Abstract
Bakgrunn
homeodomain-samspill protein kinase 2 (HIPK2) er et multifunksjonelt protein som utnytter dens kinase-aktivitet for å modulere viktige molekylære reaksjonsveier i kreft å begrense tumorvekst og induserer respons på terapi. For eksempel, induserer HIPK2 knockdown oppregulering av onkogene hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) aktivitet fører til et konstituerende hypoksisk og angiogenic fenotype med økt tumorvekst
in vivo
. HIPK2 inhibering, og derfor frigjør reaksjonsveier som fører til produksjon av proinflammatoriske molekyler så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) eller prostaglandin E2 (PGE
2). Tumor-produsert andre enn fremme tumorvekst og vaskulær utvikling inflammatoriske mediatorer kan tillate omgåelse av anti-tumor immunresponser. Dermed dendrittiske celler (DC) dysfunksjon indusert av tumor produsert molekyler, kan tillate kreftceller til å unnslippe immunosurveillance. Her vurderte vi den molekylære mekanismen av PGE
2 produksjon etter HIPK2 utarming og hvordan å modulere det.
metodikk /hovedfunnene
Vi viser at HIPK2 knockdown i tykktarm kreft celler resulterte i cyklooksygenase -2 (COX-2) oppregulering og COX-2-avledede PGE
2 generasjon. På molekylært nivå, COX-2 oppregulering avhengig av HIF-1-aktivitet. Vi har tidligere rapportert at sink behandling hemmer HIF-1 aktivitet. Her, sink tilskudd til HIPK2 utarmet celler hemmet HIF-1-indusert COX-2 uttrykk og PGE
2 /VEGF produksjon. På translasjonsforskning nivå, mens betinget medie av både siRNA kontroll og HIPK2 utarmet celler hemmet DCs modning, klimaanlegg media på bare sink-behandlet HIPK2 utarmet celler effektivt restaurert DCs modning, sett på som uttrykk for co-stimulerende molekyler CD80 og CD86, cytokin IL- 10 release, og STAT3 fosforylering
Konklusjon /Betydning
Disse funnene viser at:. 1) HIPK2 knockdown indusert COX-2 oppregulering, for det meste avhengig av HIF-1 aktivitet; 2) sink behandling downregulated HIF-1-indusert COX-2 og inhibert av PGE
2 /VEGF-produksjon; og 3) sink behandling av HIPK2 utarmet celler restaurert DCs modning Anmeldelser
Citation. Garufi A, Pistritto G, Ceci C, Di Renzo L, Santarelli R, Faggioni A, et al. (2012) Targeting COX-2 /PGE
2 Pathway i HIPK2 knockdown kreftceller: Konsekvenser for Dendritic cellemodning. PLoS ONE 7 (11): e48342. doi: 10,1371 /journal.pone.0048342
Redaktør: Kjetil Tasken, Universitetet i Oslo, Norge
mottatt: 15 juni 2012; Godkjent: 24 september 2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Garufi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra italienske foreningen for Cancer Research (AIRC) til GDO (nr. 11377) og AF (n. 10265). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
homeodomain samspill protein kinase 2 (HIPK2) er et multifunksjonelt kinase hvis virksomhet begrenser tumorprogresjon. HIPK2 fosforylerer og aktiverer oncosuppressor p53 for apoptotisk funksjon som respons på medikamenter [1], [2]. HIPK2 undertrykker også signalveier som er involvert i tumorprogresjon, slik som Wnt /β-catenin, ved hjelp av sin katalytiske aktivitet og transkripsjon undertrykkelse funksjon [3], [4]. Flere nylig, fant vi at HIPK2 hemmer hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF-1α) subenhet på transkripsjonsnivået. HIF-1 er en heterodimer transkripsjonsfaktor som induserer transkripsjon av mer enn 60 gener involvert i angiogenese, glukosemetabolisme og invasjon [5]. HIF-1 består av HIF-1β subenhet, konstitutivt uttrykt i celler, og den oksygenfølsomme HIF-1α subenheten. Økte HIF-1α nivåer er ofte finnes i mange humane kreftformer og blir stimulert av lav oksygen men også ved genetiske endringer. I denne forbindelse induserer HIPK2 knockdown HIF-1α oppregulering med øket HIF-1-aktivitet som fører til vaskulær endotel vekst (VEGF) produksjon, tumor angiogenese og chemoresistance [6], [7]. I et forsøk på å målrette HIF-1-aktivitet, vi tidligere har demonstrert at sinkioner tillate HIF-1α proteindegradering i kreftceller som fører til undertrykkelse av HIF-1 sti
in vitro
og
in vivo
[8] med restaurering av kjemosensitivitet [9].
