Abstract
Bakgrunn
multiresistens (MDR) i magekreft er fortsatt en stor utfordring for klinisk behandling. Aktivering transkripsjonsfaktor 4 (ATF4) er en stressrespons gen som er involvert i homeostase og cellulær beskyttelse. Men fortsatt er uttrykk og funksjon ATF4 i magekreft MDR ukjent. I denne studien undersøker vi om ATF4 spille en rolle i magekreft MDR og dets potensielle mekanismer.
Metodikk /hovedfunnene
Vi viste at ATF4 overekspresjon confered MDR fenotypen til magekreftceller, mens knockdown av ATF4 i MDR-varianter indusert re-allergi. I denne studien viste vi også at NAD
+ – avhengig histondeacetylase SIRT1 var nødvendig for ATF4-indusert MDR effekt i mage kreftceller. Vi demonstrerte at ATF4 lettes MDR i magecancerceller ved direkte binding til SIRT1 promoter, noe som resulterer i SIRT1 opp-regulering. Betydelig, inhibering av
SIRT1
av liten interfererende RNA (siRNA), eller en spesifikk inhibitor (EX-527) gjeninnføres terapeutisk følsomhet. Også ble økt BCL-2 /Bax forhold og MDR1 uttrykk nivået funnet i ATF4-overekspresjon celler.
Konklusjon /Betydning
Vi viste at ATF4 hadde en sentral rolle i reguleringen av MDR i mage kreftceller i respons på kjemoterapi og disse funnene tyder på at målretting ATF4 kunne avlaste terapeutisk motstand i magekreft
Citation. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et al. (2012) Aktivere transkripsjonsfaktor 4 ensidige multiresistens Phenotype til magekreft celler gjennom trans av SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10,1371 /journal.pone.0031431
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 05.09.2011; Godkjent: 08.01.2012; Publisert: 17 februar 2012
Copyright: © 2012 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av samlede tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (NO.81090270, NO.81090273, og NO.81000864), den kinesiske Postdoktor Science Foundation (NO.20100471776), National Key og Basic Research Development Program of China ( NO. 2010CB529302), og National Science and Technology Project (2009ZX09103-667 og 2009ZX09301-009-RC06). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
multiresistens er vanligvis den viktigste årsaken til svikt av kjemoterapi mot ondartede tumorer, inkludert magekreft [1] sikret sikt multimedikamentresistens er klassisk brukes til å definere en motstand fenotype hvor cellene blir resistente samtidig til forskjellige stoffer uten åpenbare strukturelle likhet og med forskjellige cellulære mål [2]. MDR skjer oftere med nye legemidler som har større betydning effektivitet etter sin første søknad i behandling av kreft. Den kliniske nytten av flere legemidler er begrenset av både naturlig og ervervet tumorcellemotstand, noe som nesten alltid er multifaktoriell i naturen [3]. Faktorene som kan påvirke stoffet følsomhet inkluderer: akselerert legemiddelutstrømningen, narkotika aktivering og inaktivering, endringer i narkotika målet, metylering DNA, behandling av narkotikainduserte skader, og unndragelse av apoptose [4]
Magekreft. er forholdsvis ufølsom for kjemoterapeutika. MDR mekanismer i magekreftcellene har vært bredt undersøkt i vårt laboratorium og andre steder [1], [4], [5], men de har ikke vært fullt klarlagt, noe som indikerer at andre ukjente molekyler eller trasé kan være involvert i utviklingen av MDR.
i pattedyrceller, eukaryote oversettelse initiering faktor to α-subenheten (eIF2α) blir fosforylert av ulike eIF2α kinaser som respons på ulike stress signaler, inkludert anoksi /hypoksi, endoplasmatisk retikulum stress, aminosyre deprivasjon, og oksidativt understreke. Dette fosforylering hendelsen fører til en rask reduksjon i global proteinsyntese samtidig med induksjon av translasjonsforskning uttrykket av gener, inkludert
ATF4 Hotell som funksjon å lindre celleskader fra stress [6], [7]. Selv ATF4 kan spille en pro-apoptotiske rolle under forhold med alvorlig eller langvarig stress,
ATF4
er en potent stress responsive genet tenkt å spille en beskyttende rolle ved å regulere mobilnettet tilpasning til uheldige omstendigheter i den integrerte stressrespons ( ISR) [8], [9], [10]. Nylig har overekspresjon av ATF4 ble rapportert å være fremtredende i et bredt spekter av tumorer og for å beskytte tumorceller mot flere belastninger, samt en rekke av kreft terapeutiske midler [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. De potensielle mekanismer som er ansvarlige for denne beskyttelsen omfatter autophagy induksjon, fremming av DNA-skade reparasjon, og opp-regulering av intracellulær glutation [12], [13], [14], [17]. Men fortsatt ukjent uttrykk og funksjon ATF4 i magekreft MDR.
