Abstract
Denne studien undersøkte rollen hypoksi-induserbar faktorer (HIFs) i ondartet fenotype vedlikehold og kanonisk Wnt signalering. Under normoxia, fant vi ut at både HIF-1α og HIF-2α er uttrykt i humane tykktarmskreftceller, men ikke i sine ikke-maligne kolleger. Den stabile knockdown av HIF-1α eller HIF-2α uttrykk induserte negative effekter på den ondartede fenotype av tykktarmskreftceller med laktat produksjon, frekvensen av apoptose, migrasjon, CXCR4-mediert chemotaxis, og tumorigent aktivitet alle blir betydelig påvirket av HIF knockdown og med HIF-1α uttømming øve større effekt. Knockdown av disse to HIF transkripsjoner indusert forskjellige og til og med motsatt effekt på β-catenin transkripsjonen aktivitet i tykktarm kreft celler med ulike genetiske Wnt signalveier. I SW480 celler, gjorde HIF-2α knockdown ikke påvirke β-catenin nivåer, øker transkripsjonen aktivitet av β-catenin ved å fremkalle sitt atom opphopning, mens HIF-1α stanse negativt påvirket stabiliteten og transkripsjonen aktivitet av β-catenin, indusere sin exit fra kjernene og rekruttering til cellemembranen ved E-cadherin. I tillegg, selv om HIF-1α uttømming indusert en reversering av epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), HIF-2α stanse endret uttrykk for stamcellemarkører CD44, Oct4, og CD24 og av differensiering markør CK20 i motsatt retning som HIF-1α stanse. Bemerkelsesverdig, HIF-2α knockdown også forbedret β-catenin transkripsjonen aktivitet i henhold til hypoksi i celler som viste normal Wnt signalering, noe som tyder på at genet modulerer negativt kanoniske Wnt signal i tykktarm kreft celler. Til sammen våre resultater tyder på at HIFs spille motstridende roller i kanonisk Wnt signal og er avgjørende for stemness og malignitet vedlikehold av tykktarmskreftceller
Citation. Santoyo-Ramos P, Likhatcheva M, García-Zepeda EA, Castañeda-Patlán MC, Robles-Flores M (2014) Hypoksi-induserbare Faktorer modulere Stemness og Ondartethet av tykktarmskreft celler ved å spille motsatt rolle i Canonical Wnt signalnettverk. PLoS ONE 9 (11): e112580. doi: 10,1371 /journal.pone.0112580
Redaktør: Gregory M. Kelly, Western University, Canada
mottatt: 02.07.2014; Godkjent: 08.10.2014; Publisert: 14.11.2014
Copyright: © 2014 Santoyo-Ramos et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at for godkjente grunner, noen tilgangsbegrensninger gjelder datagrunnlaget funnene. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM IN226111 og IN215514) og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT CB2011-151731). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Wnt signal har blitt godt karakterisert som en av de viktigste bidragsyterne til tumorigenesis i mange typer solide tumorer. Avvikende kanoniske Wnt signal er kjent for å bidra til tidlig progresjon i de fleste kolorektal kreft. Faktisk har en stor mengde eksperimentelle bevis vist at mutasjoner i adenomatøs polypose coli (APC) genet fungerer som portvakter i den molekylære patogenesen av flertallet av sporadiske og arvelige former for tykktarmskreft [1], [2]. Wnt veien har også vist seg å spille en viktig rolle i utvikling og regulering av voksen stilk cellesystemer, og kanonisk Wnt signal støtter dannelse og vedlikehold av både stilk og kreft stamceller (CSC) [3].
kanonisk Wnt signal opererer gjennom regulering av fosforylering og nedbrytning av transkripsjon ko-aktivator β-catenin. Uten stimulering av Wnt, er β-catenin sammen til den såkalte ødeleggelse kompleks, der APC spiller en sentral rolle, og dette komplekset inkluderer også Axin, GSK-3β og Kasein kinase 1. Dette komplekset dirigerer en serie av fosforylering hendelser i P-catenin som gjør det til et mål for ubiquitinering og påfølgende proteolyse via proteasome [4]. Stimulering av Wnt fører til hemming av β-catenin sammenbrudd, slik at β-catenin å akkumulere, inn i kjernen, og aktivere Wnt målgener som
cyclin D1 Hotell og
C-MYC
proto -oncogenes, som fremmer inntrengning av cellen inn i S-fasen av cellesyklusen [5].
