Abstract
antigen likhet mellom svulster og embryoer har blitt verdsatt i mange år og gjenspeiler? ekspresjonen av embryonale genprodukter av cancerceller og /eller kreft-initiering av stamceller. Benytte seg av denne likheten, har vi testet en profylaktisk lungekreft vaksinen består av allogene murine embryonale stamceller (ESC). Naive C57BL /6 mus ble vaksinert med ESC sammen med en kilde av granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) for å tilveiebringe immunstimulerende adjuvansaktivitet. Vaksinerte mus ble beskyttet mot senere utfordring med implanterbare Lewis lungekarsinom (LLC). ESC-induserte antitumorimmunitet var ikke skyldes en ikke-spesifikk «allo-response» som vaksinering med allogene muse-embryonale fibroblaster ikke beskytter mot tumorutvekst. Vaksineeffekten ble assosiert med robuste tumor-reaktiv primær og minne CD8
+ T effektor svar, Th1 cytokin respons, høyere intratumoral CD8
+ T effektor /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T regulatoriske celle forhold, og redusert antall myeloide avledet suppressor celler i milten. Forebyggelse av tumordannelse ble funnet å kreve en CD8-formidlet cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) reaksjon fordi
in vivo
uttømming av CD8
+ T-lymfocytter fullstendig opphevet den beskyttende effekten av vaksinering. Viktigere, dette vaksinasjonsstrategi også undertrykket utvikling av lungekreft indusert ved en kombinasjon av kreftfremkallende administrering og kronisk pulmonal inflammasjon. Videreutvikling av denne romanen vaksinen strategi og identifisering av felles ESC /tumorantigener kan føre til immunterapeutiske alternativer for lungekreftpasienter og, kanskje enda viktigere, kan representere et første skritt mot utviklingen av forebyggende kreftvaksiner.
Citation : Yaddanapudi K, Mitchell RA, Putty K, Willer S, Sharma RK, Yan J et al. (2012) Vaksinasjon med embryonale stamceller Beskytter mot Lung Cancer: Er et bredspektret forebyggende vaksine mot kreft mulig? PLoS ONE syv (7): e42289. doi: 10,1371 /journal.pone.0042289
Redaktør: Lucia Gabriele, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 14 mars 2012; Godkjent: 05.07.2012; Publisert: 31.07.2012
Copyright: © Yaddanapudi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH /NCRR P20RR018733 (KY), American Lung Association (jWe, RAM) og Kentucky Lung Cancer Research Program (RAM). JWe støttes av Commonwealth of Kentucky Forskning Challenge Trust Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: De rapporterte her effektene er gjenstand for en ventende amerikanske Letters patentsøknad som legene. Mitchell og Eaton er navngitt som oppfinnere, søknad nummer 60/782 672 (US PTO), med tittelen «Metoder og materiale for immunisering mot kreft». Det ble innlevert 15 mars 2007 (etter første innlevering 15 mars 2006). Så langt forfatternes kunnskap, har det ikke vært noen kontor handling på det og det er fortsatt en søknad. Det er ingen andre patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
En gammel teori om onkogenese var at kreft oppsto fra reir av embryonale stamceller, som finnes i normalt vev og stimulert til å vokse med noen form for irritasjon [1]. Selv om dette konseptet ble i stor grad ignorert i over hundre år, er det nå dokumentert at mutert, vevsspesifikke stamceller fungere som selvstendig fornye «kreft initiere celler», ansvarlig for igangsetting av mange kreftformer [2]. I indirekte støtte for denne idé, det er rikelig bevis for at mest solide tumortyper uttrykker embryoniske antigener i varierende grad [3], [4], [5]. For eksempel, «carcinoembryonic antigener», først beskrevet i midten av 1960-tallet, representerer antigener som deles av befruktede egg og svulster i fordøyelseskanalen [6], [7]. Til tross for en viss suksess ved hjelp av disse delte embryonale /tumorantigener som mål for immunterapi hos kreftpasienter, har en vedvarende hindring for disse tilnærmingene er at av tumorindusert immuntoleranse [8].
