Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen regnes som en dødelig og behandling-refraktær sykdom. For å oppnå en potent anticancer medikament, den cytotoksiske effekten av 2- (benzo [d] oksazol-3 (2H) -ylmetyl) – 5 – ((cykloheksylamino) metyl) benzen-1,4-diol, dihydroklorid (NSC48693) på human bukspyttkjertelen kreftceller CFPAC-en, MiaPaCa-2, og BxPC-3 ble vurdert
i
vitro
. Spredning av CFPAC-1, MiaPaCa-2, og BxPC-3 blir inhibert med IC
50 verdi på 12,9 ± 0,2, 20,6 ± 0,3 og 6,2 ± 0,6 uM i 48 timer, henholdsvis. Denne oppdagelsen er fulgt med ytterligere analyse for å demonstrere at NSC48693 hemming skyldes induksjon av apoptose, inkludert Annexin V flekker, Kromatin flekker, og kolonidannende analyser. Det er videre avdekket at NSC48693 induserer frigjøring av cytokrom
c
, reduserer mitokondriemembranen potensial, genererer reaktive oksygenforbindelser, og aktiverer caspase. Disse resultatene indikerer at kollektivt NSC48693 induserer apoptose i hovedsak av CFPAC-1, MiaPaCa-2, og BxPC-3 celler ved mitokondrie-mediert apoptotiske reaksjonsvei. Spennende, studien belyser en oppmuntrende inhibering effekt som human embryonisk nyre (HEK-293) og lever (HL-7702) celler er mer motstandsdyktig mot virkningen av antivekst NSC48693 sammenlignet med de tre kreftcellelinjer. Fra dette perspektivet, bør NSC48693 bidra til å åpne opp en ny mulighet for behandling av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Liu Z, Li D, Zhao W, Zheng X, Wang J, Wang E (2012) En potent Lead induserer apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (6): e37841. doi: 10,1371 /journal.pone.0037841
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 30 august 2011; Godkjent: 28 april 2012; Publisert: 20 juni 2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China National med tilskudd av No.90713022 og 20735003. J. Wang takket National Science Foundation og National Institutes of Health for finansielle støtter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen regnes som en aggressiv kreft siden det vanligvis går ubemerket til den når den sent stadium [1]. I 2010, bukspyttkjertelkreft var 4
th vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall over hele verden [2]. Behandling av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen avhenger i hovedsak av kirurgi, strålebehandling, kjemoterapi eller kombinerte terapeutiske metoder. Det er vel kjent at bukspyttkjertelkreft ofte har en dårlig prognose, siden den 80-85% av pasientene som er tilstede ved et lokalt fremskreden eller metastatisk stadium, som utelukker operasjon, på grunn av sin høye tendens til lokal invasjon og fjerne metastaser. Kjemoterapi kan brukes til å forbedre livskvaliteten og få en beskjeden overlevelse fordel for kreft i bukspyttkjertelen. Mono gemcitabin godkjent av FDA i 1998, representerer i dag den mest effektive kjemoterapeutisk stoff som bedrer livskvaliteten og forlenger levetiden til pasienter med avansert kreft i bukspyttkjertelen for fem-ukers. På grunn av forekomsten av chemoresistance til gemcitabin [3], gemcitabin inneholder kombinasjoner, for eksempel gemcitabin-erlotinib, -placebo og -oxaliplatin, ble oppfunnet og utstilt synergieffekter og redusert motstand [4]. Det er beklagelig at små overbevisende resultater er funnet på klinisk relevante forbedringer i livskvalitet og overlevelse. For å løse dette problemet, synes det å være et stort behov for utvikling av nye legemidler mot kreft.
forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen har gitt mange håp for oppdagelsen av nye chemotherapeutical agenter i bukspyttkjertelkreft terapi [5]. Inhibering av apoptose spiller en viktig rolle i den forringelse ferd med kreft i bukspyttkjertelen som de andre tumorer [6]. Apoptose, eller programmert celledød, er en svært kontrollert fysiologisk prosess, og en kjerne signalveien [7]. Således, har anticancer legemidler som apoptotisk inducer blitt foreslått og allment akseptert ved behandling av kreft [8]. Noen arbeider har vist at apoptotiske-medierende terapi er et lovende horisont for behandling i kreft med liten toksisitet overfor omgivende normale celler på grunn av deres fysiologisk kontrollert overlevelsesreaksjonsveien [9], [10]. Den apoptose-induserende derfor fortsetter å utgjøre en viktig retning for utvikling av nye legemidler for behandling av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
I den foreliggende undersøkelse, er en potent bly betegnes som 2- (benzo [d] oksazol -3 (2H) – yl-metyl) – 5 -. ((cykloheksylamino) metyl) benzen-1,4-diol, dihydroklorid (NSC48693, figur 1) hemmer proliferasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler CFPAC-1, MiaPaCa-2, og BxPC -3 ved å indusere apoptose i mitokondrie-mediert vei
i
vitro
. Spennende, er den cytotoksiske effekten av NSC48693 på kreftcellene mer uttalt enn normalt humane embryonale nyre (HEK-293) og lever (HL-7702) celler. Disse resultatene støtter en rolle for NSC48693 som en potent apoptotisk induser av kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Material
Alle kjemikalier inkludert Ac-DEVD-FMK ( kaspase-3 inhibitor) og Ac-LEHD-FMK (caspase-9-inhibitor) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO), med mindre annet er angitt. DMEM, IMDM og føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra Gibico (Grand Island, NY). De primære antistoffer mot caspase-3, caspase-8, caspase-9, BCL-2, Bax, cytokrom
c Hotell og peroksidase-konjugert geit-anti eller antikanin sekundært antistoff samt isotype mus IgG1, geit anti- mus IgG1 FITC ble kjøpt fra BD Biovitenskap (San Jose, California). NSC48693 ble vennlig levert fra NCI /DTP Åpne Kjemisk Repository (https://dtp.cancer.gov). NSC48693 ble løst i DMSO for å lage stamoppløsning (10 mg /ml) og fortynnet til forskjellige konsentrasjoner med dobbeltdestillert vann inneholdende 10% DMSO.
Bakgrunn for NSC48693
omfattende studier på kreft i bukspyttkjertelen har identifisert at Ras-signalisering er involvert i reguleringen av apoptose. Utvikling av legemidler rettet mot Ras og induserer apoptose blir forfulgt intensivt i medisiner. Den aktive GTP-bundet Ras er i likevekt med tre distinkte tilstander, hvorav den ene er den åpne ikke-signale konformasjon som er et transient intermediat i løpet av GTP-hydrolyse [11]. Dette innebærer at Ras-mellomproduktet er en konvergent punkt for overlevelse signalering i bukspyttkjertelkreft. I dag er derfor synes åpen konformasjon til å være den mest lovende mål for drug design. Strukturen av GppNHp-bundet RasG60A-GTP (PDB ID: 1XCM [11]) ble anvendt i forankrings beregningene. Alle docking beregninger ble utført ved hjelp av Autodock pakken [12]. Databasen av National Cancer Institute (NCI) mangfold sett ble brukt til den virtuelle screening. Vi deretter rangert disse små molekylene i henhold til den forutsagte affinitet og spesifisitet definerte [13]. 2- (benzo [d] oksazol-3 (2H) -ylmetyl) -5 – ((cykloheksyl-amino) metyl) benzen-1,4-diol, dihydroklorid (NSC48693) plukket ut fra NCI-databasen viste veksthem effekt på leukemi cellelinjer CCRF-CEM og MOLT-4 som vist på NCI Cancer Screen Nåværende data (https://dtp.nci.nih.gov). Liten innsats fokuserer på effekten av NSC48693 på kreft i bukspyttkjertelen, slik at det har en valgt utvalg av høy kvalitet induserer apoptose.
Cell Kultur
Den menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer CFPAC-1, MiaPaCa -2, og BxPC-3 ble ervervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og dyrket i DMEM og IMDM-medium supplert med 10% FBS og antibiotika (100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin sulfat), henholdsvis. Den menneskelige embryonale nyre 293 (HEK-293) og lever (HL-7702) celler ble hentet fra Chinese Academy of Science Type Culture Collection (Shanghai, Kina) og inkuberes i DMEM medium supplert med 10% FBS. Cellene ble løsnet fra monolag ved bruk av 0,25% trypsin og 0,53 mM EDTA i 5 minutter ved 37 ° C når cellene ble dyrket til nær konfluens.
