de biologiske mekanismer som kan være regulert av disse mirnas, utførte vi en KEGG sti klassifisering analyse ved hjelp av DIANA-mirPath [20] med mikrotiterplater -CDS prediksjon. Mikrotiterplater-CDS prediksjon identifisert de fem mest betydningsfulle KEGG pathways: ErbB signalveien (p = 2.3×10
-26, 14 mirnas), prostatakreft (p = 2.3×10-26, 14 mirnas), TGF-beta signalveien (p = 2.1×10
-25, 13 mirnas), mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) signalveier (p = 6.2×10
-49, 24 mirnas), og pathways i kreft (p = 5.1×10
-21, 16 mirnas) (S6 fig). Interessant fleste KEGG veier skyldes fire mirnas: Mir-374a, MIR-26a, MIR-27b, og MIR-320A. Modulering av kreftrelaterte pathways støtter tilstedeværelsen av feltet cancerization på miRNA nivå i kontralaterale perifere luftveis epitelceller.
For å validere våre microarray funnene vi tilfeldig valgte fire miRNA å kvantifisere av kvantitativ RT-PCR og sammenlignet med kvantifisering av miRNA av TaqMan array i en undergruppe av 19 pasienter (12 lungekreftpasienter og 7 kontroller). De oppregulert mirnas inkludert: MIR-486-3p, med 2,9 ganger endring (
p
= 0,034) ved RT-PCR vs. 4,8 ganger endring (
p
= 0,001) av TaqMan matrise; MIR-483-5p, med 2,5 ganger endring (
p
= 0,014) ved RT-PCR vs. 4,1 ganger endring (
p
0,0001) ved TaqMan matrise; og MIR-374a, med 1,3 ganger endring (
p
= 0,24) ved RT-PCR vs. 1,9 ganger endring (
p
= 0,001) av TaqMan array (Fig. 2C-D) . MiRNA-375 ble nedregulert, med 0,8 ganger endring (
p
= 0,21) ved RT-PCR vs. 0,3 ganger endring (
p
= 0,002) av TaqMan array. Korrelasjons tomter mellom RT-PCR data og TAQMAN array-data for de enkelte fag er vist i S7 fig. Viktigere, forskjeller i miRNA ekspresjon var i samme retning for begge metodene. Men omfanget av forskjellen mellom saker og kontroller var større for de TaqMan array-data.
Integrert mRNA og miRNA analyse identifisert ERK /MAPK Pathway
For ytterligere å utforske stier knyttet til identifisert endringer i uninvolved perifere luftveier epitelceller fra kreftpasienter vs røyker kontroller, vi integrert forskjellig uttrykt miRNA data med negativt korrelerte spådd mRNA mål fra disse 30 pasientene for analyse. Forutsatt større statistisk styrke ved å integrere miRNA og mRNA-data, valgte vi negativt korrelert mirnas og mRNA med FDR 0,15. Hele 24 miRNAs og 67 mRNA prober ble valgt etter filter, som produserer 102 miRNA-mRNA motstandere (S6 Table). Ved hjelp av IPA program analyse, identifiserte vi de beste biologiske funksjoner av disse miRNA-mRNA motstandere som blir involvert i cellulær utvikling (
p
= 7.8×10
-8, 38 molekyler), cellevekst og spredning (
p
= 2.5×10
-7, 43 molekyler), celledød og overlevelse (
p
= 1.1×10
-6, 44 molekyler), cellulær bevegelse (
p
= 3.1×10
-5, 31 molekyler), og cellesyklus (
p
= 2.6×10
-5, 19 molekyler). IPA nettverk generasjon funnet at de fleste av disse mRNA og mirnas (54 molekyler) ble nettverk til det ekstracellulære signalregulerte kinase /mitogen-aktivert protein kinase (ERK /MAPK) veien (fig. 4), som representerer en kompositt av sammenslåing 3 topp interaksjons nettverk basert på «nettverket stillingen». Dette høyere ordens analyse var i stand til å identifisere en tidligere kjent onkogen signalveien, MAPK, i de perifere luftveier innen cancerization, hvilket antyder at interaksjonen mellom mRNA og miRNA kan være viktig i området cancerization .