Et alternativ immunbaserte anti- kreft strategi kan være forebyggende vaksinering mot tumorantigener
før
til utseendet av kreft – og den tilhørende immuntoleranse – men denne tilnærmingen er også full av problemer. Selv om vi nå har noen effektive vaksiner for kreft som oppstår fra smittestoffer (for eksempel, human papilloma virus [9]), kreft oppstår fra «selv» og de fleste antigener som vises av tumorceller er også til stede på normale voksne celler. Men nå ser det ut til at de fleste svulster uttrykke visse embryonale antigener. Viktigere, kan uttrykket av noen embryoniske antigener ende i første eller andre trimester av svangerskapet, i god tid før pattedyrimmunsystemet bestemmer «selv» versus «ikke-selv». Følgelig kan genprodukter uttrykt av både embryo og kreftceller ikke inngå i «selv» repertoar, og er derfor potensielt immunogene.
I begynnelsen av det 20. århundre, ble det rapportert at før injeksjon av mus med fostervev førte til avvisning av trans svulster (anmeldt i [10]). Kļaviņš
et al
rapporterte senere at antisera i kaniner mot en emulgert hele den menneskelige embryo (6-7 uke) -. Adsorbert mot voksne menneskelig vev – anerkjent en rekke menneskelige krefttyper, inkludert hud, bronkial, nyre-, colonic, lever, lunge og bryst [11]. Disse observasjoner støtter ideen om at dyr eller mennesker immunisert mot embryoniske materiale som kan være i stand til å gjenkjenne og ødelegge neoplastiske celler. Svært nyere studier beskrive potensialet i ESC for å prime anti-tumor immunitet. Disse rapportene viste at pluripotente ESC indusere beskjedne forsinkelser i tumorvekst i mus modeller av transplanttykktarmskreft og lungekreft [12], [13].
Immunstimulerende cytokiner, inkludert GM-CSF, interleukin (IL) -2 IL-12 og interferon (IFN) -α har vist betydelig antitumoreffekter. Blant disse, er GM-CSF en av de mest kraftige og spesifikke indusere av anti-tumor systemisk immunitet [14], [15]. GM-CSF formidler sin virkning ved å stimulere aktiveringen av profesjonell antigen-presenterende celler (APC), nemlig dendrittceller (DC) og makrofager. De APCer i sin tur prosess og presentere tumorantigener for å varsle hjelper-T-celler og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) [16], [17]. Økt lokal produksjon av GM-CSF ved genmodifiserte tumorceller kan indusere spesifikke anti-tumor cellulær immunitet både
in vitro Hotell og
in vivo product: [15], [17], [18], [19]. I denne studien, forsøkte vi å forbedre kreft immunterapeutisk potensialet til embryonale stamceller antigen kryssreaktivitet med ondartede celler i et forsøk på å identifisere en mer effektiv ESC-basert anti-kreft-vaksine.
Her rapporterer vi at vaksinering med ESC i kombinasjon med en kilde for GM-CSF er effektiv i å forebygge implanterbare og carcinogen-induserte lungesvulster uten påviselig toksisitet eller tegn på autoimmunitet. Den terapeutiske effekten av ESC /GM-CSF kombinasjonsvaksine ble assosiert med robuste tumor-spesifikke primære og langsiktige minne CD8
+ T effektor svar, infiltrasjon av CD8
+ T-celler i svulsten som fører til økt intratumoral CD8
+ T effektor /T regulatoriske celleandel og redusert antall myeloide avledet suppressor celler (MDSCs) i milten. Kollektivt, våre funn gi en sterk begrunnelse for å videreutvikle denne romanen form for vaksine som et immunterapeutisk strategi for forebygging av kreft.