Tumor hypoksi og de kritiske mediatorer av den cellulære oksygen signalveien, nemlig hypoksi-induserbar faktorer (HIFs) , er kjent for å regulere flere trinn av tumordannelse og er vanligvis forbundet med endringer i stoffskiftet, neovakularisering, invasjon, metastaser, legemiddelresistens, og til slutt fattige kliniske resultater [6]. HIFs er heterodimere transkripsjonsfaktorer som består av HIF-α og HIF-β (eller ARNT) som uttrykkes konstitutivt ved transkripsjonelle og translasjonelle nivåer. HIF-1α og HIF-2α (også kjent som EPAS1) er de to mest studerte medlemmer av HIF-α familien. Under normoksisk forhold, er HIF-a subenheter hydroksylerte på viktige prolinresidier, som tillater dem å bli gjenkjent av von Hippel-Lindau (pVHL) tumor suppressor, underlaget anerkjennelse del av en E3 ubiquitin ligase kompleks som er rettet mot HIF-α for proteasomal degradering. Hypoksisk signale stabiliserer HIF-α ved å hemme prolyl hydroksylering, og i sin tur ubiquitin proteasomal degradering, noe som gjør HIF-α i stand til dimerisering med ARNT, binding til hypoksi-responsive DNA element, og rekruttere transkripsjonen coactivator P300 /CBP for transkripsjonen aktivering av en rekke hypoksi-responsive gener [7].
Gitt de strukturelle likheter med HIF-1α og HIF-2α, de var tenkt til å handle redundant i den cellulære respons på hypoksi. Men en økende mengde bevis indikerer at HIF-1α og HIF-2α indusere ekspresjon av ulike sett av gener. Selv om HIF-1α og HIF-2α har felles mål som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), er de også regulere unike genet mål; HIF-1α regulerer glykolytiske enzymer [8] og HIF-2α aktiverer stamcellefaktor Oct4 [9]. I samsvar med dette funnet, Imamura et al. identifisert forskjellige sett med HIF-1α og HIF-2α målgener i SW480 tykktarm kreft celler ved cDNA microarray analyse [10].
Crosstalk er blitt rapportert mellom kanoniske Wnt signal og HIF signalering i tumorprogresjon og metastasering. Men de molekylære mekanismene som er involvert i denne crosstalk forbli dårlig forstått. Flere rapporter har vist at aktiviteten av transkripsjonsfaktorene reguleres ved hypoksi spiller en viktig rolle i regulering av stamcelle quiescence [9], og at HIF-1α-mediert aktivering Wnt fremmer opprettholdelsen av stamcelle-aktivitet [11]. Mazumdar et al. viste at HIF-1α modulerer Wnt /β-catenin signalisering i hypoksiske embryonale stamceller ved å forbedre β-catenin aktivering og ekspresjon av nedstrøms effektorer LEF-1 og TCF-1 [11]. I tillegg er det eksperimentelle bevis som støtter hypotesen om at både hypoksiske tilstander og kanoniske Wnt aktivering er involvert i å utløse en EMT program i mange kreftceller [12], [13]. Videre er crosstalk vist seg å eksistere mellom kanoniske Wnt signal og HIF signalering i tumorprogresjon og metastasering via den synergistiske samspillet av Wnt målet genet
c-MYC
med HIF-1α [14], [15]. I dette henseende, selv om det normale fysiologiske HIF-1α responser i ikke-maligne celler kan hemme aktiviteten av normal c-Myc, paradoksalt nok, den deregulert ekspresjon av onkogen c-Myc som finnes i mange kreftformer slik som kolorektal karsinom arbeider sammen med HIF- 1α for å gi tumor metabolske fenotypen beskrevet som Warburg effekt eller aerob glykolyse, så vel som for å fremme angiogenese [14].