Hoechst 33342 Farging
tre humane pankreas kreftceller (1 × 10
5 celler /plate) ble henholdsvis seeded på 6-brønnen glass-bunn plate og lov til å feste natten. Cellene dyrket i 135 ul DMEM-medium ble behandlet ved anvendelse av enten 15 pl 250 pg /ml NSC48693 (endelig konsentrasjon 25,0 pg /ml) som eksperimentelle grupper eller 15 ul dobbeltdestillert vann inneholdende 10% DMSO i kontrollgrupper, og deretter dyrket i 48 time ved 37 ° C og 5% CO
2 forhold. Deretter ble cellene fiksert i MeOH-HOAc (03:01, v /v) i 10 minutter ved 4 ° C og deretter farget ved hjelp av Hoechst 33342 kit (Biotech keygen, Nanjing, Kina). De fargede celler ble analysert ved konfokal laser scanning mikroskop (TCS SP2, Heidelberg, Tyskland).
cytotoksisitetsassayer
Cellen levedyktighet av tre kreft i bukspyttkjertelen celler og to humane normale celler (1 x 10
4 celler /brønn i 96-brønns plate) etter å ha blitt behandlet med dobbeltdestillert vann inneholdende 10% DMSO som kontrollgrupper eller forskjellige konsentrasjoner av NSC48693 som eksperimentelle grupper ble bedømt ved tiazolyl blå tetrazolium-bromid (MTT) assay. Cellene ble behandlet i 48 timer og deretter den optiske tetthet (OD) ved 490 nm ble avlest med en 96-brønns multiscanner autoleser (Biotech Instruments, New York). MTT ikke forstyrrer NSC48693 og bevirker en positiv respons.
Soft Agar Assays
soft agar analyser ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [14]. De enkle cellesuspensjoner av kreft i bukspyttkjertelen celler inneholdende 1 x 10
4 celler i 0,3% agar ble plassert i 3,5 cm skåler på toppen av en gelert lag med 1% agar i medium (DMEM eller IMDM med 10% FBS) og dyrket med dobbeltdestillert vann inneholdende 10% DMSO som kontrollgrupper eller forskjellige konsentrasjoner av NSC48693 som eksperimentelle grupper ved 37 ° C. Kolonier ble fiksert med 2,5% glutaraldehyd og tellet å utføre bare de kolonier som var større enn 10 celler i diameter mindre enn Olympus X71 invertert fasemikroskop (Dr. Schumann Optik OHG, Hessen, Tyskland). Andel av kolonidannende effektivitet ble beregnet som antall kolonier /100 seeded celler.
apoptose Analyser
apoptose av tre kreft i bukspyttkjertelen celler (1 x 10
6 celler /brønn i 24-brønns plate) etter å ha blitt behandlet med dobbeltdestillert vann inneholdende 10% DMSO som kontrollgrupper eller forskjellige konsentrasjoner av NSC48693 som forsøksgrupper ble målt ved hjelp av Annexin V-FITC /propidiumjodid (PI) apoptose deteksjon kit (keygen Biotech, Nanjing, Kina ). Kvantifisering av PI og FITC signaler ble utført ved bruk av fluorescens aktivert celle sorter FACSAria (BD Biovitenskap, San Jose, California) og prosentandel av fargede celler i hver kvadrant ble kvantifisert ved hjelp av Diva 6.0-programvare (BD Biovitenskap, San Jose, California). I alt ble 10.000 hendelser analyseres i hver prøve.
caspase aktivitetsanalyse
Celler ble dyrket i 6-brønners plate (5% CO
2, 37 ° C) ved seeding tetthet 2 × 10
6 celler /brønn. Platene ble preinkubert over natten før oppløsningene av medikament ble tilsatt til hver brønn. Etter en periode med eksponering (24 eller 48 h) med forskjellige konsentrasjoner NSC48693 ble cellene høstet ved trypsinering med trypsin /EDTA-løsning ble vasket med PBS-oppløsning, og aktiviteten av caspase-3, caspase-8, og caspase-9 ble bestemt ved caspase aktivitetsanalyse kit (keygen Biotech, Nanjing, Kina), henholdsvis. DEVDase, IETDase, og LEHDase aktivitet ble målt ved å måle proteolytisk spaltning av kromogene substrater Ac-DEVD-pNA, Ac-IETD-pNA, og Ac-LEHDpNA, som ble brukt som substrater for caspase-3, caspase-8, og caspase -9-lignende proteaser, henholdsvis [15]. Absorbansen av enzymatisk-pNA frigjort ble målt ved 490 nm på en multiscanner autoleser.