Resultater
ESC vaksinering hindrer utvekst av en implantert lunge adenokarsinom
Vårt innledende studier har forsøkt å vurdere den relative beskyttende effekt av ESC vaksine i fravær av eventuelle immunstimulerende adjuvanser. Immunisering av mus med bestrålt ESC alene hadde ingen effekt på tidspunktet for start av Lewis lungekarsinom (LLC) tumorutvekst men resulterte i en moderat reduksjon i innledende tumorbelastning i forhold til tumorer i ikke-immuniserte kontrollmusene (
Data ikke vist
) var i overensstemmelse med tidligere studier [12], [13]. For å forsterke effekten av ESC vaksine av GM-CSF samtidig bruk, må vi først forsøkt å over-express murine GM-CSF i ES-D3 ES cellelinje ved hjelp av retroviral transduksjon som tidligere rapportert for B16 melanom /GM-CSF-vaksiner [15]. Men på grunn av vanskeligheter med å oppnå nevneverdig GM-CSF-ekspresjon ved hjelp av denne tilnærmingen – sannsynligvis på grunn av retrovirale promoter element stanse i ESC [20] – vi i stedet stabilt over-uttrykte GM-CSF i STO fibroblaster som vanligvis anvendes som feeder-lag for ES D3 celler. Som vist på fig. 1A, mock smittet STO fibroblaster uttrykt ubetydelig murine GM-CSF mens GM-CSF retroviralt omformet STO fibroblaster uttrykke og utskille supra fysiologiske mengder av cytokin. Ved hjelp av en standard vaksinasjon timing regime (Fig. 1B), ble naive C57BL /6 mus vaksinert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll), bestrålt ESC gitt samtidig med STO fibroblaster uttrykker GM-CSF (ESC /STO-GM ), eller STO-GM celler alene. Syv dager etter den andre immunisering ble musene utfordret med levende LLC celler og overvåkes for tumorutvekst som en funksjon av tid. Som vist på fig. 1C, vaksinering av mus med ESC /STO-GM var 70% effektiv i å hindre svulst utvekst mens alle ikke-vaksinerte kontrolldyrene hadde utviklet palpable tumorer etter dag 24 etter smitte. Viktigere, bestrålt STO-GM celler ga ingen beskyttelse mot utvekst av LLC svulster (Fig. 1C) tyder på at den observerte beskyttelse med ESC /STO-GM er ikke på grunn av ikke-spesifikke immunresponser mot allogene hele celleantigener. Til slutt er det viktig å merke seg at de LLC svulster som hadde utvikler seg i ESC /STO-GM vaksinerte mus (n = 3) var betydelig mindre og vokste ut ved en mye lavere hastighet enn de som utvikler seg i ikke-vaksinerte kontrollmus (n = 10) (fig. 1 D). Vi neste fastslått om vår vaksinasjonsstrategi gir beskyttelse mot utvekst av andre C57BL /6-deriverte svulster. Mot dette formål, utfordret vi ESC /STO-GM vaksinert mus med syngene B16F0 melanom cellelinje som stammer fra C57BL /6 mus og overvåkes tumorvekst over tid. Som vist i fig S2, ESC /STO-GM vaksinering effektivt reduseres størrelsen av melanom tumorer og også forårsaket en betydelig forsinkelse i tumor outgrowh i forhold til kontroll, ikke-vaksinerte mus.
(A) stolpediagram som viser GM-CSF uttrykk i ikke-omsatte og retroviralt omsatte STO fibroblaster. Feilstolpene representerer middelverdi ± SD. *, P 0,05; i forhold til ikke-omsatte STO-celler;
t
test. (B) Scheme av immunisering. Mann C57BL /6 mus ble immunisert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll), eller bestrålt 1 × 10
6 ESC + bestrålt 1 × 10
6 GM-CSF-uttrykke STO murine embryonale fibroblaster (STO -GM) sc i den høyre flanke. Syv dager etter løft, ble musene utfordret med 1 × 10
5 Lewis lungekarsinom celler (LLC) subkutant i venstre flanke. (C) C57BL /6 mus (10 /gruppe) ble immunisert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll), eller bestrålt 1 × 10
6 ESC + bestrålt 1 × 10
6 STO-GM, eller bestrålt 1 × 10
6 STO-GM celler alene sc i høyre flanke før s.c. utfordring med LLC på dag 21. Tumorveksten ble overvåket daglig i alle dyr inntil ofring på grunn av tumorer som overstiger 5% av kroppsvekten. Den vaksinert tumorfrie mus vedvarte i opptil 4 måneder senere med ingen klare tegn på ubehag eller autoimmunitet. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. **,
p
0,001; i forhold til kontroll-gruppe; log-rank test. (D). Tumorvekst ble målt ved calipers hver 2. eller 3. dag og svulstvolum ble plottet som angitt. Dataene representerer gjennomsnittstumorvolum på 10 mus /kontrollgruppe og 3 mus /ESC /STO-GM-gruppen og er representative for tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM.