Nåværende kunnskap om homeostatiske mekanismer som regulerer den epiteliale tykktarm stemness og malignitet forblir ufullstendig, noe som forhindrer signifikant fremskritt i behandling av tykktarmskreft. Denne studien undersøkte effekten av stabilt HIF-1α og HIF-2α siRNA knockdown i ondartede fenotype vedlikehold og i transkripsjonen aktivitet mediert av β-catenin. Våre resultater tyder på at selv om både HIF-1α og HIF-2α er avgjørende for stemness og malignitet vedlikehold, disse to proteinene utøve ulike effekter og spille opposisjonelle roller i kanonisk Wnt signal.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
De følgende antistoffer ble anvendt i disse eksperimentene: allofykocyanin-konjugert mus-anti-CD44, anti-mus CD44, og mus anti-CD24 fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA); fysoerytrin (PE) -konjugert mus anti-CD133 fra Miltenyi Biotec (Auburn, CA, USA); mus anti-HIF-1α, mus anti-HIF-2α, kanin anti-Oct4, Alexa 647-konjugert kanin-anti-mus, Cy3-konjugert geite-anti-kanin, og mus anti-lamin A /C fra Millipore (Billerica, MA ); kanin anti-β-tubulin fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); biotin-konjugert mus anti-CXCR4 fra R mus anti-β-catenin, muse-anti-cytokeratin 20 (CK20), kanin anti-E-cadherin, kanin anti-sneglen 1, mus anti-vimentin, kanin anti-GSK-3β, og geite-anti- (p-Ser9) -GSK-3β fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA); Alexa647 konjugert geit anti-kanin fra Molecular Probes, Inc., (Eugene, Oregon, USA); og allofykocyanin-konjugert streptavidin fra Biolegend (San Diego, California, USA). Mus lgG1 og IgG2b fra US Biologicals (Massachusetts, MA, USA) ble anvendt i samme konsentrasjon som det primære antistoff, som var isotype matchet kontroll i immunfluorescens-fargingen og flowcytometri eksperimenter. Den Annexin V FLUOS Farging Kit fra Roche Applied Science (Mannheim, Tyskland) ble brukt til å påvise apoptotiske og nekrotiske celler. Puromycin antibiotikum og L-laktatdehydrogenase ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). En vekstfaktor-redusert Matrigel matrise ble kjøpt fra BD Biosciences. Alle andre kjemikalier var av reagenskvalitet.
Plasmider
pTOPFlash og pFOPFlash reporter plasmider ble hentet fra Upstate Bioteknologi (Lake Placid, NY, USA). Den HRE-Luc reporter ble hentet fra Addgene (Plasmid 26731: HRE-luciferase), en non-profit organisasjon dedikert til å tilrettelegge for plasmid deling blant forskere. Kontroll plasmid som koder for et omkastet shRNA-sekvens ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Kontrollen (void plasmid pSuper), HIF-1a, og HIF-2α RNAi plasmider var generøse gaver fra Dr. Daniel Chung, og deres konstruksjon og effektivitet ble beskrevet i en tidligere rapport [10].
Cellekultur
Alle kreftcellelinjer og ikke-maligne 112CoN cellelinje som brukes her ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og kultivert som tidligere beskrevet [16]. Alle disse cellelinjene ble godkjent i januar 2012 av Short Tandem Gjenta DNA profilering utføres ved Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN) i Mexico City.
Western blotting
Prøver av protein (50 pg) ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) etterfulgt av elektroforetisk overføring til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) som beskrevet i en tidligere rapport [14]. En aktin antistoff ble brukt for å kontrollere for lik belastning.
Immunoutfelling
Cellene ble vasket og homogenisert i iskald lyserings pH 7,5 buffer inneholdende 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100 og en blanding av protease-inhibitorer og protein fosfatase-inhibitorer. Proteinkonsentrasjonen i supernatanten ble målt ved anvendelse av en detergent-kompatibel proteinanalyse (Bio-Rad). Alikvoter av disse ekstrakter (1 mg /ml) ble inkubert over natten ved 4 ° C med 2 ug /ml primære antistoff med forsiktig risting. Deretter ble 25 ul av protein A-Sepharose (30%, Calbiochem) ble tilsatt og inkubert i 2 timer. Immunkompleksene ble så vasket to ganger med buffer A (50 mM Tris-HCl og 0,6 M NaCl, pH 8,3) supplert med 0,1 mg /ml trypsin-inhibitor og 1 mM PMSF, og en gang med buffer B (50 mM Tris-HCl og 0,15 M NaCl, pH 7,5) som inneholder proteasehemmere og fosfatase-hemmere.