Etter 24 timer tilslutning, cellene (1 x 10
5 celler /plate) ble behandlet med 25,0 pg /ml NSC48693 i 48 timer. Deretter ble cellene undersøkt ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskopi.
Analyse av cytokrom
c
slipp
Cellene ble dyrket i 24-brønners plate (5% CO
2, 37 ° C) ved poding tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn. Platene ble preinkubert over natten før oppløsningene av medikament ble tilsatt til hver brønn. Etter en periode med eksponering (6 eller 12 h) med forskjellige konsentrasjoner NSC48693 ble cellene høstet ved trypsinering med trypsin /EDTA-løsning og vasket med Hanks balanserte saltløsning supplert med 2% bovint serumalbumin og 0,2% azid. Deretter ble cellene fiksert og permeabilized hjelp Cytofix /Cytoperm kit (BD Biovitenskap, San Jose, California). Uspesifikk binding av anti-cytokrom
c
antistoff ble blokkert med mus IgG1. Anti-cytokrom
c product: (7H8.2C12) tilsatt for ytterligere 30 minutter ved 4 ° C. Deretter ble cellene inkubert med geite-anti-mus lgG1 FITC (01:20) i 30 minutter ved 4 ° C. Etter vasking med Perm /vaskeløsning ble cellene øyeblikkelig analysert ved flow-cytometri (FCM). Helt, ble 10.000 hendelser per sample kjøpt og analysert.
Måling av Mitokondrier membranpotensialet (ΔΨm)
Endringer i ΔΨm ble målt ved Rhodamine-123 (Rho-123) fargestoff [16] . Celler ble dyrket i 24-brønns plate (5% CO2, 37 ° C) ved poding tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn. Platene ble preinkubert over natten før oppløsningene av medikament ble tilsatt til hver brønn. Etter en periode med eksponering (48 h) med forskjellige konsentrasjoner NSC48693 ble cellene høstet ved trypsinering med trypsin /EDTA-løsning ble vasket med PBS-oppløsning og inkubert med Rho-123 (10 ug /ml). Deretter ble Rho-123 fluorescens målt til FCM. Prosentandelen av Rho-123- celler representerer effektive kollapset ΔΨm; reduksjon av Rho-123 indikerer tap av ΔΨm i celler [16]. I alt ble 10.000 hendelser analyseres i hver prøve.
Påvisning av reaktive oksygen arter (ROS)
Flowcytometrisk deteksjon av ROS ble utført som beskrevet tidligere [17]. I korthet ble cellene dyrket i 24-brønns plate (5% CO
2, 37 ° C) ved poding tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn. Platene ble preinkubert over natten før oppløsningene av medikament ble tilsatt til hver brønn. Etter en periode med eksponering (2 timer) med forskjellige konsentrasjoner NSC48693 ble cellene høstet ved trypsinering med trypsin /EDTA-løsning og deretter ROS fluorescensintensitet ble bestemt ved FCM. ROS nivåer ble uttrykt som prosentandel, som ble beregnet ved å diva 6,0 programvare. I alt ble 10.000 hendelser analyseres i hver prøve.
Etter 24 timer tilslutning, cellene (1 × 10
4 celler /brønn i 96-brønners plate eller 1 × 10
4 celler i 3,5 cm skål) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av NSC48693 som indikert i 48 timer. Deretter ble vekstinhibering bedømt ved MTT-metoden (A) og forankringsuavhengig vekst assays (B), respektivt. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD i tre uavhengige eksperimenter.