Annet enn å indusere VEGF uttrykk, fører HIPK2 knockdown til økt prostaglandin E2 (PGE
2) biosyntese som korrelerer med tumorvekst
in vivo
[10]. PGE
2 er den mest tallrike prostaglandin funnet i tykktarmskreft og favoriserer tumorvekst ved å stimulere proliferasjon, angiogenese, og invasivitet, og ved inhibering av apoptose [11]. PGE
2 aktiverer komponentene av onkogene Wnt signaleringssystem som fører til stabilisering og aktivering av β-catenin som transkripsjonsfaktor til å indusere ekspresjon av flere gener, inkludert syklooksygenase-2 (COX-2), c-myc, cyclin D1, og PPARδ som er involvert i tumorprogresjon [12].
dannelsen av prostaglandiner via COX-2 er en viktig vei i patogenesen av tykktarmskreft, men også av andre krefttyper [13]. COX-2, en induserbar form for syklooksygenase, katalyserer omdanningen av arakidonsyre (AA) for å endoperoxide mellomprodukter som blir til slutt omdannet til prostaglandiner (PGE2, PGD2, PGF2a, PGI2, og TXA2). COX-2 er sterkt indusert i respons til inflammatoriske mediatorer, vekstfaktorer onkogen aktivering, og tumorpromotere [14]. Derfor har forhøyede nivåer av COX-2 blitt funnet i mange krefttyper [15] – [17]. Transkripsjonen kontroll av den COX-2-gen, avhenger av den molekylære maskineri samspill med COX-2-promoteren, som synes å være styrt gjennom aktiviteten av forskjellige signalveier [18]. Blant dem, onkogene reaksjonsveier slik som Wnt /β-catenin signalering [19] eller HIF-1 [20] kan forsterke COX-2-gen-transkripsjon. Det er funnet at HIF-1-aktivert COX-2 /PGE
2 akse induserer VEGF og fremmer angiogenese [21], som i sin tur potensierer HIF-1 transkripsjonen aktivitet [22]. En slik krysstale mellom signalveiene fører til en auto løkke som er gunstig for tumorprogresjon. Derfor rettet mot HIF-1 er en funksjonell strategi for å avskaffe trasé som er involvert i tumorprogresjon, slik som COX-2 /PGE
2 /VEGF.
Kreftceller ofte produsere inflammatoriske molekyler som i mikromiljøet, annet enn å fremme tumorvekst og vaskulær utvikling, aktiverer unndragelse av anti-tumor immunresponser [23]. PGE
2, som andre tumor frigitte faktorer, har vist seg å undertrykke immunresponsen og tillate tumorceller å unnslippe immunosurveillance ved å indusere, for eksempel, lokale og systemiske dendrittiske celler (DC) dysfunksjon [24], [25]. DC er kraftige antigenpresenterende celler (APC) og som sådan har en avgjørende rolle i å initiere en immunrespons. DC er høyt spesialisert på antigenerobring, bearbeiding og presentasjon, og etter modning de uttrykker co-stimulerende molekyler (dvs. CD80- og CD86) som aktive T-lymfocytter [26]. Deres rolle i å utløse kreftspesifikke tiltak og påfølgende tumorregresjon har blitt grundig demonstrert gjennom
in vivo
vaksine stimulering eller
ex vivo
DC immunterapi [26]. Nedskrivning av DC modning kan avhenge av tumor utgitt faktorer og dermed indusere immunsuppresjon. Således vil en feil i DC-system er en av de viktigste faktorene som er ansvarlig for tumor flukt [27], [28].