HIF-1α eller HIF-2α knockdown
for å indusere stabil stanse av HIF-1α eller HIF-2α, cellene ble transfektert med den pSuper HIF-1α eller HIF-2α RNAi plasmid, som ble konstruert og analysert ved hjelp av Dr. Daniel Chung som er beskrevet i en tidligere rapport [10] eller med betjenings plasmid (som koder for en kodet sekvens eller shRNA pSuper void plasmid) under anvendelse av Lipofectamine 2000 . for å generere stabile transfeksjoner ble cellene transfektert med enten 1 pg av styre plasmid eller en ug pSuper HIF-1α RNAi eller HIF-2α RNAi plasmider. Stabile transfektanter ble valgt med 3 ug /ml puromycin (Sigma) i fire uker, og klonene ble selektert og screenet for HIF-1α eller HIF-2α stanse ved strømningscytometri.
FACS-analyse
cellene ble løsnet og dissosiert i 10 mM EDTA-løsning. Cellesuspensjonen ble vasket, resuspendert i PBS supplert med 4% føtalt kalveserum (FCS) (farging buffer), farget med det tilsvarende primære antistoff, og deretter inkubert med det sekundære antistoff. Celler farget med det sekundære antistoff alene ble brukt som en negativ kontroll. For nukleær farging, ble kjerner renset fra celleprøver ved hjelp av en Nuclei Isolation Kit (Sigma-Aldrich) i henhold til produsentens instruksjoner. Kjernene ble vasket, fiksert, permeabilisert, blokkerte, og merket med anti β-catenin og Alexa 647-konjugert geit-anti-mus-antistoff i farging buffer. Som en negativ kontroll ble atomkjerner opprettholdt i separate rør probet parallelt med Alexa 647-konjugert geit-anti-mus-antistoff. Etter en endelig vask ble kjernene fiksert og analysert ved strømningscytometri.
laktat måling assay
Mengden av laktat kreft celler utskilt i kulturmediet ble målt ved anvendelse av et enzymatisk assay ved å bruke L -lactate dehydrogenase (Sigma). I denne analysen blir laktat utskilt i kulturmediet prøven redusert til pyruvat og NADH i nærvær av laktat-dehydrogenase (LDH) (Sigma) og overskudd av NAD. Mengden av NADH som dannes ved reaksjonen, målt ved forandringen i absorbans ved 340 nm, er proporsjonal med konsentrasjonen av laktat til stede i prøven. For å unngå interferens med LDH som allerede kan være tilstede i serum som brukes for å supplere kulturmediet, ble prøvene underkastet en deproteinisering med 8% trikloreddiksyre (TCA) for å gjøre dem proteinfritt før analysen.
Apoptose
SW480 kontroll eller HIF-1α eller HIF-2α-dempede-celler ble sådd ut på 24-brønners plater i en tetthet på 1,5 x 10
5 celler per brønn. Tjuefire timer etter utsåing ble cellene inkubert i fravær eller nærvær av apoptose indus H
2o
2 (1 mM) i 12 timer. Apoptose ble målt ved flowcytometri bruke Annexin V FITC kit (Roche) som anbefalt av produsentens instruksjoner. Nekrose ble målt med propidiumjodid (PI) permeabilitet i fravær av detergent. Prosentandelen av apoptotiske celler ble bestemt ved flowcytometri.
sårhelende analysen
Kontroll eller HIF-1α- eller HIF-2α-forstummet SW480 celler ble sådd til konfluens på poly-L- lysinbelagte glir i DMEM F12 supplert med 5% FBS. Etter 24 timer ble en ripe fremstilt ved anvendelse av en steril pipette. Kulturene ble vasket med PBS. På dette tidspunkt (t = 0 timer), ble sårkantene og fotografert. Cellene ble deretter dyrket i medium supplert med 0,05% FBS i opptil 72 timer, og sårkantene ble fotografert ved forskjellige tidspunkter.