I denne studien, rapporterte vi at ATF4 var signifikant oppregulert i MDR respons av magekreftceller sammenlignet med foreldrekontrollceller. Knockdown av
ATF4
av siRNA betydelig lysfølsomt celler med MDR til en rekke kjemoterapeutika, mens oppregulering av ATF4 i SGC7901 og AGS celler gjort dem multidrug resistente. Vi viste også at ATF4 fremmet magekreft MDR dels gjennom opp-regulerer uttrykket av SIRT1. Og SIRT1 hemming kan delvis reversere magekreft MDR fenotype mediert av ATF4. Disse dataene antyder at målretting ATF4 kan gi en roman terapeutisk alternativ for reversering klinisk magekreft MDR.
Resultater
ATF4 modulerer MDR fenotypen av magekreftceller
For å avgjøre om ATF4 er involvert i utviklingen av MDR i magekreftceller, ble ATF4 nivåer oppdaget av Western blot og qPCR i SGC7901 cellelinje og dens MDR-varianter, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR. Både protein og mRNA-nivåer av ATF4 var mye høyere i de resistente cellelinjer enn i parentale celler (fig. 1A).
(A) Et protein og mRNA-nivåer av ATF4 i MDR magecancerceller (SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR) og foreldre SGC7901 celler ble undersøkt ved Western blotting og qPCR. β-aktin og GAPDH ble benyttet som intern kontroll, respektivt. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. (B) Responsen av LV-vektor og LV-ATF4 stabilt transfektert SGC7901 og AGS til cisplatin ble testet ved kolonidannelsesbestemmelsen. Cellelinjer ble behandlet fortløpende med enten 0 eller 0,25 pg /ml cisplatin for 14 d; media ble skiftet hver 3 d. Celler ble sådd ut i triplikat, og forsøket ble gjentatt tre ganger. vises representative brønner. Grafer gi gjennomsnittlig kvantifisering som en prosent av de ubehandlede cellene. (C) LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transfektert SGC7901 /ADR og SGC7901 /VHS-celler ble behandlet kontinuerlig med enten 0 eller 0,5 mikrogram /ml cisplatin for 14 d; media ble skiftet hver 3 d. (D) og (E) LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterte SGC7901 cellelinjer og LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transfektert SGC7901 /ADR-celler ble behandlet med angitte doser av forskjellige stoffer i 72 timer.
In vitro-medikamentsensitivitet
ble testet ved MTT-analyse. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. (F) og (G) LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterte SGC7901 cellelinjer, LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transfektert SGC7901 /ADR-celler og deres respektive ubehandlede motparter (NC) ble dyrket i friskt medium i nærvær av cisplatin ved de angitte konsentrasjoner (for SGC7901-NC, SGC7901-vektor, og SGC7901-ATF4, 5 ug /ml, for SGC7901 /ADR-NC, SGC7901 /ADR-SCR, og SGC7901 /ADR-siATF4, 10 ug /ml) i 36 timer. Deretter Hoechst 33258 nukleær farging og DNA-fragmentering-analyse ble utført. (H) SGC7901 og SGC7901 /ADR stabile transfekterte cellelinjer som ovenfor ble inkubert i ytterligere 6-24 timer i friskt medium med indikerte konsentrasjoner av cisplatin (for SGC7901-vektor og SGC7901-ATF4, 10 ug /ml, for SGC7901 /ADR SCR og SGC7901 /ADR-siATF4, 20 ug /ml). På det tidspunktet er angitt, ble proteinekstrakter samlet og underkastet immunoblotanalyse for caspase-3 (uspaltede og spaltet former). β-actin ble brukt som en intern kontroll.