Western blotting
Cellene (2 × 10
6 celler) ble seedet til 10 cm plate og dyrket i kuvøse over natten. Deretter ble cellene eksponert med en eller to x IC
50 konsentrasjon på NSC48693 og 10% DMSO (kontroll) i 24 timer. Hel-celle proteiner og mitokondrielle fraksjoner ble isolert ved hjelp av protein utvinning kit (keygen Biotech, Nanjing, Kina). Proteinkonsentrasjonene ble bestemt ved hjelp av BCA protein assay kit (keygen Biotech, Nanjing, Kina). Like mengder av proteiner ble fraksjonert ved bruk av 12% SDS-PAGE og deretter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranene ble inkubert med primære antistoffer mot caspase-3, caspase-8, caspase-9, cytokrom
c
, Bcl-2, og Bax, etter å ha blitt blokkert med 3% BSA i TBS. Membranene ble inkubert med peroksidase-konjugert geit-anti-antikanin eller sekundært antistoff. Aktin ble anvendt for kontroll lasting. I inhibisjonsanalyse for caspase-3 og kaspase-9 ble cellene forbehandlet ved 20 uM Ac-DEVD-FMK eller Ac -LEHD-FMK i 2 timer etter tilslutning, og mediet ble endret av kulturen inneholdende 2 x IC
50 konsentrasjon på NSC48693 eller 10% DMSO.
Statistical Analysis
Alle data ble uttrykt som middel ± SD av triplikate eksperimenter, og reproduserbarhet ble bekreftet i det minste tre separate eksperimenter. Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av SPSS 11,5 statistisk programvare.
Etter 24 timer tilslutning, cellene (1 x 10
4 celler /brønn i 96-brønns plate) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av NSC48693 som angitt for 48 timer. Deretter ble vekstinhibering analysene bedømt ved MTT-metoden. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Utstrekning av apoptose indusert i kreftceller (1 x 10
6 celler /brønn i 24-brønns plate) ble behandlet med 25,0 pg /ml av NSC48693 i MiaPaCa-2, 12,5 ug /ml av NSC48693 i CFPAC-1, og 6,25 ug /ml NSC48693 i BxPC-3 til 24 eller 48 timer ble målt til FCM, respektivt. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist; og hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD i tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
NSC48693 Endringer Cell morfologi
Cellular morfologi kan brukes som en parameter for å måle effekten av en forbindelse av celletoksisitet. Siden nukleær oppstår kondens i denne fasen av apoptose, vil apoptotisk morfologi av kjernen være tydelig ved beising [18]. Den nukleær farging med Hoechst 33342 viser at cellene i kontrollgruppene er proporsjonale og godt fordelt (fig. 2). Sammenlignet med den normale kjernemorfologi, typiske morfologiske endringer, inkludert cytoskeletal kollaps, dannelse av apoptotiske legemer og kjerne fragmentering, er observert i de behandlede celler som vist med pilene i fig. 2. Disse egenskapene gående oppstått i løpet av denne form for celledød, noe som var alle de vanlige tegn på celledød [19].
Celler (2 x 10
6 celler /brønn på 6-brønners plate) ble behandlet med NSC48693 ved de angitte konsentrasjoner i 24 (A, B, C) eller 48 timer (D, E, F) og deretter undersøkt. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD i tre uavhengige eksperimenter.
Cellene (5 × 10
4 celler /brønn i 24-brønns plate) ble behandlet ved de angitte doser for 6 (CFPAC- 1 og BxPC-3) eller 12 timer (MiaPaCa-2). Intracellulær cytokrom
c
ble oppdaget av antistoff 7H8.2C12 i faste og permeabilzed celler. Prosenter representerer andelen celler med senket cytokrom
c
signal. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist; og hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
NSC48693 hemmer celleproliferasjon
I tillegg til detaljert komparativ analyse av de morfologiske endringer, cytotoksisiteten til NSC48693 til cellene ble påvist gjennom tapet av cellelevedyktighet ved hjelp av MTT-analyse [20]. Som vist på fig. 3A, blir levedyktigheten til kreftceller betydelig redusert ved NSC48693 med eksponeringsdosen økes. NSC48693 hemmer kreftceller proliferasjon med IC
50 verdi på 12,9 ± 0,2 pM for CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 uM for MiaPaCa-2, og 6,2 ± 0,6 uM for BxPC-3 etter 48 timer, henholdsvis. Dette ble også støttet ved evnen til NSC48693 til å blokkere den forankrings-uavhengig vekst av kreftceller i bløt agar. Sammenlignet med kontrollgruppene, kreftceller danne mindre og færre kolonier når de dyrkes i nærvær av NSC48693. Som indikert i fig. 3B, skjer dette respons på en doseavhengig måte. Kombinert med resultatene, konkluderer vi med at NSC48693 reduserer spredning av kreftceller på en doseavhengig måte.
cytotoksiske effektene av NSC48693 på HEK-293 og HL-7702
Som vist i figur . 4, cellelevedyktigheten til HEK-293 og HL-7702 er 63,4 ± 4,1% og 91,2 ± 2,9% ved en dose på 25,0 ug /ml av NSC48693, respektivt. NSC48693 hemmer HEK-293 og HL-7702 celler spredning med en IC
50 verdi 144,5 ± 8,8 mikrometer og 198,6 ± 11,3 mikrometer ved 48 h, henholdsvis. Selvfølgelig, de cytotoksiske effektene av NSC48693 på normale humane celler er mindre sensitive enn kreftceller CFPAC-1, MiaPaCa-2, og BxPC-3 sammenlignet med fig. 3.