Migration assay
kjemotaktiske respons til det stromale celle avledede faktor-1α (SDF-1α) av HIF-1α og HIF-2a-forstummet og kontrollceller ble vurdert ved hjelp Boyden kamre (3 mikrometer pore størrelse). Totalt 1 x 10
5-celler ble tilsatt til den øvre del av kammeret, og den nedre del av kammeret inneholdt SDF-1α (200 ng /ml i 0,05% FBS). For å oppnå de absolutte tall av trekklegemer, strømningscytometrisk teller for hver prøve ble oppnådd for en konstant, forutbestemt volum og deretter sammenlignet med de samme strømningscytometrisk tellinger oppnådd fra kontrollbrønnene.
Xenograft-tumormodell
utvalgte kloner av stabil kontroll-, HIF-1α-, eller HIF-2α-transfekterte celler ble selektert og screenet ved strømningscytometri for å bestemme den HIF-1α og HIF-2α stanse effektivitet sammenlignet med kontrollceller. Cellene som viser den høyeste knockdown effektivitet ble dyrket og anvendt for xenotransplantasjon inn i immunkompromitterte mus. For hvert injeksjonssted, 1 x 10
6 HIF-1α- eller HIF-2a-stilnet celler ble resuspendert i en høy konsentrasjon av Matrigel (BD Biosciences), fortynnet i PBS til en sluttkonsentrasjon på 50% og subkutant (sc ) injisert inn i flankene til seks uker gamle nakne mus (n = 5). Hver mus ble injisert i øverste høyre flanke med kontrollceller, i nederste høyre flanke med HIF-1a-forstummet celler, og inn i det nedre venstre flanke med HIF-2a-forstummet celler.
For xenotransplants bruker CD44
– /CD133
– eller CD44
+ subpopulasjoner, celler ble hentet fra SW480 celler stabilt transfektert med kontroll pSuper plasmid eller med pSuper HIF-1α eller HIF-2α RNAi ved FACS celle sortering. De rensede subpopulasjoner for hver tilstand ble oppsamlet ved trypsinering. Deretter, 1 x 10
4 celler pr injeksjonsstedet ble resuspendert i vekstfaktor-redusert Matrigel matrise, fortynnet i PBS til en sluttkonsentrasjon på 50% og s.c. injiseres inn i flankene til seks uker gamle nakne mus. Hver mus (n = 5 for hver betingelse) ble sprøytet inn i høyre flanke med CD44
– /CD133
– celler og inn i den venstre flanke med CD44
+ celler renset fra hver tilstand (kontroll, HIF- 1α knockdown, eller HIF-2α knockdown). Fire uker (for RKO eller SW480-avledede celler) eller to uker (for SW620-avledede celler) etter inokulering ble dyrene avlivet og tumorene ble fjernet og veiet.
Transfeksjon og luciferase-rapportørgenet assay
cellene ble sådd ut på 24-brønners plater ved en tetthet på 1,2-1,8 x 10
5 celler per brønn. Tjuefire timer etter utsåing ble cellene plassert i serumfritt medium og transfektert med 1 ug av et reporter plasmid (pTOPFlash) eller kontroll-plasmid (pFOPFlash) og med 0,05 ug av PRL luciferase plasmid eller CMV-GFP plasmid (transfeksjon kontroll). Luciferase reporter-aktivitet i cellelysatene ble målt 24 timer etter transfeksjon ved hjelp av den doble Luciferase Assay kit (Promega, Madison, WI, USA). Aktiviteten ble normalisert med hensyn til aktiviteten av
Renilla
luciferase eller i forhold til proteininnholdet i hver prøve.