På grunnlag av de ovenstående observasjoner, Hensikten med denne studien var først å evaluere rollen som COX-2 i PGE
2 generasjon følgende HIPK2 uttømming. Vi fant at HIPK2 knockdown førte til HIF-1-indusert oppregulering COX-2 og COX-2-avledede PGE
2 produksjon. Interessant, sink behandling downregulated COX-2 ekspresjon og inhibert av PGE
2 generasjon og dets signalbaner, samt HIF-1-indusert VEGF. Så, på funksjonsnivå, mens kondisjonert medium fra både siRNA kontroll og HIPK2 utarmet celler hemmet DCs modning, bare betinget media av sinkbehandlet HIPK2 utarmet celler, som viste sterk PGE
2 og VEGF downregulation, effektivt restaurert DCs modning.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studiet ble godkjent av etisk komité Policlinico Umberto i, Sapienza University, Roma, Italia.
Cells, kultur tilstand, behandlinger, og Betinget Media
Menneske RKO (tykktarmskreft) og stabilt HIPK2-forstyrret RKO-siHIPK2 [29] celler ble rutinemessig opprettholdt i RPMI-1640 (Livet-teknologi-Invitrogen) medium, mens HCT116 (tykktarmskreft), 293 (humane embryonale nyreceller) og Doxyclyclin (Dox) -inducible MCF7- (brystkreft) (MCF7indsi /HIPK2) celler uttrykker HIPK2-forstyrrelser [30], ble rutinemessig opprettholdt i DMEM (Livs Teknologi- Invitrogen) medium, alle inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin /streptomycin og glutamin i 5% CO
2-fuktet inkubator ved 37 ° C. For sink tilskudd, ble subsammenflytende celler behandlet med 100 mikrometer ZnCl
2 i 24 timer. For induserbar HIPK2 knockdown, ble Dox (1 mg /ml) tilsatt MCF7indsi /HIPK2 celler etter 3 dager før HIPK2 knockdown ble vellykket nådd (vanligvis i ca 5 dager). Etter HIPK2 knockdown ble nådd, ble cellene dyrket uten Dox for ytterligere 5 dager for hjemfall av HIPK2 uttømming.
For å få den betingede medium (CM), RKO siRNA kontroll og siHIPK2 utarmet celler ble sådd på 6 × 10
5/60 mm2 petriskål og dyrket inntil 60% samløpet. Deretter ble mediet erstattet og supernatantene (som er, kondisjonert medium) ble høstet 48 timer senere. ZnCl
2 (100 mM) ble tilsatt i 24 timer.
RNA Utvinning og revers transkripsjon (RT) -PCR Analyse
Cellene ble høstet i TRIzol Reagens (Invitrogen) og total RNA ble isolert etter produsentens anvisninger. cDNA ble syntesized fra 2 pg av total RNA med MuLV revers transkriptase kit (Applied Biosystems). Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført ved anvendelse av varm-Master Taq-polymerase (Eppendorf) med 2 pl cDNA reaksjon og gener spesifikke oligonukleotider under betingelser med lineær forsterkning. PCR ble utført i duplikat i to forskjellige sett av cDNA. PCR-produktene ble kjørt på en 2% agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging med UV-lys. Renhold β-aktin eller 28S gener ble anvendt som intern standard. Densitometrisk analyse ble anvendt for å kvantifisere spesifikke mRNA-nivåer sammenlignet med intern standard. Data presentert er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Western immunoblotting
totale celleekstrakter ble fremstilt ved inkubering ved 4 ° C i 30 minutter i lyseringsbuffer (50 mmol /liter Tris-HCl , pH 7,5, 150 mmol /l NaCl, 150 mmol /l KCl, 1 mmol /l ditiotreitol, 5 mmol /l EDTA, pH 8,0, 1% Nonidet P-40), pluss en blanding av protease-inhibitorer (Sigma Chemical Company) og fosfatase-hemmere, og løses ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Proteiner ble overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore). Membraner ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i PBS og inkubert med primære antistoffer som gjenkjenner COX-2 (Cayman Chemical), β-catenin (Santa Cruz Biotechnology), cyclin D1 (M-20, Santa Cruz, vennlig levert av Marco Crescenzi ISS, Roma, Italia), mus monoklonalt anti-HIF-1α (Novus Biologicals, UCS Diagnostic, Italia), p-STAT3 (Y705), total STAT3 (begge fra Cell Signaling Technology), og β-aktin (Calbiochem). Sekundært antistoff konjugert til pepperrot peroxidise (Bio-Rad) ble brukt ved 1:5000. Immunreaktiviteten ble påvist ved forsterket kjemiluminescens kit (ECL Kit, Amersham Corporation).