For å undersøke om ATF4 overekspresjon er tilstrekkelig til å indusere en MDR fenotype i magekreftceller,
ATF4
uttrykk cDNA ble stabilt transfektert inn SGC7901 og AGS celler. Først ble CDDP følsomhet testet under anvendelse av en kolonidannelsesbestemmelsen. Som vist ved kvantifisering av den kolonidannelsesbestemmelsen, ATF4 overekspresjon resulterte i en nesten 3-gangers økning i kolonitall, sammenlignet med tom vektor-uttrykkende celler (Fig. 1B). MTT-analyser indikerte også at IC
50 verdier av SGC7901-ATF4 for ADR, VCR, CDDP, og 5-FU ble signifikant økt sammenlignet med tom vektor transfekterte celler (fig. 1D).
ATF4 nivåer er forhøyet i MDR magekreftceller, vi videre ønsket å finne ut om målretting ATF4 kunne re-sensitiv MDR cellelinjer. Knockdown av
ATF4
av siRNA i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VHS-celler førte til en 2- til 3-fold reduksjon i celle nummer når de brukes i kombinasjon med CDDP (Fig. 1C). Dataene i fig. 1E tyder også på at nedregulering av
ATF4
vesentlig reverserer resistensen av SGC7901 /ADR-celler som respons på kjemoterapi.
Som hemming av apoptose er en av viktige mekanismer for MDR, vi også undersøkt kapasiteten av de SGC7901 /ADR-celler transfektert med den spesifikke
ATF4
siRNA å gjennomgå CDDP-indusert apoptose av Hoechst fargings og DNA-fragmentering analyser. Behandling av SGC7901-ATF4 og SGC7901 /ADR-SCR-celler med de indikerte konsentrasjoner av CDDP i 36 timer fremkalte ikke noen apoptose, som vurdert av Hoechst nukleær farging (fig. 1F) og DNA-fragmentering analyser (fig. 1G). I kontrast, SGC7901-Vector og SGC7901 /ADR-siATF4 celler vises betydelig apoptose, med hyppigere utseende av kondensert og fragmenterte kjerner og DNA ladder formasjon. Dessuten ble mer tydelig spaltning av procaspase-3 observeres etter behandling med CDDP i SGC7901-vektor og SGC7901 /ADR-siATF4 celler sammenlignet med SGC7901-ATF4 og SGC7901 /ADR-SCR-celler, henholdsvis (fig. 1 H).
Tatt sammen indikerer disse resultatene at ATF4 overfører en MDR-fenotype overfor magekreftceller og som målretting ATF4 tilveiebringer en fremgangsmåte for sensibiliserende-resistente celler overfor kjemiske behandlinger.
ATF4 opp-regulerer ekspresjonen av SIRT1, MDR1 , Bcl-2, og Bax i magekreftceller
Tidligere studier har rapportert at celler som overuttrykker SIRT1 vises redusert følsomhet overfor kjemoterapi ved flere mekanismer, [18], [19], [20], [21]. Vi var glad for å bestemme hvorvidt
SIRT1
, som er en stress-relatert gen kritisk for MDR utvikling, kan være nedstrøms mål for ATF4 ansvarlig for medier ATF4-indusert MDR i magekreftceller.
SIRT1 nivåer i LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterte SGC7901 celler ble analysert ved qPCR og Western blot. Overekspresjon av ATF4 var assosiert med økt SIRT1 uttrykk både transkripsjons (Fig. 2A, til venstre) og translasjonsforskning nivåer (Fig. 2B, venstre). I kontrast, siRNA knockdown av
ATF4
i SGC7901 /ADR celler resulterte i en betydelig reduksjon av endogen
SIRT1
uttrykk (Fig. 2A og 2B, høyre). Disse resultatene tyder på at ATF4 opp-regulerer
SIRT1
uttrykk i magekreftceller.
(A) mRNA nivåer av SIRT1 i LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterte SGC7901 cellelinjer (til venstre) og LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transfektert SGC7901 /ADR celler (til høyre) ble utsatt for qPCR. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. (B) Cellelysater fra celler i seksjon A og deres respektive ubehandlede kolleger (NC) ble utslettet med de angitte antistoffer. β-actin ble brukt som en intern kontroll.
