Abstract
I denne studien undersøkte vi
in vitro
antitumor-funksjoner av et syntetisk derivat chalconforbindelse 4,3 «, 4′, 5»-tetramethoxychalcone (TMOC) i eggstokkreft celler. Vi fant at TMOC hemmet proliferasjonen og kolonidannelse av cisplatin sensitive cellelinje A2780 og resistent cellelinje A2780 /CDDP, så vel som kreft i eggstokkene cellelinje SKOV3 i en tids- og doseavhengig måte. Behandling av A2780-celler med TMOC resulterte i G
0 /G
en cellesyklus-stans gjennom nedregulering av cyclin D1 og CDK4, og den opp-regulering av P16, P21 og P27 proteiner. Vi demonstrerte at TMOC kan indusere celle apoptose ved å undertrykke Bcl-2 og Bcl-xL, men forbedrer ekspresjonen av Bax og spaltingen av PARP-1. Behandling av TMOC også redusert invasjon og migrering av A2780-celler. Til slutt har vi funnet at TMOC hemmet konstitutiv aktivering av STAT3 signalveien og indusert ekspresjon av tumor suppressor PTEN uavhengig av p53 status i cellelinjer. Disse dataene antyder at TMOC kan utvikles som en potensiell kjemoterapeutisk middel til å effektivt behandle visse kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene
Citation. Qi Z, Liu M, Liu Y, Zhang M, Yang G (2014) Tetramethoxychalcone, en chalcone Derivative, undertrykker spredning, blokker cellecyklusprogresjonen, og induserer apoptose av menneskelige eggstokkreft celler. PLoS ONE ni (9): e106206. doi: 10,1371 /journal.pone.0106206
Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan
mottatt: 16 april 2014; Godkjent: 03.08.2014; Publisert: 02.09.2014
Copyright: © 2014 Qi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er inkludert i papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 81071839 for M. Liu, og Nos 91129721 og 81372797 for G. Yang. ), av Kina Postdoktor Science Foundation (No. 2013M531126) for M. Liu, ved Shanghai Pujiang Program (11PJ1402200) fra Shanghai Municipal Government of China for G. Yang, og ved Doktor Fund of Ministry of Education of China (20120071110079 ) for G. Yang. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformen hos kvinner. På grunn av mangel på sensitive og spesifikke metoder for tidlig påvisning er nesten 60-70% av eggstokkreft pasienter diagnostisert på avanserte stadier [1], [2]. Til tross for fremskritt i behandling av kreft i eggstokkene, hovedsakelig involverer cytoreduktive kirurgi etterfulgt av platina-basert kjemoterapi, er fortsatt overlevelse av eggstokkreft pasienter svært lav [3]. Kliniske problemer, inkludert ervervet resistens overfor konvensjonelle kjemoterapi, så vel som metastatisk og invasive egenskapene til sykdommen er alvorlig svekket ved behandling suksess [4], [5]. Derfor den videre utvikling av nye terapeutiske midler for eggstokkreft, spesielt for platina resistente celler, er fortsatt haster.
Naturlig forekommende produkter fra ulike planter er alltid viktig i oppdagelsen av nye terapeutiske midler [6], [7]. For eksempel, Chalconderivater (molekyler som inneholder 1,3-difenyl-2-3propen-en-en-grupper), en av de store klassene av naturlige produkter med omfattende distribusjon i krydder, te, øl, frukt og grønnsaker, vise forskjellig interessant biologisk aktiviteter, inkludert anti-inflammatorisk, antimikrobiell, antioksidant, og antikreftegenskapene [8] – [10]. Nærmere bestemt, som en struktur etterligner av combretastatin A-4 (CA-4), 3 «, 4′, ble 5»-trimethoxychalcone rapportert å oppvise antimitotiske egenskaper som skyldes inhibering av tubulin polymerisering [11] -. [14]
i arbeidet med å oppdage cytotoksiske midler mot eggstokkreft celler, en serie med CA-4 relaterte forbindelser ble syntetisert og evaluert for sine anti-proliferative aktiviteter i human epitelial eggstokkreft cellelinje A2780
in vitro
(data ikke vist). Blant disse forbindelser, 4,3 «, 4′, 5»-tetramethoxychalcone (TMOC, fig. 1 A) hadde den høyeste hemmende potens mot A2780-celler. Imidlertid påfølgende
in vitro
analyser viste at TMOC ikke avbryte tubulin polymerisering (Fig. 1B), som indikerer at anti-kreft mekanisme av TMOC fremdeles gjenstår å bli belyst.