ESC vaksinasjon utløser tumorcelle spesifikke CD8-avhengige cytotoksiske T-lymfocytter svar
De fleste vellykkede kreftimmunterapi krever en robust CD8-avhengig CTL respons [21 ], [22]. For å undersøke om ESC /STO-GM vaksinasjon utløser CD8 svar, splenocytes fra ESC /STO-GM vaksinert og ikke-vaksinert (kontroll) mus ble vurdert for
in vitro
tumorcelle drepe ti dager etter immunisering. Resultatene indikerer tilstedeværelse av en CTL-respons etter at ESC /STO-GM vaksinasjon (fig. 2A). Viktigere er dette drapet spesifikt for tumorceller (og ESC) i at ingen cytotoksisitet ble observert mot primær voksne murine lunge fibroblaster eller STO fibroblaster (
data ikke vist
). Vi undersøkte flere fenotypiske markører på CD8
+ splenocytes fra ESC /STO-GM vaksinert og kontroll mus. Granzyme B er en cytolytisk molekyl vanligvis uttrykt av effektor, men ikke naive eller minne, CD8
+ splenocytes [23], [24]. Splenocytter ble oppnådd fra ikke-vaksinerte /tumor utfordret (kontrollgruppen), vaksinert /svulst utfordret og vaksinert /ikke-tumor utfordret mus og farget direkte
ex vivo
, uten restimuleringen. Som vist på fig. 2B, bare en meget liten brøkdel av CD8
+ splenocytter isolert fra ikke-immuniserte kontrollgruppe mus uttrykt granzyme B, mens 25,6% av CD8
+ splenocytter fra vaksinerte /tumor utfordret mus uttrykt dette CTL effektor (n = 6 /gruppe;
t
test,
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen gruppe, figur 2B, D).. Videre ingen forskjeller i prosenter av CD8
+ granzymeB
+ celler ble observert i splenocytter isolert fra vaksinerte mus som ikke ble utfordret med LLC celler i forhold til vaksinert /tumor utfordret mus (Fig. 2C), som gir ytterligere bevis at den økte granzyme B responsen vi observerer i vaksinerte /svulst utfordret mus er spesifikke for kreftceller. Som en ytterligere test på viktigheten av CD8-avhengige CTL-mediert anti-tumor-effekter, CD4
+ eller CD8
+ T-lymfocytter ble tømt
in vivo
ved anvendelse av anti-CD4 eller anti-CD8 monoklonale antistoffer [25]. Mens mus utarmet av CD4
+ lymfocytter ble i hvert fall delvis beskyttet mot utvekst av LLC, CD8
+ T-celle uttømming helt avskaffet den beskyttende effekten av ESC /STO-GM vaksinasjon (tabell 1).
(A) C57BL /6 mus (5 /gruppe) ble immunisert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll) eller bestrålt 1 × 10
6 ESC + bestrålt 1 × 10
6 STO-GM celler sc i den høyre flanke. Ti dager etter løft, ble musene avlivet og milten ble fjernet. Splenocytter fra vaksinerte og kontrollmusene ble tilsatt til brønnene pre-seeded med LLC celler og ko-dyrket i ytterligere 16 timer med de angitte effektor-til-mål-celle-forhold, med tap av det sistnevnte overvåket i en Acea elektrisk impedans-leser. Resultatene som vises representerer fire uavhengige brønner for hver effektor-til-target forhold og feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD. (B-D) C57BL /6 mus ble immunisert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll) eller bestrålt 1 × 10
6 ESC + bestrålt 1 × 10
6 STO-GM celler subkutant i den høyre flanke. Syv dager etter den siste immunisering ble musene utfordret med 1 × 10
5 LLC celler subkutant i venstre flanke. 18-21 dager etter tumor-utfordringen ble musene avlivet, og milten ble fjernet. I tillegg ble ett sett med mus vaksinert med ESC /STO-GM alene og ikke utfordret med svulst. Splenocytter fra vaksinert /tumor utfordret, vaksinert /ikke-tumor utfordret og kontrollmus ble vasket, ble Fc-reseptorer blokkeres, og farget for overflateekspresjon av CD8 og intracellulær ekspresjon av granzyme B og analysert ved flow-cytometri. (B, D) Prosent av CD8
+ celler som uttrykker granzyme B i splenocytter hentet fra vaksinerte /svulst utfordret og kontroll mus (6 /gruppe). (C) Prosent av CD8
+ celler som uttrykker granzyme B i splenocytter hentet fra vaksinert /ikke-tumor utfordret mus (6 /gruppe). Resultatene er uttrykt som prosentandeler av gated CD8
+ splenocytter (*, p og 0,05, sammenlignet med kontroll-gruppe;
t
test). Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD.