For ytterligere å undersøke de molekylære mekanismene som er involvert i ATF4 relaterte MDR av magekreft, vi også undersøkt MDR1, MRP, BCL-2, og Bax uttrykk nivåer i mage kreftceller brukes ovenfor. Som vist på fig. 2B, ATF4-dyktig celler uttrykt mer MDR1 i forhold til kontrollcellene. I mellomtiden var det ingen åpenbar forskjell i MRP-ekspresjon funnet i noen av disse cellelinjene. Det er interessant både Bcl-2 og Bax ekspresjonsnivåene var oppregulert i ATF4-dyktig celler, sammenlignet med kontrollcellelinjer, mens ekspresjonen av Bax viste bare små forandringer, som indikerer at en opp-regulering av Bcl-2 i Bax forholdet kan undertrykke medikamentindusert apoptose i ATF4-overekspresjon mage kreftceller.
Disse resultatene indikerer at ATF4 fremmer MDR evne mage kreftceller gjennom flere mekanismer.
ATF4 transaktiverer SIRT1 promoter aktivitet og direkte binder seg til SIRT1 arrangøren
for å avgjøre om ATF4 medierer
SIRT1
gentranskripsjon, 293T celler ble ko-transfektert med 1,2 kb
SIRT1
promoter reporter plasmid og
ATF4
uttrykk plasmid. Luciferase reporter-analysen viste at
SIRT1
promoter-aktivitet ble markert aktivert ved ATF4 på en doseavhengig måte (fig. 3A).
(A) 293T-celler ble ko-transfektert med 1.2 kb
SIRT1
promoter reporter plasmid og
ATF4
uttrykk plasmid. Etter 48 timer ble luciferase reporter analysen brukes til å oppdage
SIRT1
promoter aktivitet. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. (B) En skjematisk fremstilling av det humane SIRT1 genpromoteren som viser RT-PCR-primerne posisjoner for chip analyse. (C) ChIP analysen ble brukt til å påvise den direkte binding av ATF4 til
SIRT1
promoter. SGC7901-ATF4 celler ble behandlet for brikken ved hjelp av anti-ATF4 antistoff. A1 representerer den antatte distal bindingssetet og A2 representerer den antatte proksimale bindingssetet. De bilsportforbund promoter-primere ble anvendt som en positiv kontroll, og GAPDH-primere ble anvendt som en negativ kontroll.
I et forsøk på å oppnå spesifikke innsikt i mekanismen for
SIRT1
induksjon, vi undersøkt mulige induksjons trasé fra ATF4. Ved å analysere 5′-flankerende sekvens av
SIRT1
gen med bioinformatikk programvare (Tfsitescan service, TESS, og Genomatix), to ATF4 mulige bindingsseter ble identifisert innen -950 til -600 bp region av
SIRT1
promoter (fig. 3B).
for å finne ut om
SIRT1
er et direkte mål for ATF4 Chip med ATF4 antistoff ved hjelp SGC7901-ATF4 celler viste berikelse av både bindingssteder innenfor
SIRT1
promoter-regionen, noe som indikerer at RNA og påfølgende protein nivået øker fra
SIRT1
i ATF4-uttrykke cellelinjer er trolig på grunn av en direkte interaksjon av ATF4 med
SIRT1
genet promoter (fig. 3C).
for å undersøke hvilken rolle de to ATF4 bindingsseter i å regulere SIRT1 trans, ble seterettet mutagenese brukes til å mutere disse områdene. Luciferase reporter analysen viste at enten muterende bindingsstedet en eller bindende for 2. redusert SIRT1 promoter aktivitet indusert av ATF4. Videre mutasjon av begge bindingssteder avskaffet SIRT1 promoter aktivitet. Disse resultatene antydet at både ATF4 bindingssteder er involvert i trans av SIRT1 promoter (fig. S1).
Samlet utgjør disse resultatene indikerer at SIRT1 er en direkte transcriptional mål av ATF4.