Transfeksjon og Plasmider
293-celler ble transfektert ved å bruke N, N-bis- (2-hydroksyetyl) -2amino -ethanesulphonic syre-bufret salinr (BBS) versjon av kalsiumfosfatprosedyren [31], mens RKO og HCT116 ble transfektert ved hjelp av den kationiske polymer LipofectaminePlus metode (Invitrogen), ifølge fremstilling instruksjon. Mengden av plasmid-DNA ble utjevnet i hver prøve ved å supplere med tom vektor og transfeksjonseffektiviteten ble visualisert ved anvendelse av en ko-transfektert GFP ekspresjonsvektor. Uttrykket plasmider som ble brukt var: den dominerende negativ form av HIF-1α uten DNA-bindende domene og trans domene (pCEP4-HIF-1α-DN) [32] (vennlig levert av BH Jiang, Nanjing Medical University, Kina), HIF-1α uttrykk vektor (vennlig levert av A. Farsetti, National Research Council, Roma, Italia) og HA-VHL uttrykk vektor (vennlig levert av WK Rathmell, University of North Caroline på Chapel Hill, USA).
RNA interferens
Celler ble sådd ut i semiconfluence i 35 mm skåler dagen før transfeksjon. Kontroll-siRNA og spesifikk siHIF-1α (Dharmacon), eller pSUPER-HIPK2 og kontroll pSuper vektorer [29] ble transfektert over natten ved hjelp LipofectaminePlus reagens (Invitrogen). 36 timer senere ble cellene behandlet med 100 mM ZnCl
2 i 24 timer. Transfeksjonseffektiviteten ble visualisert ved anvendelse av en ko-transfektert GFP-ekspresjonsvektor under et fluorescerende mikroskop. Effektiviteten av knockdown ble bekreftet ved RT-PCR-analyse.
ELISA-analysen
Celler dyrket til subconfluence i 60 mm petriskåler ble dyrket i 24 timer med 0,5% FBS før tilsetning av friskt medium med 10 % februar med eller uten COX-2 selektiv hemmer NS-398 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) ved 50 nM i 24 timer eller 100 mikrometer ZnCl
2 i 24 timer med. PGE
2 og VEGF deteksjon i cellekondisjonerte media ble bestemt i triplikat ved hjelp av enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) ved anvendelse av henholdsvis den Prostaglandin E2 EIA-sett (Cayman Chemical) og den Quantikine human VEGF immunoassay kit (R D Systems, Minneapolis, MN), i henhold til produsentens instruksjoner. PGE
2 og VEGF nivåer ble normalisert til cellenummer og uttrykt som pg /10
6 celler /ml.
For IL-10 produksjon av DC, klimaanlegg media fra siRNA kontroll og siHIPK2 utarmet celler , ubehandlet eller behandlet med 100 mM ZnCl
2 i 24 timer, ble tilsatt til DC-kultur i 96-brønners plater, 1/1 (vol /vol) med medium inneholdende IL-4 og GM-CSF, i 24 timer. Etterord, ble TNF-α lagt i 48 timer for DCs modning. IL-10-produksjon av DC ble deretter analysert ved ELISA ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser og standarder (RayBiotech, Inc.). Supernatantene ble tilsatt i duplikat til passende pre-belagte plater. Etter at platene var vasket, ble pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff påvisning tilsatt. Substratet anvendt for fargeutvikling ble tetrametylbenzidin (TMB). Den optiske tetthet ble målt ved 450 nm med en mikroplateleser (Multiskan Ex, Thermo Labsystem). Minste påvisning dose av IL-10 er vanligvis mindre enn 1 pg /ml.