Immunofluorescensanalyse
SW480 kontroll eller HIF-1α- eller HIF-2α knockdown celler ble dyrket på dekkglass. Cellene ble fiksert, permeabilisert og ko-immunfarget med antistoffer mot β-catenin, E-cadherin, vimentin og sneglen 1. Den fluorescens ble analysert ved hjelp av laser konfokal mikroskopi som er beskrevet i en tidligere rapport [16]. β-catenin og vimentin ble visualisert med Alexa 647-konjugert geit-anti-mus-antistoff, og E-cadherin og sneglen 1, ble visualisert med Cy3-konjugert geite-anti-kanin-antistoff. Cellen fluorescens ble fotografert ved hjelp av et konfokalt mikroskop (Leica TCS SP5) med en krypton argon laser. En kontrollprøve av celler ble farget med det sekundære antistoff bare for å bekrefte at ingen fluorescens signal ble oppdaget fra disse cellene.
Etikk uttalelse
Alle dyrene ble håndtert i henhold til god dyr praksis som definert av Animal Eksperimentelle Bio-etiske retningslinjer av Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricion Salvador Zubirán, Mexico. I tillegg ble alle dyrestudier godkjent av Animal Experimental bioetikkomité av Det medisinske fakultet, Universidad Nacional Autónoma de México. Når angitt, ble musene bedøvet med CO
2.
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Statistiske data analyse ble utført ved hjelp av Student
t
test eller en enveis-ANOVA med Tukey multippel sammenligningstest. En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
HIF-1α og HIF-2α er uttrykt i tykktarm kreft celler, men ikke i ikke-maligne celler under normoksiske forhold
.
Hypoksi er en vanlig tilstand observert i et bredt spekter av faste tumorer, og HIF over-ekspresjon er ofte forbundet med metastase og dårlige kliniske resultater.
In vivo
, er hypoksi også sannsynlig å være en funksjonell bestanddel av en normal stamcelle nisje. Men betydningen av hypoksi i CSC vedlikehold er fortsatt i stor grad ukjent [17]. Fordi høy HIF ekspresjon har blitt detektert i tumorceller i fravær av hypoksi, sammenlignet vi ekspresjonen av disse faktorene i dyrkede tykktarmskreftceller under normoksisk og hypoksiske betingelser med dyrkede ikke-maligne 112CoN celler som ble inkubert under de samme betingelser ved western blot . Resultatene vist i figur 1 viser at som ventet, hypoksi (3% O
2) induserte ekspresjon av både HIF-1α og HIF2-α i både normale (112CoN) og kreftceller; imidlertid, i henhold til normoksisk dyrkningsbetingelser (20% O
2), er det bare tykktarmskreftceller co-uttrykte både HIF-1α og HIF-2α, mens de ikke-ondartede 112CoN celler ikke uttrykker disse faktorene i henhold til normoksisk betingelser.
Normal tykktarm (112CoN) eller tykktarmskreftceller ble dyrket under normoxia (20% O
2) eller hypoksi (3% O
2) i 12 timer. Totale celleekstrakter av colon-cellelinjer ble fremstilt, og prøvene ble utsatt for 10% SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner. En immunoblot-analyse ble utført ved anvendelse av anti-HIF-1α eller anti-HIF-2a-antistoffer som er angitt i figuren, og utviklet ved hjelp av et pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Actin-antistoff ble anvendt for å kontrollere for lik belastning. En densitometrisk analyse ble utført for å beregne nivåene av HIF-1α og HIF-2α uttrykk, som ble normalisert til de tilsvarende ekspresjonsnivå i ikke-maligne celler 112CoN. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og data som representerer middel ± SEM fra minst tre uavhengige analyser. * P. 0,05
Stall knockdown av HIF-1α, men ikke HIF-2α reduserer laktat produksjon av tykktarmskreft celler under normoksiske forhold