SIRT1
hemming av siRNA delvis reverserer MDR fenotype av ATF4-overekspresjon mage kreftceller
Identifiseringen av ATF4-mediert
SIRT1
uttrykk nivå øker i mage kreftceller, blir bedt om å analysere rollen til denne reaksjonsveien i magekreft MDR. For å løse dette, sammenlignet vi
in vitro
narkotika følsomhet i ATF4 stabilt transfektert magekreftceller etter transfeksjon av
SIRT1
siRNA eller egge siRNA av kolonidannelse og MTT analyser. Knockdown av
SIRT1
av siRNA i SGC7901-ATF4 celler førte til en 40% reduksjon i kolonien nummer når de brukes i kombinasjon med CDDP (Fig. 4A, øvre). Denne effekten ble også observert i AGS-ATF4 celler (fig. 4A, lavere). Videre data fra MTT-analysen viste også at knockdown av
SIRT1
kunne re-bevisst SGC7901-ATF4 celler til kjemiske stoffer, men dette skjedde ikke i egge siRNA transfekterte celler (Fig. 4B).
(A) SGC7901-ATF4 og AGS-ATF4 celler ble transfektert med egge siRNA (SCR) eller SIRT1 siRNA (siSIRT1). Syttito timer senere, cellelinjer ble behandlet fortløpende med enten 0 eller 0,25 pg /ml cisplatin for 14 d; media ble skiftet hver 3 d. Celler ble sådd ut i triplikat, og forsøket ble gjentatt tre ganger. vises representative brønner. Grafer gi gjennomsnittlig kvantifisering som en prosent av de ubehandlede cellene. Inset, relativ SIRT1 protein uttrykk ved Western blot. (B) SGC7901-ATF4 celler ble transfektert med egge siRNA (SCR) eller SIRT1 siRNA (siSIRT1). Syttito timer senere, begge cellelinjer ble behandlet med de angitte doser av forskjellige stoffer for ytterligere 72 timer.
In vitro-medikamentsensitivitet
ble testet ved MTT-analyse. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
For å avgjøre om SIRT1 beskytter cellene fra CDDP-indusert apoptose, SGC7901-ATF4 celler transfektert med
SIRT1
siRNA eller egge siRNA ble behandlet med CDDP og merket med Annexin V og PI. Den apoptotiske celler ble identifisert ved Annexin V merking. Den apoptotiske prosentandel av SIRT1 siRNA transfektert SGC7901-ATF4 celler var signifikant høyere enn den til kontrollcellene (fig. 5A, 72,8% vs. 25,9%). Utseendet til kondenserte og fragmenterte kjerner ble også økt i SIRT1 siRNA transfekterte celler sammenlignet med (Fig. 5B) kontrollcellene. Videre er spaltingen av procaspase-3 ble observert så tidlig som 12 timer etter behandling med 10 ug /ml CDDP i SIRT1 siRNA transfekterte SGC7901-ATF4 celler, men ikke i egge siRNA behandlede celler, selv etter 24 timer med CDDP behandling (Fig. 5C ). Disse resultatene tyder på at SIRT1 overekspresjon undertrykker CDDP-indusert apoptose.
(A) SGC7901-ATF4-celler ble transfektert med egge siRNA (SCR) eller SIRT1 siRNA (siSIRT1). Syttito timer senere ble cellene inkubert i ytterligere 36 timer i friskt medium i fravær eller nærvær av cisplatin ved 5 ug /ml. Etter behandling, ble cellene merket med Annexin V og PI. Fordelingen mønster av levende og apoptotiske celler ble bestemt ved FACS-analyse. (B) SGC7901-ATF4-celler ble transfektert ved den samme måte i seksjon A, og deretter behandlet med 5 pg /ml cisplatin i 36 timer. Deretter Hoechst 33258 nukleær farging ble gjennomført for å påvise apoptotiske celler. (C) SGC7901-ATF4-celler ble transfektert ved den samme måte i avsnitt A og ble inkubert i ytterligere 6-24 timer i friskt medium med 10 pg /ml cisplatin. På det tidspunktet er angitt, ble proteinekstrakter samlet og underkastet immunoblotanalyse for caspase-3 (uspaltede og spaltet former). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (D) SGC7901-ATF4-celler ble transfektert ved den samme måte i avsnitt A. syttito timer senere, ble cellelysater blottet med de angitte antistoffer. β-actin ble brukt som en intern kontroll.