Generering av moncyttavledede dendrittiske celler (DC) og DC Modning
For å generere moncyttavledede DC, human perifere mononukleære blodceller (PBMC), oppnådd fra friske donorer (under informert samtykke) ble isolert ved Fycoll-Paque-gradient sentrifugering (Pharmacia, Uppsala, Sverige) fra buffy coats. CD14 + monocytter ble positivt valgt ved hjelp av anti-CD14 MAb-konjugerte magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotec, Auburn, California, USA). Rensede monocytter ble dyrket ved en tetthet på 10
6 celler /3 ml i 12-brønners plater i 6 dager i RPMI 1640 (Euroclone) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin G, 100 mg /ml streptomycin og rekombinant, human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF, 50 ng /ml) og interleukin-4 (IL-4, 20 ng /ml) (Miltenyi Biotec) for å generere den umodne like (iDC). Cytokiner var etterfylles annenhver dag sammen med 20% frisk medium. For iDC aktivering, human rekombinant TNF-α (20 ng /ml; Miltenyi Biotec) ble tilsatt på dag 6 til 48 timer for å indusere modning DC
Analyse av DC Fenotype ved strømningscytometri
. rensede monocytter ble dyrket i 6 dager med GM-CSF og IL-4, med eller uten 20% (vol /vol) av kondisjonert medium (CM) fra kreftceller ubehandlede eller behandlet med 100 uM sink i 24 timer eller med monoklonalt anti- VEGF antistoff (R 0,001. (B) Semi-kvantitativ RT-PCR-analyser av HIPK2 og COX-2-gen-ekspresjon i celler som stabilt RKO interfererte for HIPK2 funksjon (siHIPK2) eller med ikke-target RNA-interferens (siRNA). 28S ble benyttet som intern kontroll. (C) Representative RT-PCR-analyse av HCT116-celler transfektert med pSuper-HIPK2 (siHIPK2) eller pSuper kontroll (siRNA) vektor i 48 timer. 28S ble benyttet som intern kontroll. (D, venstre panel) Representant RT-PCR analyser av MCF7–indsi /HIPK2 celler behandlet med Dox (DOX +) for 5 dager (for HIPK2 knockdown) og deretter dyrket uten Dox (DOX-) for ytterligere 5 dager (for HIPK2 recovery) . (D, panel høyre) Densitometrisk analyse av HIPK2 og COX-2 nivåer (som i det venstre panelet) ble utført og normaliserte verdier til 28S mRNA nivåer ble plottet. * P = 0,001. (E) totalt celleekstrakter fra RKOsiHIPK2 og kontroll siRNA-celler ble analysert ved hjelp av Western-immunblotting for å vurdere COX-2-proteinnivåer. β-actin ble brukt som protein lasting kontroll.
Diskusjon
omvendt korrelasjon mellom lav HIPK2 og High COX-2 uttrykk nivåer i kreftceller
Resultater og
Å få innsikt i
in vivo
forholdet mellom COX-2 og HIPK2 vi utført en
in-silico
co-uttrykk analyse som sammenligner ulike microarray studier av ulike normale og tumor kolon vev fra Oncomine integrert kreft database forskningsverktøy (https://www.oncomine.org). Analyser av datasett hentet fra prøver av normalt vev og primær tykktarm adenokarsinomer avslørte en invers korrelasjon mellom HIPK2 og COX-2 uttrykk. Dermed HIPK2 uttrykk var høy i normalt vev og betydelig redusert i tykktarm adenokarsinomer, mens COX-2 uttrykk var lav i normalt vev og betydelig økt i tykktarm adenokarsinomer (Fig. 1a). Vi ved siden forsøkt å undersøke om HIPK2 spilt en rolle i COX-2 regulering. Som vist på fig. 1B, økt ble observert COX-2 uttrykk nivåer i RKO tykktarm kreft celler stabilt forstyrret for HIPK2 funksjon (siHIPK2) [29], sammenlignet med kontroll siRNA celler. Lignende invers korrelasjon mellom lav HIPK2 og høye COX-2 nivåer ble funnet i HCT116 tykktarm kreft celler som gjennomgår forbigående HIPK2 utarming av siRNA (Fig. 1C), noe som tyder på en rolle for HIPK2 i COX-2 mRNA uttrykk i kreftceller. For ytterligere å bekrefte dette funnet, tok vi nytte av Dox-induserbare MCF7- brystkreftceller (MCF7indsi /HIPK2), hvor Dox behandling induserer HIPK2 downregulation [30], skaffe hovedsak lignende resultater. Dermed Dox behandling (Dox +) redusert HIPK2 mRNA uttrykk som signifikant korrelert med COX-2 oppregulering, som også gjenspeiles av densitometrisk analyse (Fig. 1 D). Deretter hjemfall av HIPK2 uttømming av Dox fjerning (Dox -), restaurert de COX-2 genuttrykk nivåer på samme måte som de som starter COX-2 nivåer av kontrollceller, som også gjenspeiles av densitometriske analyser (Fig 1D.). Neste, Western immunoblotting viste økt COX-2 proteinnivåer i RKO HIPK2-utarmet celler, sammenlignet med kontroll siRNA celler (Fig. 1E). Disse resultatene viser for første gang, en invers korrelasjon mellom HIPK2 og COX-2 ekspresjon i tykktarmskreftceller som ble intriguingly bekreftet ved undersøkelser av Oncomine datasett av normale og kreft vev, noe som indikerer at dette kan være en typisk signatur kreft. Videre kan virkningen av COX-2 oppregulering i brystkreftceller følgende HIPK2 hemning også bli tatt i betraktning.