Materialer og metoder
Material
TMOC ble syntetisert i henhold til den forrige rapporten og ble bestemt av spektra inkludert
1 H-NMR,
13C-NMR, og høy oppløsning massespektrum (HRMS) som ble stor avtalt med litteratur [14], [15]. Renheten av TMOC var mer enn 98% som ble analysert ved HPLC.
RPMI-1640 medium og føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra Thermo Scientific (South Logan, UT, USA). MTT, propidium indide (PI), 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og antistoffet p-aktin ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Gentian fiolett ble kjøpt fra Solarbio (Beijing, Kina). Den Annexin V-FICT /PI apoptose deteksjon kit, invasjon kamre, Matrigel, og antistoffet til p21 ble anskaffet fra BD Biosciences (Franklin Lakes, New York, USA). Cellelyse buffer og BCA protein assay kit ble kjøpt fra Beyotime (Shanghai, Kina). PVDF membran og kjemiluminescerende reagenser var fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoffer mot cyclin D1, CDK4, p16, p21, BCL-XL, Bax, STAT3, p53, PTEN, c-myc var fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mot fosfor-Src (Tyr416), Src, fosfor-STAT3 (Tyr705) og spaltet-PARP-en ble kjøpt fra Cell Signaling Technology.
Cell kultur og transfeksjon
Den menneskelige epitelovarialcancer kreft cellelinjer A2780 og SKOV3 ble kjøpt fra ATCC. Den cisplatin resistent eggstokkreft cellelinje A2780 /CDDP ble vennlig levert av Prof. Ling Ya, Pan [16]. Udødeliggjort men pre-neoplastiske humane ovarie epitelceller T29 ble avledet fra eggstokk-overflate epiteliale cellelinjer IOSE-29 som tidligere beskrevet [17]. Celler ble rutinemessig dyrket med RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. For transfeksjon undersøkelser, ble celler transient transfektert med STAT3-CA (konstitutiv aktiv mutant, A661C og N663C) [18], [19], STAT3-DN (dominant negativ mutant, Y705F) [20] eller kontrollvektor ved hjelp Fugene HD ( Promega). De Stat3 konstruksjonene var gaver fra Dr. Hesham M. Amin (MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA).
In vitro
anti-spredning analysen
in vitro
anti-proliferativ aktivitet av TMOC ble målt ved MTT-reagenset, som beskrevet i litteraturen [21]. I korthet, 5 x 10
3-celler i 100 ul medium per brønn ble sådd ut i 96-brønners plater. Etter å ha inkubert i 24 timer ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TMOC eller DMSO (som negativ kontroll) i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Deretter ble mediet med forbindelsen eller DMSO erstattet med 200 ul friskt medium inneholdende (5 mg /ml i PBS) 10% MTT i hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Endelig ble det MTT-holdige medium fjernet og 150 ul DMSO per brønn ble tilsatt for å oppløse de formazankrystaller nydannede. Absorbansen til hver brønn ble bestemt med en mikroplateleser (Synergy H4, Bio-Tek) ved en bølgelengde 590 nm. Inhiberingsgraden av proliferasjon ble beregnet med den følgende ligning:
kolonidannelse assay
5 x 10
2-celler per brønn ble sådd ut i seks-brønns plater ved en enkelt celletetthet. 48 timer senere ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TMOC eller DMSO (som negativ kontroll) i 48 timer. Deretter ble mediet erstattet med friskt medium for å tillate cellevekst i en uke. Cellene ble fiksert med metylalkohol i 15 minutter og farget med gentian fiolett i 30 min. Kolonier som består av mer enn 50 celler ble tellet.
cellesyklusanalyse
Cell syklusstatus ble detektert ved strømningscytometri ifølge en tidligere publisert metode [22], og ble analysert ved Multicycle AV ( for windows, versjon 320) programvare. I korthet ble cellene først behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TMOC eller DMSO i 24 timer og deretter høstet, vasket to ganger med 1 x PBS og resuspendert i 200 ul av 1 x PBS. Cellene ble fiksert i 4 ml is-kald 75% etanol ved -20 ° C natten over og farget med 500 ul PI (50 ug /ml, Sigma) som inneholder 0,1% RNase (1 mg /ml, Sigma) i 15 min i mørk tilstand ved romtemperatur. Cellene ble så analysert ved hjelp av strømningscytometri (Cytomics FC 500 MPL, Beckman Coulter). Resultatene ble angitt som middelverdier fra tre uavhengige bestemmelser.