For å studere effekten av nedregulering av SIRT1 av siRNA på MDR forbundet molekyler, vi undersøkt MDR1, MRP, BCL-2, og Bax uttrykk nivåer i SGC7901-ATF4 celler etter transfeksjon med SIRT1 siRNA eller egge siRNA. Nedregulering av MDR1 ble observert i SIRT1 siRNA-behandlede celler (fig. 5D) sammenlignet med kontrollcellene. Derimot ble ingen åpenbar forskjell fra MRP, Bcl-2, og Bax uttrykk nivåer funnet mellom prøvene.
Disse observasjonene indikerer at SIRT1 formidler ATF4-indusert MDR effekt i mage kreftceller.
Hemming av SIRT1 aktivitet re-sensitizes ATF4 transfekterte celler til DNA-skadende midler
for å dokumentere at SIRT1 katalytisk aktivitet er også ansvarlig for ATF4-indusert MDR, SGC7901-ATF4 celler ble forbehandlet med EX-527 en roman, potent og spesifikk små-molekyl-inhibitor av SIRT1, og etterfulgt av behandling med forskjellige kjemiske stoffer. Først fant vi ut basal cytotoksisitet av EX-527 i LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterte SGC7901 celler. MTT-analysen viste at EX-527 ved konsentrasjoner opp til 10 uM inhiberte ikke, men heller noe økt, levedyktigheten til begge cellelinjer (Fig. 6A). Deretter undersøkte vi SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2, og Bax uttrykk nivåer etter 24 timers inkubasjon med eller uten de angitte doser av EX-527 i mage kreftcellene brukes ovenfor. Bare ekspresjon av MDR1 ble nedregulert ved EX-527 på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 6B). Deretter preinkubert vi SGC7901-ATF4 celler med kjøretøy eller EX-527 (0,5, 1, 2, 4, og 10 uM) i 24 timer, og deretter CDDP- og 5-FU-mediert celledød ble overvåket. Som vist på fig. 6C, EX-527 betydelig forbedret cytotoksisiteten av begge medikamenter på en dose-avhengig måte. Vi har også bestemt det mulig synergistisk effekt av EX-527 på forskjellige doser av CDDP- og 5-FU-mediert inhibering av celleproliferasjon i SGC7901-ATF4 celler. Som forventet, er 10 uM EX-527 er tilstrekkelig til å potensere cytotoksisiteten av begge medikamenter (fig. 6D).
(A) LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfektert SGC7901 cellelinjer ble inkubert med eller uten angitte doser av EX-527. Ninety-seks timer senere, ble celle viabilities bestemt ved MTT-analyse. (B) stabilt transfekterte SGC7901 cellelinjer i del A, ble inkubert med eller uten EX-527 (1-10 uM) i 24 timer, og de totale cellelysatene ble underkastet immunblotting med de angitte antistoffer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (C) SGC7901-ATF4 celler ble preinkubert med de angitte doser av EX-527 i 24 timer. Deretter SGC7901-vektor og SGC7901-ATF4 celler ble utsatt for cisplatin (1 pg /ml) eller 5-fluoruracil (1,25 ug /ml) i ytterligere 72 timer. Celle viabilities ble bestemt ved MTT-analyse. (D) SGC7901-ATF4 celler ble preinkubert med eller uten EX-527 (10 uM) i 24 timer. Deretter ble cellene eksponert for de angitte doser av cisplatin eller 5-fluoruracil for ytterligere 72 timer. Celle viabilities ble bestemt ved MTT-analyse. Alle data representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. Grafer gi gjennomsnittlig kvantifisering som en prosentandel av de ubehandlede celler.
Disse resultatene tyder på at SIRT1 aktivitet spiller også en avgjørende rolle i ATF4-indusert magekreft MDR og denne rollen kan være mediert delvis gjennom MDR1 uttrykk .