(A) Representative RT-PCR-analyser av kontroll RKO-siRNA og RKO-siHIPK2 celler transfektert med HIF -1α dominant negativ (HIF-1αDN) i 36 timer. COX-2 og VEGF mRNA nivåer vises. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. (B) RT-PCR analyser av RKO-siHIPK2 celler ble transfektert med spesifikke siRNA for HIF-1α knockdown eller kontrollere siRNA. Etter transfeksjon total RNA ble ekstrahert og RT-PCR ble utført for å vurdere HIF-1α, COX-2 og VEGF ekspresjonsnivåene. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. En representant eksperiment av tre uavhengige eksperimenter ble vist. (C, venstre panel) RT-PCR-analyser av RKO-siHIPK2 celler transfektert med VHL ekspresjonsvektor (+) eller med tom vektor (-). Etter transfeksjon total RNA ble ekstrahert og RT-PCR ble utført for å vurdere COX-2 og VEGF ekspresjonsnivåene. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. (C, panel høyre) Densitometrisk analyse av COX-2 og VEGF nivåer (som i det venstre panelet) ble utført og normaliserte verdier p-aktin mRNA nivåer ble plottet. * P = 0,001. (D) 293-celler ble transfektert med HIF-1α ekspresjonsvektor (+) eller med tom vektor (-). Etter transfeksjon total RNA ble ekstrahert og RT-PCR ble utført for å vurdere HIF-1α, COX-2 og VEGF ekspresjonsnivåene. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. En representant eksperiment av tre uavhengige eksperimenter ble vist.
Forbedring av COX-2 uttrykk på HIPK2 Knockdown Cells via HIF-1α
En av de mekanismene som forbedrer COX-2 transkripsjon er gjennom HIF-1 aktivitet [20]. HIPK2 knockdown induserer HIF-1-aktivitet, betraktes som øket VEGF gentranskripsjon og angiogenese, ved derepressing HIF-1α promoter transkripsjon [6]. For å undersøke om HIF-1α er involvert i COX-2 ekspresjon, ble flere genetiske tilnærminger utført. RKO stabilt blandet for HIPK2 funksjon (siHIPK2) var hovedsakelig brukt og transfeksjonseffektiviteten ble overvåket ved bruk av et ko-transfektert GFP vektoren gjennom eksperimentene. For å utforske effekten av HIF-1α på COX-2 gentranskripsjon, vi først gjennomført tap-av-funksjon eksperimenter med en dominant negativ HIF-1α (HIF-1αDN) konstruere uten DNA-binding og trans domene som hemmer HIF-1 aktivitet [32]. RT-PCR-analyse viste at HIF-1αDN ekspresjon betydelig reduserte nivåer av COX-2 i RKO-siHIPK2 celler (Fig. 2A), noe som tyder HIF-1-avhengig transkripsjon COX-2-regulering. Denne effekten ble parallelt med en observert på HIF-1 target-genet VEGF (fig. 2A). Deretter HIF-1α uttømming i RKO-siHIPK2 celler ved spesifikke siRNA forstyrrelser viste at HIF-1α downregulation sterkt hemmet både COX-2 og VEGF genuttrykk (Fig. 2B). Som en ytterligere metode for å hemme HIF-1-aktivitet, har vi overuttrykt von Hippel-Lindau (VHL) protein som har vist seg å inhibere HIF-1-aktivitet ved å målrette HIF-1α for proteasomal degradering [33]. Som vist på fig. 2C, VHL overekspresjon i RKO-siHIPK2 celler indusert effektiv COX-2 samt VEGF downregulation, som dokumentert av densitometrisk analyser. Til slutt, for ytterligere å bekrefte effekten av HIF-1 i COX-2-regulering, transfiserte vi HIF-1α ekspresjonsvektor i 293-celler å observere at det var en betydelig forbedring av både COX-2 og VEGF-mRNA-ekspresjon, sammenlignet med kontrollceller (Fig . 2D). Samlet utgjør disse resultater gir sterke bevis for at COX-2 oppregulering, etter HIPK2-knockdown, avhang, al det minste delvis, av HIF-1-aktivitet som bekreftes av den effekt som observeres på HIF-1- målgenet VEGF.