Cell apoptose analyse
For å oppdage apoptose ble cellene inkubert med ulike konsentrasjoner av TMOC eller DMSO (som negativ kontroll) i 24 timer . Cellene ble høstet, vasket to ganger med kald 1 x PBS og resuspendert i 200 ul bindingsbuffer med en tetthet på 1 x 10
5 celler /ml. Cellene ble deretter farget med 5 ul Annexin V-og PI, i 15 minutter i mørke omgivelser ved romtemperatur og underkastet analyse ved strømningscytometri. Den tidlige apoptose ble evaluert basert på prosentandelen av celler med Annexin V + /PI-, mens sent apoptose var at celler med Annexin V + /PI +. Resultatene ble angitt som middelverdier fra tre uavhengige bestemmelser.
DAPI og PI farging
Nuclear morfologiske og membran integrert endring av apoptose ble bestemt ved DAPI og PI farging henholdsvis, som beskrevet tidligere [23 ], [24]. 3 x 10
5-celler ble sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i 48 timer, etterfulgt av behandling med fortynningsmiddel eller med ønskede konsentrasjoner av TMOC i 24 timer. For DAPI farging ble cellene vasket med PBS tre ganger, fiksert med mentol, og permeabilisert med 0,1% Triton X-100, etterfulgt av farging med DAPI (1:2000 fortynning i 1 x PBS) ved 37 ° C i 15 min i mørk. For PI farging ble cellene vasket med PBS tre ganger, og direkte farget med PI ved 37 ° C i 15 min i mørket. Etter farging ble cellene vasket med PBS for å fjerne ubundet fargestoff (PI) og observert ved anvendelse av fluorescerende mikroskopi (Olympus). Fluorescent bildene ble tatt opp med et avkjølt CCD-kamera.
sårtilheling analysen
For å oppdage cellemotilitet, celler ble sådd i 6-brønners plater og vokst til 90% samløpet. En enkelt scratch sår ble opprettet på monolagcellene ved hjelp av en steril mikropipette tips. Deretter medium med cellerester ble fjernet, og friskt serumfritt medium (uten FBS tilskudd) inneholdende forskjellige konsentrasjoner av TMOC eller DMSO ble tilsatt. Celler ble inkubert ved 37 ° C, og bilder av hvert såret monolaget ble tatt ved 0, 36 og 72 timer.
Transwell invasjon assay
celle invasjon ble analysert ved hjelp av kammer på forhånd belagt med matrigel [ ,,,0],25]. I korthet, 5 x 10
4 celler i 300 ul serumfritt RPM-1640 ble sådd inn i det øvre kammer. Kammeret ble plassert i en 24-brønns plate og de nedre brønnene inneholdt RPM-1640-medium med 10% FBS og forskjellige konsentrasjoner av TMOC eller DMSO (som en negativ kontroll). Etter 24 timer inkubering ble cellene på den øvre overflate av kammeret omhyggelig penslet med en bomullspinne. Cellene migrerte gjennom kammeret ble fiksert med metanol, farget med krystallfiolett og deretter telles fra 5 forskjellige områder fra hver brønn i henhold invertert mikroskop. Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Western blot-analyse
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TMOC eller DMSO (som en negativ kontroll) i 24 timer, og deretter ble høstet, vasket med kald 1 x PBS to ganger, lysert med cellelyseringsbuffer i 30 minutter på is og sentrifugert ved 12000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Konsentrasjonen av totalt protein ble bestemt ved BCA-proteinanalyse kit. Like mengder (30 pg per belastning) av proteinprøver ble underkastet SDS-PAGE-elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner som deretter ble blokkert i 10% ikke-fettmelk, og omsettes med primære antistoffer. Etter inkubasjon med det sekundære antistoffer konjugert med pepperrot peroksidase (HRP), ble proteinbåndene utviklet med de kjemiluminescerende reagensene.