Diskusjoner
MDR byr på betydelige kliniske utfordringer til effektiv kjemoterapi av mange menneskelige kreftformer. Mekanismer som cellene utvikler resistens er flere og sammensatte, så mer omfattende forståelse av dem, samt identifisering av nye mekanismer for chemoresistance vil være spesielt nyttig i å gi bedre behandlingsalternativer. Denne studien er den første rapporten at høye nivåer av ATF4, ofte sett i tumorceller under stressende omstendigheter, overfører magekreftceller med en MDR fenotype, og den identifiserer at denne effekten er mediert delvis ved trans av SIRT1 uttrykk.
ATF4 Hotell og
SIRT1
er evolusjonært konserverte stressrespons gener involvert i et bredt spekter av biologiske prosesser, hvorav mange er helsebringende for homeostase og cellulær beskyttelse [22], [23], [ ,,,0],24]. Begge disse genene er indusert som reaksjon på en rekke forskjellige spenninger, blant oksygenmangel (hypoksi /anoksi), oksidativt stress, skade DNA, næringsmangel, og chemotoxic stress. Levenson VV
et al.
Først rapportert at endringer i ekspresjon av ATF4 kan spille en rolle i den pleiotropisk motstand mot forskjellige klasser av DNA-målsøkende medikamenter [16]. I de senere år har flere studier funnet at ATF4 var involvert direkte eller indirekte i utvikling av medikamentresistens gjennom autophagy, glutation-avhengige redoks-system, og DNA-skade reparasjon [11], [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Her viser vi at den beskyttende evne ATF4 faktisk formidler en MDR fenotype i ATF4-overekspresjon mage kreft cellelinjer som respons på kjemoterapi. Våre funn viser klart at overekspresjon av ATF4 i magekreftceller var assosiert med mer motstand, mens knockdown av ATF4 indusert re-allergi. Disse data tyder på at ATF4 er sannsynligvis en viktig mediator nedstrøms av resistens forårsaket av flere mekanismer, og er derfor en verdifull terapeutisk mål. Likevel, som en av de viktigste mediatorer av transkripsjonelle ISR som aktiverer en rekke målgener som fremmer restaurering av homeostase, ATF4 kan også mediere motstand ved andre mekanismer. I vår studie ble SIRT1 funnet å være oppregulert i ATF4-overekspresjon celler sammenlignet med vektor transfekterte celler. I motsetning til dette, knockdown av
ATF4
med ATF4 spesifikk siRNA førte til en nedregulering av SIRT1 i MDR magekreftceller. Våre resultater tyder på at SIRT1 kan være en nedstrøms formidler av ATF4-indusert magekreft MDR.
Som et medlem av ATF familien av grunn-regionen leucine zipper (bzip) transkripsjonsfaktorer [22], har ATF4 den potensiale til å virke som enten en transkripsjonen aktivator eller en transkripsjonen repressor via ATF eller cAMP-responsive element (CRE) bindingsseter [22]. Konsensus bindingssete for ATF ble definert som TGACGT (C /A) (G /A) [27], som er en sekvens identisk til den CRE konsensus elementet (TGACGTCA) [28]. Også den sterkt konservert kjernemotivet – ACGT – kan i de fleste Cres [29] binde til forskjellige bzip faktorer, avhengig av de flankerende baser av kjernemotivet [22], [30], [31]. I vår studie to putative ATF-CRE bindingsseter ble funnet i de 1,2 kb
SIRT1
promoter-regionen, og ATF4 direkte aktivert
SIRT1
transkripsjon via binding til begge festeelementer. Men hvordan de to bindingsseter spille sine roller i henhold til detaljerte stresset situasjon er fortsatt ukjent og krever videre undersøkelser.
Pattedyr
SIRT1
er det nærmeste homolog av gjær
SIR2 Hotell og den mest omfattende studert SIRT familiemedlem. Det er sterkt implisert i regulering av cellulære prosesser som bestemmer lang levetid, inkludert anti-apoptose, neuronal beskyttelse, og cellulær begynnende alderdom eller aldring [32]. Nylig har et økende antall studier har innblandet økt ekspresjon av SIRT1 med resistens mot kjemoterapi og ioniserende stråling [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. For eksempel har overekspresjon SIRT1 blitt funnet i legemiddelresistent neuroblastom, osteosarkom, mammary, ovarie, prostata, tykktarm, og lungekreft cellelinjer sammenlignet med sine legemiddelfølsomme motstykker. Alle disse medikament-resistente effekter av SIRT1 kan være på grunn av sin anti-apoptotiske virkning [37], [38] og lyddemping av tumorsuppressorgener [39]. Til slutt, kan vi forutsi at hvis SIRT1 er involvert i ATF4-indusert MDR, bør hemming av SIRT1 påvirke følsomheten av ATF4-overuttrykkende celler som respons på kjemoterapi. Som forventet, kunne både siRNA og farmakologisk hemming av SIRT1 gjenbevisst ATF4-overekspresjon celler til kjemiske stoffer. I tillegg viser våre studie som SIRT1 beskytter cellene mot død dels gjennom en anti-apoptotiske virkning.