For å forstå rollen til HIFs i kreft fenotype vedlikehold og deres mulige samvirke med kanoniske Wnt signalering, undersøkte vi effekten av den stabile knockdown av HIF-1α og HIF-2α ved siRNA i SW480 celler, som oppviser konstitutivt aktiv kanonisk Wnt signalering. Plasmidene brukt i denne studien ble konstruert og tidligere med hell undersøkt av Dr. Daniel C. Chung [10], som velvillig donert plasmidene til oss. SW480 celler ble transfektert med kontrollegge shRNA plasmid, pSuper HIF-1α RNAi, eller pSuper HIF-2α RNAi. Stabile transfektanter ble valgt ut ved hjelp av et antibiotikum i fire uker, og klonene ble selektert og screenet ved flowcytometri for HIF-1α og HIF-2α stanse i sammenligning med kontrollcellene. Stabile transfektanter som oppviser en reduksjon på minst 85% i HIF-1α uttrykk og en reduksjon på minst 90% i HIF-2α ekspresjon ble oppnådd og utvalgt ved flowcytometri, som vist i figur 2A. Kreftceller utviser øket glykolyse og laktatproduksjon og redusert O
2-forbruk sammenlignet med ikke-transformerte celler, et fenomen kjent som Warburg virkning [18]. I samsvar med denne virkning, viser figur 2B at en betydelig økning i laktatproduksjon var synlig i SW480 og RKO tykktarmskreftceller sammenlignet med ikke-maligne 112CoN kolon celler. Vi undersøkte effekten av den stabile stanse av hver HIF på laktatproduksjon av SW480 kreftceller under normoxia eller hypoksi. Som observert i figur 2C, er stabil knockdown av HIF-1α i SW480 celler redusert laktatproduksjon med minst 50% sammenlignet med kontrollceller under normoksisk forhold, mens HIF-2α knockdown bare førte til en nedgang i laktat-sekresjon 20% sammenlignet med kontrollceller under de samme betingelser (figur 2B). Etter 12 timer med eksponering for akutt hypoksi, ble nivåene av HIF-proteiner forhøyet, og nivåene av laktatproduksjon gjenvunnet (figur 2C). Derfor, for å unngå HIF overekspresjon, som kan overstyre knockdown effektivitet (vist i figur S1) og gjøre det vanskelig å dissekere den rollen hver HIF i vedlikehold av ondartede fenotype, bestemte vi oss for å utføre de fleste analyser i henhold normoksisk forhold.
A). Stabile HIF-1α- eller HIF-2α-knockdown eller kontroll (egge shRNA plasmid) transfektanter ble oppnådd som beskrevet i «Materialer og metoder». Utvalgte kloner ble screenet ved flowcytometri å vurdere stanse av HIF-1α og HIF-2α i sammenligning med kontrollcellene. B). Laktat sekresjon ble betydelig økt i kolorektal kreft cellelinjer, sammenlignet med ikke-maligne 112CoN celler. C). Endringer i laktat sekresjon av HIF-1α- eller HIF-2α- stilnet SW480-celler sammenlignet med kontrollcellene (Ctr i figuren) dyrket under normoxia (20% O
2) eller hypoksi (3% O
2) i 24 timer. L-laktat ble bestemt ved en enzymatisk LDH-assay som beskrevet i avsnittet «Materialer og metoder». Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og data som representerer middel ± SEM fra minst tre uavhengige analyser. *: P. 0,05
Stall knockdown av HIF-1α eller HIF-2α produsert en økning i basal eller H
2o
2-indusert apoptose i SW480 tykktarmskreftceller
Det er vel etablert at HIF-1α fremmer celleoverlevelse og apoptose motstand i flere cellesystemer under hypoksi. Vi utforsket om blokaden av HIF-1α eller HIF-2α uttrykk i kreftceller som uttrykker begge faktorer i henhold normoxia påvirker også cellular overlevelse. Vi har brukt hydrogenperoksyd for å indusere akutt apoptose fordi det har vært mye rapportert å være en potent induser av apoptose i kreftceller på grunn av produksjon av alvorlig oksidativt stress. HIF-stilnet SW480-celler ble behandlet med 1 mM H
2o
2 i 12 timer, og deretter graden av celle apoptose ble bestemt ved Annexin V-PI farging etterfulgt av strømningscytometri-analyse. Både apoptose og nekrose ble forsterket i henhold normoxia som et resultat av HIF-1α eller HIF-2α stanse sammenlignet med kontrollcellene, selv i fravær av apoptose inducer (øvre del av figur 3). Imidlertid er andelen av apoptotiske og nekrotiske celler oppnådd som et resultat av HIF-1α stanse var større enn det indusert av HIF-2α knockdown med hensyn til kontrollene, og denne effekten var mer tydelig når cellene ble behandlet i 12 timer med 1 mM H
2o
2 (figur 3). Dermed disse resultatene tyder på at HIFs, spesielt HIF-1α, er involvert i markedsføringen av celle overlevelse og motstand mot apoptose.