Statistisk analyse
Dataene ble beregnet ved hjelp av Graph Pad Prism og uttrykt som midlere ± SE Verdiene av IC
50 ble montert ved anvendelse av en ikke-lineær regresjonsmodell med en sigmoid doserespons. Sammenligninger mellom kontroll og behandlede grupper ble bestemt av parvise
t
test eller enveis ANOVA etterfulgt av Tukey er flere sammenligningstester. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant på
p
. 0,05 nivå
Resultatene
TMOC undertrykker cellevekst
Vi først bestemt anti-proliferative effekter av TMOC på humane ovariekarsinom-celler, inkludert A2780 (p53 villtype), A2780 /CDDP (cisplatin resistente sublinje av A2780, p53-mutant) og SKOV3 (p53 null)-celler, så vel som pre-neoplastiske epitelceller ovarian T29 celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (som strekker 0,3125 til 40 uM) i TMOC i 24, 48 og 72 timer. Som vist på fig. 2A, behandling av A2780-celler med TMOC resulterte i en tilsvarende reduksjon av celleproliferasjon og levedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte. Lignende virkninger ble oppnådd ved behandling av A2780 /CDDP og SKOV3-celler (figur 2A). I motsetning til følsomheten av T29 celler til TMOC var mye lav, da konsentrasjonen av TMOC virkning T29-celler ble påvist ved 40 pM i 72 timer. IC
50-verdier ble beregnet og er oppført i tabell 1. Således, tyder disse data på at TMOC har en cytotoksisk effekt på ovarietumorceller uavhengig p53 status, men behandler mindre cytotoksisitet i pre-neoplastiske ovarian epitelceller. Videre har vi også testet anti-proliferative aktivitet av chalcon (1,3-difenyl-2-propen-1-on), som er mor forbindelsen med TMOC (tabell 1). Sammenlignet med TMOC, chalkon oppviste mye svak effekt på inhibering av både neoplastiske og pre-neoplastisk cellevekst, og presentert dårlig vannløselighet, noe som kan tyde på at de fire metyloksy grupper er viktig for anti-kreft aktivitet og fysiokjemiske egenskaper.
(A) TMOC hemmet celleproliferasjon i dose- og tidsavhengig måte. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyser. (B) Representative bilder av cellekolonier etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av TMOC i 24 timer. (C) Colony dannelseshastigheten etter behandling med TMOC i 24 timer.
I de følgende eksperimenter, bestemt vi effekten av TMOC på kolonidannelse evne ovarian cancer-cellelinjer. Kolonidannelsesbestemmelsen er en
in vitro
celleoverlevelse assay basert på evnen av en enkelt celle for å proliferere på ubestemt tid, for derved å beholde sin reproduktive evne til å danne en koloni som består av minst 50 celler. Kolonidannelse analysen er metoden for valg for å bestemme celle reproduksjons død etter behandling med cytotoksiske midler, og nå mye brukt for å bestemme cytotoksisiteten indusert av forskjellige kjemoterapeutiske midler [26]. I denne studien, som vist i fig. 2B, behandling av A2780, A2780 /CDDP og SKOV3-celler med TMOC i konsentrasjoner på 0,3125, 0,625, 1,25 og 2,5 uM i 48 timer doseavhengig inhibert kolonidannelse, sammenlignet med behandling med fortynningsmiddel (DMSO). Antallet kolonier dannet av celler behandlet med TMOC eller fortynningsmiddel ble sammenfattet i figur 2C, som bekreftet den inhiberte virkningen av TMOC på veksten av eggstokkreft celler.
TMOC induserer G
0 /G
en fase cellesyklus arrest
Kjemiske antitumormidler kan hemme celledeling gjennom induksjon av cellesyklus arrest. Derfor, for å forstå hvordan cellevekst ble inhibert av TMOC ble cellesyklusprogresjon analysert ved å kvantifisere DNA-innhold ved hjelp av flow cytometri. Vi behandlet A2780-celler med TMOC i 24 timer og undersøkt på DNA-innhold av propidiumjodid (PI) farging (fig. 3A). Som illustrert i fig. 3B, sammenlignet med kontrollceller som ble behandlet med fortynningsmidlet, da A2780-celler ble behandlet med høye konsentrasjoner av TMOC på 5, 10 og 20 uM, prosentandelen av celler i G
0 /G
1 fase ble hevet fra 42.3 % til 64,1%, og prosentandelen av celler i S og G
2 /M fase ble redusert samtidig. Fordi cellesyklusprogresjon blir regulert av cyclin /cyclin-avhengige kinase (CDK) komplekser, kan de ukontrollerte uttrykk av cykliner og /eller CDK føre til cellesyklus feilregulering og tumorigenesis [27]. Derfor undersøkte vi om TMOC påvirket cykliner eller CDK uttrykk. Som vist på fig. 3C, behandling av celler med TMOC nedregulert er uttrykk for cyklin D1 og CDK4, men oppregulert uttrykk for p16, p21
Cip1 og p27
Kip på en doseavhengig måte. Tatt sammen, kan de endrede uttrykk for celle cykliner og CDK-inhibitorer være assosiert med cellesyklus-stans forårsaket av TMOC.