Cellene (5 × 10
4 celler /brønn i 24-brønns plate) ble behandlet ved de angitte doser i 48 timer. Da forsøkene ble utsatt for FCM. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist; og hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD i tre uavhengige eksperimenter.
NSC48693 induserer apoptose
For å utelukke muligheten for at hemming av cellevekst skyldes cytotoksiske effekter, apoptose Analysen ble utført . Celler som var positive for Annexin V-FITC og negative for PI er i tidlig stadium av apoptose som vist i Q4 kvadrant, mens cellene som var positive for begge Annexin V-FITC og PI er i sent stadium av apoptose eller nekrose, som vist i Q2 kvadrant [21 ]. Således er graden av apoptose korrelert med mengden av positive Annexin V-FITC-celler. Og den intakte membranintegritet bedømt ved negativ farging PI antyder at apoptose, men ikke nekrose er karakteren av apoptose. Som vist på fig. 5, er det lite binding av Annexin V-FITC til kontrollcellene, mens binding etter behandling med NSC48693 økes som vist i Q4 kvadrant. Som for MiaPaCa-2-celler som ble behandlet ved en konsentrasjon på 25,0 ug /ml av NSC48693, er bindingen økes fra 73,1 ± 1,0% til 82,7 ± 2,8% ved 24 timer og 48 timer. Bindingen økes fra 37,1 ± 2,0% til 50,5 ± 3,1% ved 24 timer og 48 timer, etter CFPAC-1-celler er behandlet med 12,5 ug /ml av NSC48693. Mens bindingen økes fra 46,4 ± 2,4% til 55,0 ± 1,1% ved 24 timer og 48 timer, etter BxPC-3-celler behandlet med 6,25 ug /ml av NSC48693. Kombinert med disse observasjonene, er det klart at effekten av NSC48693 på kreftceller er i hovedsak mediert ved å indusere apoptotisk celledød.
Aktivering av Caspase
Som viktige mediatorer av apoptose, aktiveringen av caspase er avhengig av proteolytisk spaltning av procaspase. For å bedre vår forståelse om caspase var involvert i NSC48693-indusert apoptose i kreftceller, undersøkte vi enzymaktivitetene caspases med en spektrofluorometriske analyse ved hjelp av de tilhørende underlag [22]. Som vist på fig. 6A, er C, D, F, aktiviteten av kaspase-3 og kaspase-9 økte på en dose-og tidsavhengig måte sammenlignet med ubehandlede celler i tre kreftceller; aktiviteten av caspase-8 koblet til døds reseptorer klarte ikke å økes i CFPAC-1 og BxPC-3-celler (fig. 6B, E). Imidlertid er aktiviteten av kaspase-8 i MiaPaCa-2-celler økte på en dose-og tidsavhengig måte sammenlignet med ubehandlede celler. Disse funnene antyder at NSC48693 aktiverer den iboende mitokondriene-mediert apoptotiske reaksjonsvei som fører til caspaseaktivering å indusere apoptose i CFPAC-1 og BxPC-3-celler. For MiaPaCa-2 celler, aktiverer NSC48693 både mitokondrie og membran død reseptor apoptotiske sti.
Cellene (5 × 10
4 celler /brønn i 24-brønns plate) ble behandlet ved de angitte doser i 2 timer. Da forsøkene ble utsatt for FCM. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist; og hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD i tre uavhengige eksperimenter.
Like mengder cellulære proteiner ble fraksjonert på 12% SDS-PAGE-geler og overført til PVDF membraner. Actin ble brukt til å styre laste.