Apoptose ble indusert ved dyrking av HIF-forstummet eller kontroll (transfektert med egge shRNA plasmid og indikert på figuren som Ctr) celler i fravær eller nærvær av 1 mM H
2o
2 i 12 timer. SW480-celler ble trypsinert, vasket to ganger med PBS, og ubehandlet (kjøretøy) eller behandlet med H
2o
2 i 12 timer. Kulturene ble farget med Annexin V og PI, som beskrevet i «Materialer og metoder», og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer (et representativt histogram av dataene er vist), og diagrammet viser gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter; *: P 0,05; **: P. 0,01
Stall knockdown av HIF-1α eller HIF-2α redusert cellemigrasjon av SW480 kreftceller, men bare HIF-1α knockdown alvorlig rammede CXCR4-mediert chemotaxis
Vi utførte sårhelende analyser for å undersøke effektene av disse proteinene på cellemigrasjon. Stabile HIF-1α- eller HIF-2α-forstummet celler ble dyrket under normoxia til konfluens, og deretter riper ble gjort på monolayer. Bilder fra riper ble tatt ved 0 og 48 timer, og det ripe området ble analysert på følgende tidspunkter. Som det kan observeres i figur 4A, i forhold til kontrollene, ble migrering blokkert av knockdown av HIF-1α eller HIF-2α (se referanse grense linjer trukket på bildene). I tillegg evalueringen av cellulær migrasjon basert på den kjemotaktiske aktivitet overfor SDF-1α mediert av CXCR4-reseptoren viste at CXCR4-ekspresjon ble redusert som et resultat av HIF-1α men ikke HIF-2α knockdown (figur 4B). I samsvar med dette funnet, ved å stanse all HIF-1α ekspresjon nesten opphevet SDF-1α- CXCR4-mediert migrering av cancerceller via Transwell kamrene, mens den stanse av HIF-2α ekspresjon ble redusert cellemigrering med bare 45% i forhold til kontrollene (Figur 4C).
A) En sårhelende analyse ble benyttet for å bestemme hvorvidt cellemigrering er avhengig av enten HIF-1α eller HIF-2α uttrykk. SW480 knockdown og kontroll (kryptert shRNA plasmid) celler ble dyrket til konfluens i 24-brønners vevskulturplater, og det sårhelende assay ble utført som beskrevet i avsnittet «Materialer og Metoder». Ripete området ble fotografert rett etter såret (tid 0) og 48 timer etter såret. Disse bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. B) CXCR4 uttrykk ble redusert som følge av HIF-1α knockdown. SW480 kontroll eller dempede celler, som vist i figuren, ble løsnet ved hjelp av EDTA og vasket, og 1 x 10
5-celler ble inkubert med mus biotin-konjugert anti-CXCR4 og allofykocyanin-konjugert streptavidin-antistoff og undersøkt ved strømningscytometri. Dataene viser median fluorescensstyrkene CXCR4 uttrykk og SSC (side-spredt lys, proporsjonal med celledetaljnivå), og representerer gjennomsnittsverdier ± SEM fra tre uavhengige forsøk. *: P 0,05; **: P 0,01. C) Vesentlige forskjeller ble observert i SDF-1α-indusert kjemotaktisk respons. Den kjemotaktiske respons til SDF-1α av HIF-1α- eller HIF-2α-knockdown eller kontrollceller (Ctr i figuren) ble vurdert ved hjelp Boyden kamre som beskrevet i «Materialer og metoder». Cellene ble inkubert i 48 timer for å tillate migrering og utvinnes ved hjelp av EDTA. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter utført i duplikat. *: P 0,05; **: P. 0,01
Stall stanse av HIF-1α eller HIF-2α redusert in vivo tumorigen aktivitet innpodet tykktarmskreftceller
Effekten av stabil siRNA-