ESC vaksinasjon induserer tumorcelle-spesifikke, Th1-mediert cytokin respons i CD8
+ T-celler
neste bestemmes av evnen til CD8
+ T-celler fra vaksinerte mus for å produsere cytokiner effektorfunksjoner som kreves for effektiv anti-tumoral cytolytisk aktivitet. Som reaksjon på gjen stimulering med LLC cellelysat, en betydelig høyere frekvens av IFN-γ, TNF-α og IL-2-produserende CD8
+ splenocytter ble oppnådd fra ESC /STO-GM-vaksinerte mus, sammenlignet med den ikke- vaksinert kontrollgruppe (n = 6 /gruppe; ANOVA,
p
0,05, i forhold til kontroll gruppe, fig. 3A-D). I fravær av LLC re-stimulering, ble det ikke observert noen økning i cytokinproduksjon i CD8
+ splenocytter fra vaksinerte mus sammenlignet med ustimulerte, kontrollere ikke-vaksinerte mus (fig. 3E, F). Når du analyserer de uavhengige bidrag fra ESC og STO-GM vaksinasjoner til CD8
+ T-celle effektorfunksjoner, observerte vi at ESC alene eller STO-GM behandlinger alene klarte å indusere en betydelig økning i prosentandelen av milt CD8
+ TNF-α
+ og CD8
+ IFNy
+ celler sammenlignet for å kontrollere ikke-vaksinerte mus (fig. 3C). For å avgjøre om ESC /STO-GM vaksinert mus indusert lignende CD8
+ T effektor svar til andre C57BL /6 avledet kreftceller, utførte vi
in vitro
cytokinanalyse med lysates avledet fra B16F0 melanomceller. Som forventet, i respons for å re-stimulering med B16 celle-lysat, vi har observert en betydelig økning i hyppigheten av IFN-γ og TNF-α produserende CD8
+ splenocytter fra ESC /STO-GM vaksinerte mus i forhold til restimulert splenocytt kulturer hentet fra ikke-vaksinerte kontrollgruppen (figur S2).
C57BL /6 mus (6 /gruppe) ble immunisert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll) eller bestrålt 1 × 10
6 ESC alene, eller bestrålt 1 × 10
6 ESC + bestrålt 1 × 10
6 STO-GM, eller bestrålt 1 × 10
6 STO-GM celler alene, sc i den høyre flanke. Ti dager etter at boost, ble musene avlivet og milten ble fjernet. Splenocytter fra vaksinerte og kontrollmusene ble ko-dyrket med LLC lysat (50 ug /ml) i ytterligere 4 dager. Effektorer ble høstet og stimulert i 4 timer med PMA (50 ng /ml) og ionomycin (500 ng /ml) i nærvær av Brefeldin A (1 ul /ml). Etter restimuleringen ble effektorer høstet, Fc reseptorer ble blokkert, og farget for overflate uttrykk av CD4, CD8 og intracellulær uttrykk for cytokiner og analysert ved flowcytometri. (A, B) Dot plott som viser TNF-α og IFN-γ ekspresjon i CD8
+ -celler i splenocytt kulturer erholdt fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinerte mus. Tall i kvadranter representerer prosenter for hver undergruppe. (C, D) søylediagram som viser prosentandeler av CD8
+ TNF-α
+, CD8
+ IFN-γ
+ og CD8
+ IL2
+ celler i splenocytt kulturer som stammer fra kontroll, ESC alene, STO-GM alene og ESC /STO-GM vaksinert mus. Resultatene er uttrykt som prosentandeler av totale celler. *, P 0,05; i forhold til kontroll-gruppe; ANOVA. (E, F) Ustimulerte miltceller fra vaksinerte og kontrollmusene ble direkte behandlet med PMA /ionomycin /Brefeldin A og farget for intracellulær cytokin ekspresjon. To uavhengige cellekulturanalyser ble utført med celler isolert fra 6 mus per gruppe; data fra en representativ analyse er vist. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD.