Offentliggjøring av cytokrom
c
Utgivelsen av cytokrom
c
er et avgjørende skritt kontrollere apoptosome sti. Clone 7H8.2C12 har valgt å spesial oppdage intracellulær cytokrom
c
. Derfor reduksjonen i cytokrom
c
signal detekteres av antistoff 7H8.2C12 reflekterer mitokondrie cytokrom
c
utgivelsen og tidlig debut av apoptose [23]. Som vist på fig. 7, BxPC-3 celler i kontrollgruppene har lav grad av cytokrom
c plakater (11,8 ± 1,7%), mens NSC48693 behandling forbedrer mitokondrie cytokrom
c
utgivelse fra 32,9 ± 1,3% til 36,9 ± 1,4% ved konsentrasjoner på 25,0 og 50,0 ug /ml i 6 timer. CFPAC-1 celler ubehandlede av NSC48693 har normal mitokondrie cytokrom
c
nivå (7,9 ± 1,9%), mens mitokondrie cytokrom
c
versjonene er økt fra 35,9 ± 1,2% til 47,6 ± 0,6 0,9% ved konsentrasjoner på 25,0 og 50,0 ug /ml i 6 timer. Også MiaPaCa-2-celler som ble behandlet med NSC48693 har en forbedret mitokondrie cytokrom
c
frigivelse fra 4,6 ± 1,8% i kontrollgruppen til 19,0 ± 1,3% og 29,3 ± 2,8% ved en konsentrasjon på 25,0 og 50,0 pg /ml i 12 timer, henholdsvis.
Tap av ΔΨm
ΔΨm kan produseres når protoner ble pumpet fra den mitokondrielle matriks til den inter mitokondrielle plass [24]. Og spredning av ΔΨm har vært knyttet til noen apoptotiske reaksjonsveier, inkludert mitokondriell apoptotisk reaksjonsvei [25]. Helt fleste ubehandlede celler har intakte plasmamembranen og normal ΔΨm imidlertid tapet av ΔΨm viser en doseavhengig økning måte etter at cellene ble behandlet med NSC48693 ved 12,5 og 25,0 ug /ml i 48 timer (fig. 8). Etter MiaPaCa-2-celler blir behandlet med NSC48693, prosentandelen av ΔΨm sammenbrudd når 13,3 ± 1,9% og 24,7 ± 1,8%, henholdsvis. Og prosentandelen av ΔΨm sammenbrudd av CFPAC-1-celler har nådd 18,9 ± 1,1% og 34,2 ± 2,9%, henholdsvis. Selv om prosentandelen av ΔΨm sammenbrudd i BxPC-3-celler er innlysende og oppnår 24,9 ± 2,4% og 92,9 ± 8,9%, henholdsvis. Eksperimentene tilveiebringe en tilstrekkelig nøyaktig grunnlag for den konklusjon at kreftceller behandlet med NSC48693 miste ΔΨm.
Like mengder av cellulære proteiner ble fraksjonert på 12% SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner. Actin ble brukt til å styre laste.
Generering av ROS
Den generasjonen av ROS er direkte relatert til mitokondriene [16]. Som vist i fig. 9, avslører flowcytometrisk analyse som MiaPaCa-2 celler ubehandlede har lavt nivå av endogen ROS (18,0 ± 0,3%), mens NSC48693 behandling øker betydelig intracellulær ROS-nivåer fra 58,0 ± 2,3% til 68,0 ± 4,4% ved konsentrasjoner av 50,0 og 100,0 ug /ml i 2 timer. CFPAC-1 celler ubehandlede av NSC48693 har normal endogene ROS nivå (2,5 ± 1,6%), mens ROS-verdiene øker fra 74,0 ± 2,8% til 81,4 ± 0,5% ved konsentrasjoner på 12,5 og 25,0 mg /ml i 2 timer. Dessuten er ROS-nivåene økte fra 9,8 ± 1,3% 16,4 ± 2,7% etter BxPC-3-celler blir behandlet ved NSC48693 ved konsentrasjoner på 25,0 og 50,0 mg /ml i 2 timer.