(A) Cellesyklus fordeling etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av TMOC i 24 timer. (B) Kvantitativ analyse av TMOC-behandlede celler. (C) Regulering av cellesyklus assosierte proteiner i A2780 celler. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og et representativt eksperiment er vist. *
p
0,05, **
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
TMOC induserer cellulær apoptose
DAPI atomkjerner flekker ble anvendt for å visualisere apoptose indusert ved TMOC. Som vist på fig. 4A, ble atom apoptose av TMOC-behandlede A2780 celler preget av kondensert og fragmentert kromatin farget med sterke blå fluorescerende prikker, mens kontrollceller ble farget med uniform blå [24]. I tillegg ble apoptose også indikert ved farging med PI, en membranfunksjon atom fargestoff, slik som vist i fig. 4B. Disse resultatene indikerte at TMOC kan indusere cellulær apoptose. For ytterligere å bestemme antallet og fasen av apoptotiske celler, ble Annexin V-/PI dobbel farging anvendes til å kvantifisere antallet av apoptotiske celler behandlet med TMOC [22]. Som illustrert i fig. 4C og 4D, vil den totale andelen av celler farget med Annexin V + /PI
– (høyre nedre kvadrant representerer tidlig apoptose) og Annexin V
+ /PI
+ (øvre høyre kvadrant representerer sent apoptose og nekrose) celler ble økt fra 1,2% til 35,5% etter behandling av A2780-celler med TMOC på 5, 10 og 20 uM i 24 timer. Disse data bekreftet videre at TMOC kan sterkt indusere cellulær apoptose av eggstokkreft celler på en doseavhengig måte.
(A) DAPI kjerner farging ble anvendt for å visualisere apoptose indusert ved TMOC. Piler representerer de apoptotiske celler. Scale bar = 10 mikrometer. (B) PI opptaket ble analysert under et fluorescerende mikroskop. Scale bar = 50 mikrometer. (C) Representative flowcytometri-profiler av apoptose og (D) kvantitative resultater oppnådd ved anvendelse av Annexin V /PI farging. (E) Western-blots av apoptotiske relaterte proteiner. Analysen ble gjentatt tre ganger, og et representativt resultat er vist. *
p
0,05, **
p
0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
Deretter undersøkte vi signalveien involvert i TMOC indusert apoptose av. Western blot-analyse. Vi viste at (fig. 4E), TMOC oppregulert uttrykk for pro-apoptotiske proteiner Bax, men nedregulert uttrykk for anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-XL i en gjør avhengig måte. Videre, sammenlignet med kontrollceller, eksponering til TMOC indusert spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), en markør for celler som gjennomgår apoptose [28]. Disse resultatene antydet at TMOC kan indusere cellulær apoptose gjennom disse proteinene.
TMOC undertrykker celle migrasjon og invasjon
metastatisk spredning, en av funksjonene i eggstokkreft celler, er en viktig faktor for å lav overlevelse av pasienter [29], mens anti-kreftmidler kan ikke bare inhibere kreftcellevekst, men kan også stanse cellemetastaser. I denne studien, for å avgjøre om TMOC undertrykker invasjon og migrasjon i eggstokkreft celler, utførte vi sårheling og Transwell invasjons analyser. I sårheling analyse, etter en enkelt sår var riper på monolag av A2780-celler, ble mediet erstattet med serumfritt medium inneholdende TMOC eller fortynningsmiddel (som kontroll) for å unngå påvirkning av celleproliferasjon. Som vist på fig. 5A og 5B, migrering av celler ble signifikant redusert ved TMOC. Undertrykkelse av migreringen var ikke skyldes apoptose eller vekststans som konsentrasjonen av TMOC 0.5 uM eller 1 uM bare fremkalt en relativ lav toksisitet i A2780 celler. Resultatene oppnådd fra transwellanalyseresultatene viste at TMOC inhiberte invasjon og migrering av A2780-celler på en dose-avhengig måte (Fig. 5C og 5D).