(A) 293-celler ble transfektert med HIF-1α ekspresjonsvektor (+) eller med tom vektor (-). HIF-1a-transfekterte celler ble behandlet med ZnCl
2 (100 uM). 24 timer etter behandling, ble cellene samlet opp i delt i to for både RNA og proteinanalyser. RT-PCR ble utført for å vurdere COX-2 og VEGF uttrykk nivåer (øvre panel). 28S ble benyttet som intern kontroll. Totale celleekstrakter ble analysert ved Immunoblotting (I.B.) for å vurdere HIF-1α proteinnivåer. L.C. (Lasting kontroll). (B) RKO-siHIPK2-celler ble behandlet med ZnCl
2 (100 uM) i 24 timer. Etter transfeksjon total RNA ble ekstrahert og RT-PCR ble utført for å vurdere COX-2 og VEGF ekspresjonsnivåene. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. En representant eksperiment av tre uavhengige eksperimenter ble vist. (C) Totalt celleekstrakter fra RKOsiHIPK2 ubehandlet eller behandlet med ZnCl
2 (100 uM) i 24 timer ble analysert ved hjelp av Western-immunblotting for å vurdere COX-2-proteinnivåer. β-actin ble brukt som protein lasting kontroll.
Sink nedregulerer COX-2 uttrykk nivåer i HIPK2 utarmet Cells
Vi har tidligere vist at sinkioner tilskudd i konstitutivt hypoksiske prostatakreftceller eller i angiogene glioblastom celler nedregulerer HIF-1α uttrykk dermed hemme HIF-1 aktivitet [8]. Dette funnet var neste bygges av et genom-wide analyser der sink faktisk motvirker genuttrykk profiler indusert av hypoksi-aktivert HIF-1 [34]. Her vi først overexpressed HIF-1α i 293 celler og analysert mRNA nivåer av semikvantitativ RT-PCR før og etter sink behandling. Som vist på fig. 3A, HIF-1-indusert COX-2 og VEGF-genekspresjon ble effektivt inhibert av sink behandling. Den HIF-1α overekspresjon og dens nedregulering på sink behandlinger, som tidligere rapportert [8], ble vist ved Western immunoblotting (I.B.) (Fig. 3A, nedre panel). Deretter, sink behandling av RKO-siHIPK2 celler viste signifikant reduksjon av både COX-2 og VEGF mRNA gen-ekspresjon ved RT-PCR-analyse (Fig. 3B). Følgelig bekreftet Western immunoblotting COX-2 nedregulering in HIPK2 ferdigproduserte celler etter sinkbehandlingen (fig. 3C). Av notatet, gjorde i våre hender sink behandling (100 mikrometer for 24 h) ikke påvirke cellenes levedyktighet (data ikke vist). Fordi COX-2 er ofte oppregulert i tumorer fører til tumor aggressivitet og dårlig prognose [14], målretting COX-2 kan være en viktig prestasjon i kreftterapi. Dermed har COX-2-hemmere vist potente antitumor effekter i flere forskjellige dyremodeller av kolorektal kreft; i avtalen, sletting av COX-2 genet fører til en markert nedgang på adenom byrde i både små og store tarmen i
Apc
Δ716
mutante mus og i
Apc
min
mus [35]. Likevel selektive COX-2-hemmere ble vist seg å være svært effektive i å forebygge polypp tilbakefall, kan de tilhørende kardiovaskulære bivirkninger ved disse stoffene påvirker egnede randomiserte kliniske studier [36], [37]. Derfor er det obligatorisk å utvikle nye tilnærmingsmåter for å målrette COX-2-funksjonen. I denne forbindelse, kan bruk av sink i downregulating HIF-1-indusert COX-2 ekspresjon representerer et interessant utgangspunkt for å overvinne de skadelige virkninger av i det minste noen spesifikke COX-2-inhibitorer; dessuten ved å handle på HIF-1 aktivitet sink kan påvirke flere sammenkoblede signalveier. Til slutt, enten sink kan hemme COX-2 også uavhengig av HIF-1 må belyses ytterligere.