ESC vaksinasjon reduserer myeloide-avledet suppressor celler, men endrer ikke T regulatoriske celler i milten
For ytterligere å studere immunmodulerende effekter av ESC /STO -GM vaksinering, analyserte vi fenotypen av splenocytter ved strømningscytometri. Det har blitt vist at CD11b
+ GR1
+ myeloide-avledet suppressor celler (MDSCs) og CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T regulatoriske celler (T
regs) er de to suppressor populasjoner som hindrer de anti-tumor effektor svar i milten [26], [27]. Vi har funnet at andelen av MDSCs ble signifikant redusert fra 33,8% til 9,8% i milten av mus vaksinert med ESC /STO-GM og utfordret med LLC celler sammenlignet med ikke-vaksinert, LLC utfordret kontrollmus (n = 5 /gruppe ;
t
test,
p
0,05, i forhold til kontroll gruppen, fig. 4A, B). ESC /STO-GM vaksinering, men ikke redusere prosentandelen av milt T
regs (fig. 4C) eller indusere noen endring i forholdet mellom CD8
+ T-celler til T
regs i milten (fig. 4D). Videre har vi ikke observere noen signifikante forskjeller i prosenter av CD4
+ og CD8
+ T celler (fig. 4E) eller i deres absolutte antall (
ikke vist
) i milten fra vaksinerte og kontroll mus.
C57BL /6 mus ble immunisert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll) eller bestrålt 1 × 10
6 ESC + bestrålt 1 × 10
6 STO GM celler sc i den høyre flanke. Syv dager etter den siste immunisering ble musene utfordret med 1 × 10
5 LLC celler subkutant i venstre flanke. 18-21 dager etter tumor-utfordringen ble musene avlivet, og milten ble fjernet. Splenocytter fra vaksinerte og kontroll mus ble vasket, Fc reseptorer ble blokkert, og farget for overflateuttrykk av ulike markører og analysert ved flowcytometri. (A) Prikkplott som viser prosenter av milt CD11b
+ GR1
+ myeloide-avledet suppressor celler (MDSCs) i kontroll- og ESC /STO-GM vaksinerte mus. Tall i kvadranter representerer prosenter for hver undergruppe. (B) søylediagram som viser prosenter av CD11b
+ GR1
+ MDSCs i splenocytes hentet fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinert mus. Resultatene er uttrykt som prosentandeler av totale celler. *, P 0,05; i forhold til kontroll-gruppe;
t
test. (C) søylediagram som viser prosentandeler av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T regulatoriske celler (T
reg) i splenocytes hentet fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinert mus. Resultatene er uttrykt som prosentandeler av totale celler. (D) Forholdet mellom CD8
+ foxp3
– til CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T
reg celler ble beregnet og sammenlignet i splenocytter hentet fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinert mus. (E) Bar graf som viser prosentandeler av CD4
+ T og CD8
+ T-celler i splenocytter hentet fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinert mus. Resultatene er uttrykt som prosentandeler av totale celler. Tre uavhengige analyser ble utført med celler isolert fra 5 mus pr gruppe; data fra en representativ analyse er vist. Feilstolpene representerer gjennomsnittlig ± SD.