Det er blitt rapportert at MDR1 var oppregulert i celler med øket SIRT1 uttrykk [18], [36]. I denne studien har vi også vist at MDR1 er oppregulert i ATF4-overekspresjon celler, og knockdown av SIRT1 med SIRT1 bestemt siRNA eller hemmer dens aktivitet med EX-527 kan føre til nedregulering av MDR1, som er konsistent med et medikament motstandsdyktig rolle ved SIRT1. Imidlertid Bcl-2 /Bax grad, som var oppregulert i ATF4-overuttrykkende celler, ble SIRT1 uavhengig, noe som tyder på at SIRT1 uavhengige mekanismer også spille en rolle i den ATF4-indusert MDR i magekreftceller.
Oppsummert viser vi at ATF4 ensidige MDR fenotype til magekreftceller, og denne effekten er delvis mediert av trans av SIRT1 overekspresjon. Videre er ATF4 et gyldig mål i multiresistent mage svulster, og utvikle effektive hemmere av ATF4 bør tas hensyn til i fremtiden. Disse funnene gir ny innsikt i rollen som ATF4 i å kontrollere SIRT1 uttrykk og i sine stress motstand funksjoner i tumorigenesis og kjemoterapi. Dette er spesielt viktig for klinisk vurdering, som ATF4 kan være oppregulert av oksygenmangel, oksidativt stress, ernæringsmangel og nesten alle de negative stressfaktorer i en svulstens mikromiljø, som kan bli kapret av kreftceller til å unngå spredning hemming og celledød i respons på kjemoterapi. Derfor kan intervensjoner betinget på å forstyrre stressutløst ATF4 uttrykk i kreftceller være effektive i å omgå eller reversere resistens i magekreft.
Materialer og metoder
For detaljerte metoder, se tekst S1 .
Cell kultur og reagenser
den menneskelige adenokarsinom cellelinjer SGC7901 (hentet fra Academy of Military Medical Science, Beijing, Kina) og MDR varianter, SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR (etablert og vedlikeholdes i vårt laboratorium), og AGS (hentet fra cellen bank av Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og penicillin /streptomycin. 293T-celler (også erholdt fra cellen bredden av Chinese Academy of Sciences) ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum. For å opprettholde den MDR-fenotypen, adriamycin (med en sluttkonsentrasjon på 0,5 pg /ml) og vinkristin (med en sluttkonsentrasjon på 1 pg /ml) ble tilsatt til kulturmediet for SGC7901 /ADR og SGC7901 /video-celler, respektivt. EX-527 (Sigma) ble oppløst i DMSO ved de angitte konsentrasjoner. Adriamycin (ADR), vinkristin (VCR), cisplatin (CDDP), og 5-fluorouracil (5-FU) ble oppløst i normalt saltvann ved indikerte konsentrasjoner.
Cell transfeksjon og stabil cellelinjer
Den menneskelige
ATF4
uttrykk plasmid (pCMV5-ATF4) ble vennlig levert av professor Amy S. Lee [25]. Lentiviral vektor som koder for siRNA bestemt til
ATF4
og kontroll siRNA ble samlet inn ved bruk av PLKO.1-TRC (Addgene) og ble betegnet som henholdsvis LV-siATF4 og LV-SCR kontroll. Lentiviral vektor koding menneskelig ATF4 genet ble konstruert i FUW-teto (Addgene), betegnet som LV-ATF4. Den tomme vektor ble anvendt som negativ kontroll, betegnet som LV-vektor. *, P 0,05.