Effekt av NSC48693 videre apoptose-relaterte proteiner
effekten av NSC48693 på apoptose-relaterte proteiner ble bekreftet ved western-blotting som er vist på fig. 10. NSC48693 behandling øket spaltning av caspase-9 og caspase-3 på doseavhengig måte. Ekspresjonen av spaltet-caspase-8 var nesten umulig å oppdage i CFPAC-1 og BxPC-3-celler. Imidlertid spaltingen av caspase-8 var åpenbar i MiaPaCa-2-celler, som var enighet med kaspase-aktivitet som vist i fig. 6. Samtidig Bcl-2 protein uttrykk var nede regulert og Bax var opp regulert. Den cytokrom
c
i cytosol ble forbedret samtidig med tilhørende demping av cytokrom
c
i mitokondriene. I tillegg er spesifikke inhibitorer av kaspase-9 og caspase-3 nesten fullstendig opphevet den NSC48693-indusert spaltning av caspase-9 og caspase-3, henholdsvis (fig. 11).
diskusjon
Selv om udekket cellegifter har ennå til å oppnå noen reell fremgang i klinisk behandling så langt, er kjemoterapi fortsatt en ryggrad i behandling av avansert kreft i bukspyttkjertelen i dag [25]. Således nye kjemoterapeutiske legemidler med forskjellige virkningsmåter er alltid behov for behandling av kreft i bukspyttkjertelen pasienter. Mekanismen for celledød indusert av kjemoterapeutiske medikamenter er antatt å være en endogen apoptotisk mekanisme. Dermed induksjon av apoptose i kreftceller har blitt anerkjent som en innovativ medisiner strategi for kreftterapi [26] – [28]
Potensielle apoptotiske indusere bør drepe kreftceller i stedet for å forårsake overdreven toksisitet for normale.. I denne studien har vi fokusert på å vurdere effekten av NSC48693 på død ved å indusere apoptose av menneskelige bukspyttkjertelen kreftceller CFPAC-1, MiaPaCa-2, og BxPC-3
i
vitro
. Det ser ut til at kreft og normale celler reagerer forskjellig på NSC48693 eksponering i MTT analyser. Resultatene av cellelevedyktighet indikerer at levedyktigheten av kreftceller er betraktelig hemmet ved NSC48693 med IC50 på 12,9 ± 0,2 pM for CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 uM for MiaPaCa-2, og 6,2 ± 0,6 uM for BxPC-3, respektivt. Imidlertid er følsomheten av normale celler til NSC48693 vesentlig forskjellig. I kontrast er ingen åpenbar cytotoksisitet oppdaget i normale celler med IC
50 144,5 ± 8,8 mikrometer for HEK-293 og 198,6 ± 11,3 mikrometer for HL-7702, henholdsvis. Disse resultatene gir direkte bevis for at normale celler HEK-293 og HL-7702 er mer motstandsdyktig mot anti-vekstvirkningene av NSC48693 i forhold til kreftcellene CFPAC-1, MiaPaCa-2, og BxPC-3. Basert på den veksthemmende virkning forårsaket av NSC48693 på kreftceller som vist på fig. 3, den celle apoptose i respons til NSC48693 ble undersøkt. Fig. 5 antyder at NSC48693 utløser apoptotisk celledød av kreftcellene i bukspyttkjertelen, hvilket innebærer at NSC48693 har høyere cytotoksisitet via induserende merket celledød ved apoptose i kreftceller. Videre forskjellige celletyper varierer dypt i deres mottakelighet for apoptose induksjon, som Leas til forskjellige celleterskler eksisterende for apoptoseinduksjon [29]. Det kritiske spørsmålet er rundt normale vev eller celler kan pause og reparere skader mens kreftcellene dør ved apoptose. NSC48693 synes å være mindre toksisk for normale cellelinjer, noe som kan attributt til denne mulighet for at normale celler har noen beskyttende mekanismer mot NSC48693 [30]. Under den normale cellulære reduksjon, genererer hydrogenperoksyd og hydroksylradikal inntreffer. Disse kan gå tapt gjennom frakopling eller avdrives, som fører til oksidativ skade. De normale celler har beskyttende mekanismer for å avgifte overdreven ROS, noe som fører til reduksjon av den toksiske effekt av NSC48693 på HEK-293 og HL-7702.
Apoptose kan utløses av en rekke stimuli, og mitokondrier anses å spille en sentral rolle i både caspase-avhengig og caspase-uavhengig apoptose [31]. Mitokondrier starte to forskjellige apoptose veier, nemlig den indre mitokondrie sti og ytre membran død reseptor vei [32]. For den største av kjemoterapeutiske medikamenter, er apoptose initiert av den indre mitokondrie-reaksjonsveien [27], [28].