IPA ble brukt til å generere et nettverk av molekyler fra mRNA og miRNA som var signifikant forskjellig i perifere luftveier innen cancerization i lungekreftpasienter sammenlignet røyker kontroller. Dette sammensatte nettverk fusjonere tre beste nettverk basert på «nett poengsum», som konvergerer på ERK /MAPK vei: spesifikt sammenslåing på ekstracellulære signalrelatert kinaser 1 og 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal kinaser (JNKs) og p38 kinaser underfamilie. Red er oppregulert og Grønn er nedregulert.
miRNA og mRNA uttrykk sammenheng identifiserer MIR-374a og ASCL1 samhandling
For ytterligere å karakterisere miRNA-mRNA interaksjon i det perifere luftveier innen cancerization, utforsket vi bestemte miRNA-mRNA motstandere. Vosa og kolleger identifisert MIR-374a som en prognostisk biomarkør i tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft [21]. Vi identifiserte også MIR-374a som en forskjellig uttrykt miRNA i de perifere luftveier innen cancerization; uttrykket ble økt i lungekreftpasienter sammenlignet røyker kontroller (Fig. 3). Ved hjelp av en offentlig tilgjengelig miRNA mål prediksjon program, Miranda, vi søkte etter mulige mål av MIR-374. En av de antatte mål, ASCL1, et gen medlem av de grunnleggende helix-loop-helix familie transkripsjonsfaktorer, ble også identifisert i vår studie som uttrykt forskjellig. Kvantitativ RT-PCR bekreftet våre resultater microarray (Pearsons korrelasjon = 0,47, p = 0,04) (S7 fig). Når vi korrelert Mir-374a og ASCL1 kvantitative RT-PCR uttrykk i hver enkelt, fant vi en signifikant negativ korrelasjon (p = 0,013), som forventet med miRNA-mRNA motstandere (Fig. 5.) Mens det er stor litteratur som beskriver funksjon av ASCL1, lite er kjent om MIR-374a. Vi vet at ASCL1 er viktig i lunge nevroendokrin celle utvikling, skade reparasjon lunge, luftveis dysplasi, og nevroendokrin differensiert lungekreft patogenesen [22-24]. Det finnes bevis på at lav MIR-374a uttrykk nivå i ikke-småcellet lungekreft er assosiert med dårlig overlevelse, noe som tyder på det kan ha svulst undertrykkende effekt. Vi hypotese at MIR-374a er regulert opp i feltet av cancerization, og i sin tur regulerer ned ASCL1 transkripsjonsfaktor, noe som kan representere en reaksjon av epitelceller til tilstedeværelse av tumor i lungen; eventuelt å motvirke og /eller forhindring av tumormetastase. Det vil være viktig å utforske videre mekanismen som dette samspillet påvirker tumorinvasjon.
Kvantitativ RT-PCR for MIR-374a og ASCL1 ble utført i den enkeltes perifere luftveier epitelceller (n = 17 kreftpasient og n = 13 røyker kontroller) for å bekrefte miRNA-mRNA negativ korrelasjon i rekken. Vi bekrefter at ASCL1 uttrykket er negativt korrelert med miRNA-374a uttrykk i perifere luftveis epitelceller (Pearsons = -0,56, p = 0,013).
Molekylære signaturer i Lung Field of Cancerization
for å undersøke om forskjellig uttrykt mRNA og mirnas i kontralaterale perifere luftveier epitelceller kan brukes til å differensiere våre kreftpasienter fra kreftfrie røykere, utviklet vi molekylære signaturer fra mRNA og miRNA data ved hjelp av støtte vektor maskiner (SVM) etter permisjonen -en-out kryssvalidering (LOOCV) protokoll. Når sammendragsverdimetrikker ble påført på differensielt uttrykte mRNA-er (FDR 0.15 og