ESC vaksinasjon øker forholdet mellom CD8
+ T-celler til effektor-T
kjørte i tumoren
Våre resultater tyder på at ESC /STO-GM-indusert anti-tumor effektorfunksjon hovedsakelig skjer ved CD8
+ T-celler. Vi har derfor studert effekten av denne vaksinen diett på funksjonen til intra-tumor CD8
+ celler og deres samspill med T
regs. Utnytte små antall av ESC /STO-GM vaksinert mus som gjorde utvikle LLC lesjoner – (Fig. 1C, D) riktignok i en forsinket mote, svulster fra kontroller og vaksinerte mus ble høstet og brukt til å undersøke undergruppe profiler av tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss). Flowcytometrisk analyse av CD45.2
+ Tīlss avslørte en nedgang i andelen av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T
regs i tumor infiltrerer fra vaksinerte mus
mot
kontroller (fig. 5A). Selv om vi fremdeles observeres nærværet av T
reg i disse svulstene, forholdet mellom CD8
+ T-celler til T
kjørte var signifikant økt i tumoren infiltrerer fra ESC /STO-GM vaksinerte mus (n = 3 /gruppe;
t
test,
p
0,05, i forhold til kontroll gruppen, fig. 5B, C). For å vurdere kvaliteten på CD8
+ T-celle tumor infiltrerer følgende ESC /STO-GM vaksinering, analyserte vi uttrykk for aktivering markør CD25 og effektor cytokin IFN-γ. CD8
+ celler i ESC /STO-GM tumor infiltrater hadde forhøyet CD25-ekspresjon og var istand til å produsere større mengder av IFN-γ i respons til re-stimulering med PMA /ionomycin (n = 3 /gruppe;
t
test,
p
0,05, i forhold til kontroll gruppen, fig. 5D, E). Dermed ESC og kombinasjonsvaksine STO-GM øker forholdet mellom CD8
+ T-celler til T
regs og prosenter av CD8
+ CD25
+ og CD8
+ IFN betydelig γ
+ effektorceller i svulstene og antyder effektiv vaksine-indusert, tumor-reaktiv immunsystem grunning.
C57BL /6 mus ble immunisert to ganger (dag 0 og 14) med HBSS (kontroll) eller bestrålt 1 × 10
6 ESC + bestrålt 1 × 10
6 STO-GM celler sc i den høyre flanke. Syv dager etter løft, ble musene utfordret med 1 × 10
5 Lewis lunge carcinoma celler subkutant i venstre flanke. 18-21 dager etter tumor-utfordring, ble tumor-infiltrerende celler høstet fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinerte mus og analysert ved strømningscytometri. (A) Histograms viser prosentandelen av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T
regs i CD45.2
+ kreft infiltrerende celler hentet fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinert mus . (B) Prikkplott som viser hvor mange prosent av CD8
+ og foxp3
+ underpopulasjoner i CD45.2
+ tumor infiltrerer cellene. (C) Bar graf som viser forholdet mellom CD8
+ foxp3
– til CD8
-Foxp3
+ celler i en av to representative eksperimenter med 3 uavhengig analysert mus /gruppe. *, P 0,05; i forhold til kontroll-gruppe;
t
test. (D, E) øker ESC vaksinering hyppigheten av funksjonelle CD8
+ T-celler i tumorer. (D) Bar graf som viser hvor mange prosent av CD25
+ CD8
+ i CD45.2
+ kreft infiltrerende celler hentet fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinert mus. (E) Tumor infiltrerende celler ble stimulert med PMA og ionomycin og analysert for ekspresjon av intracellulær IFN-γ. Søylediagram som viser prosenter av CD8
+ IFN-γ
+ i tumor infiltrerer cellene fra kontroll og ESC /STO-GM vaksinert mus. Resultatene er uttrykt som prosentandeler av totale celler. Dataene representerer resultater fra 2 uavhengige forsøk med 3 mus /gruppe. *, P 0,05; i forhold til kontroll-gruppe;
t
test. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD.