(A) PGE
2 produksjon ble analysert ved ELISA i RKO-siRNA kontrollceller forblir ubehandlet og i HIPK2 uttømte celler (siHIPK2) før og etter ZnCl
2-behandling (100 uM i 24 timer) og etter behandling med COX-2 spesifikk inhibitor NS-398 (50 nM) i 24 timer. PGE
2 produksjon ble plottet som pg /10
6 celler. Kolonner, mener to uavhengige eksperimenter utført i to eksemplarer, ± S.D. * P 0,001. (B) Totalt celle ekstrakter fra RKO-siRNA kontrollceller forblir ubehandlet og HIPK2 utarmet celler (siHIPK2) før og etter ZnCl
2 behandling (100 mikrometer i 24 timer) ble analysert ved Western immunoblotting å vurdere COX-2, β- catenin, og cyclin D1 proteinnivåer. β-aktin ble benyttet som protein lasting kontroll. (C) VEGF produksjon ble analysert ved hjelp av ELISA i RKO-siRNA kontrollcellene og i HIPK2 utarmet celler (siHIPK2) før og etter ZnCl
2-behandling (100 uM i 24 timer). VEGF produksjon ble plottet som pg /10
6 celler. Kolonner, mener to uavhengige eksperimenter utført i to eksemplarer, ± S.D. * P. 0,001
Sink hemmer PGE
2 signalveier i HIPK2 fattige celler
Etter å ha fastslått at sink kan nedregulere COX-2 nivåer i HIPK2 utarmet celler, vi neste søkt å evaluere PGE
2 modulering. ELISA-analyse viste at den aktuelle mengden av PGE
2 fremstilt ved HIPK2 utarmet sammenlignet med kontroll-celler, som tidligere rapportert [10], ble betydelig inhibert av sinktilskudd (fig. 4A). Interessant, sink-indusert PGE
2 hemning var så effektiv som den spesifikke COX-2-inhibitor NS-398 (fig. 4A). I avtalen, viste vestlig immunoblotting sterk reduksjon av COX-2 protein nivåer etter sink behandling (Fig. 4B), som rapportert ovenfor. Videre er den forbedrede nivåer av β-catenin og av dens target cyklin D1 i HIPK2 utarmet-celler, som tidligere rapportert [3], [4], ble betydelig hemmet av sink-behandling (fig. 4B), som parallelt ovenstående PGE
2 hemming. Dette er en interessant sammenheng, fordi PGE
2 har blitt vist å aktivere β-catenin som transkripsjonsfaktor til å indusere ekspresjon av flere gener, inkludert COX-2 og cyclin D1, genererer en positiv auto løkke som favoriserer tumorprogresjon [12 ], [38].
(A) Lys-mikroskopi viser kontroll differensiert DC (Mock, panel 1) og hemming av differensiert DC morfologi i nærvær av CM of siRNA kontroll (panel 2) eller HIPK2 utarmet celler ( siHIPK2) (panel 3); denne inhibering fant ikke sted bare hvis DC hvor dyrket i nærvær av CM sinkbehandlede siHIPK2-CM (panel 5) sammenlignet med CM sinkbehandlede siRNA kontrollceller (felt 4). En representant eksperiment av tre uavhengige eksperimenter ble vist. Mikro forstørrelse, 10 ×. (B) Analyse av overflate DC modning markører, CD80 og CD86, ved hjelp av flowcytometri. DC Mock: kontrollere modne DC; DC + siRNA-CM: DC modning i nærvær av CM of siRNA kontrollceller; Som vist på fig. Som vist på fig.