ESC vaksinasjon-indusert CD8
+ T-celle-mediert effektor svar er opprettholdt i langsiktig overlevende dyr
Vi neste testet effekten av vår ESC vaksinasjonsstrategi i vedlikehold av CD8
+ T-celle minne og generering av sekundære responser som bruker mus som hadde blitt vaksinert /beskyttet 60 dager tidligere. Controls inkludert naive, ikke-vaksinerte mus som ble utfordret med LLC celler. 80% av musene som tidligere er vaksinert med ESC /STO-GM ikke hadde utviklet svulster 90 dager etter tumor re-vaksinasjon, mens 0% av alders matchet kontroller forble tumorfrie (n = 10 /gruppe; log-rank test,
p
0,001; forhold til naiv kontrollgruppe, fig. 6A). Viktigere, vaksinerte dyr med utryddet LLC tumorer beholdt langtids immunologisk hukommelse som bestemt ved økt produksjon av IFN-y ved milt-CD8
+ celler (n = 4 mus /gruppe;
t
test,
p
0,05, i forhold til naiv kontrollgruppe, fig. 6B). Videre observerte vi en betydelig økning i milten CD8
+ CD44
hi minneceller i langsiktige vaksinert mus nytt utfordret med LLC tumorceller sammenlignet med naive tumor utfordret mus. (N = 4 mus /gruppe;
t
test,
p
0,05, i forhold til naiv kontrollgruppe, Fig. 6C, D).
Long-term overlevende mus fra ESC /STO-GM gruppen ble gjen utfordret fm med 1 × 10
5 LLC celler 60 dager etter første tumorinokulasjon. (A) Tumorvekst ble overvåket daglig i alle dyr inntil ofring på grunn av tumorer som overstiger 5% av kroppsvekten. Resultatene representerer en summering av to uavhengige eksperimenter med 10 mus /gruppe. **, P 0,001; i forhold til naive kontroll; log-rank test. (B-D) Milter ble isolert fra vaksinerte overlevende og tak naive mus 10 dager etter tumorinjeksjon. (B) Splenocytter ble høstet og stimulert i 4 timer med PMA (50 ng /ml) og ionomycin (500 ng /ml) i nærvær av Brefeldin A (1 ul /ml). Etter restimuleringen ble cellene høstet, Fc reseptorer ble blokkert, og farget for intracellulær uttrykk av cytokiner, og analysert ved flowcytometri. Søylediagram som viser prosentandelen av intracellulær IFN-γ uttrykk i CD8
+ celler (*,
p
0,05, i forhold til naive kontroll;
t
test). Resultatene er uttrykt som prosentandeler av totale celler. (C) Prikkplott som viser hvor mange prosent av CD44
+ og CD8
+ celler i splenocytes avledet fra langsiktig overlevende ESC vaksinert og kontrollere naive mus. Tall i kvadrantene representerer prosenter av hver undergruppe. (D) Bar graf som viser hvor mange prosent av CD44
+ CD8
+ celler (*,
p
0,05, i forhold til naive kontroll;
t
test). Resultatene er uttrykt som prosentandeler av totale celler. Data for B-D er representative for to uavhengige eksperimenter med 4 mus /gruppe. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD.
ESC vaksinasjon undertrykker 3-methylcholanthrene initiert, butylhydroksytoluen fremmet lunge kreft
Forebygging av utvekst av implanterbare lungesvulster ved hjelp av denne vaksinasjonsstrategi ikke forutsi effekt i
in vivo
lunge tumorigenesis. For å teste sistnevnte, vi benyttet en musemodell som involverer kreftfremkallende administrasjon fulgt av kronisk lungebetennelse som er tenkt å etterligne røyking-forbundet lunge kreftutvikling [28]. Hann Balb /c mus ble utsatt for en bolus av 3-methylcholanthrene (eksperimentelt uke 1) og repeterende administrering av butylert hydroksytoluen (BHT; uker 3-8). Disse dyrene ble deretter vaksinert (uke 4, 6 og 8) med enten HBSS alene eller ESC /STO-GM. I denne modellen flere lungesvulster forutsigbart dannes innen fire til seks måneder etter oppstart. 18 uker etter den første dosen med 3-methylcholanthrene, ble lungene høstet og fikset. Initial brutto undersøkelse av lungene avslørte at kontroll vaksinerte mus lungene alle hadde overflate tumorer med gjennomsnittlig 1.6 store lesjoner pr mus (Fig. 7A). I kontrast, bare 1/8 mus vaksinert med ESC /STO-GM hadde en synlige overflaten svulst som gir et gjennomsnitt på ~0.2 lungesvulster /mus (n = 8;
t
test,
p
0,05, i forhold til kontroll gruppe, fig. 7A). Total lungetumormasse ble ytterligere evaluert i 3 dyr i hver gruppe ved undersøkelse av seriesnitt i lungene. Som vist på fig.