(A) TMOC hemmet cellemigrering. Representative fotografier av cellene ble tatt ved 0, 36 eller 72 timer. (B) Kvantifisering av sårheling. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. (C) Representative fotografier av invaderende celler i Transwell invasive analyser. Scale bar = 20 mikrometer. (C) Kvantifisering av invasive A2780 celler. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. *
p
0,05, **
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
signalveier involvert i TMOC-mediert anti-kreft effekt
Signal transduser og aktivator av transkripsjon-3 (STAT3), et onkogen transkripsjonsfaktor, er ofte konstitutivt aktiv i humane kreftceller [18]. Nyere studier har vist at aktivering av STAT3 spiller en sentral rolle i overlevelse, hyper-spredning, og metastatisk progresjon av kreft i eggstokkene [30], [31]. Når den er aktivert, kan den fosforylerte STAT3 oppregulerer ekspresjonen av gener som apoptose-inhibitorer (BCL-xl, Bcl-2), cellesyklus regulatorer (cyklin D1) og onkogene transkripsjonsfaktorer (c-myc) i tumorgenese [32], [33]. Derfor benyttet vi western blot for å teste om undertrykkelse av STAT3 signalveien var involvert i TMOC-mediert anti-kreft effekt. Faktisk, som vist i fig. 6A, med økningen av TMOC konsentrasjon, fosforyleringen av STAT3, så vel som ekspresjon av c-myc, en kjent nedstrøms mål for STAT3 [33], [34], ble doseavhengig undertrykket i A2780, A2780 /CDDP og SKOV3 celler, mens ingen effekt på uttrykket nivåer av total STAT3 ble observert.
(A) TMOC behandling inhiberte STAT3 fosforylering og nedregulert nivået av c-myc på en doseavhengig måte. (B) A2780 og A2780 /CDDP celler ble transfektert med STAT3 konstitutivt aktiv (S3-CA) plasmid, STAT3 dominant negativ (S3 DN) plasmid eller kontroll vektor. (C) Innføring av S3-CA signifikant blokkerte anti-proliferativ aktivitet av TMOC. I kontrast, innføring av S3-DN sensibilisert kreftcellene til TMOC behandling. (D) TMOC hemmet c-Src-kinase fosforylering og oppregulert tumoren surpressor PTEN i alle tre cellelinjer, men bare opp-regulert p53 i A2780 celler. β-aktin ble benyttet som en lik lasting kontroll. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og et representativt eksperiment er vist. *
p
0,05, **
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
For å bekrefte rollen STAT3 i TMOC-indusert cytotoksisitet videre, vi transfektert A2780 og A2780 /CDDP-celler med STAT3 konstitutivt aktiv (S3-CA) plasmid, STAT3 dominant negativ (S3-DN) plasmid eller vektor kontroll, henholdsvis, og deretter bestemmes den anti-proliferative effekt av TMOC på de transfekterte cellene. Som vist på fig. 6C, innføring av S3-CA betydelig resecued anti-proliferativ effekt av TMOC. I kontrast, innføring av S3-DN sensibilisert kreftceller til å TMOC behandling. Til sammen tyder disse data på at TMOC kan utløse sin anti-kreft-aktivitet ved å hemme STAT3 signalveien.
Flere studier har vist at konstitutiv aktivering av STAT3 blir ofte trigget av den ikke-reseptor-tyrosinkinase c-Src og negativt reguleres av tumor-suppressorer p53 og PTEN [35], [36]. Dermed har vi også undersøkt om TMOC kunne undertrykke aktivering av c-Src kinase og modulere uttrykk av p53 og PTEN i de tre eggstokkreft cellelinjer. Som vist på fig. 6D, har vi funnet at TMOC doseavhengig inhibert fosforylering av c-src kinase, mens det totale nivå av c-src forble uendret. I mellomtiden, TMOC oppregulert uttrykket nivåer av PTEN i alle tre cellelinjer, men bare opp-regulert p53 i A2780-celler.
diskusjon
I et forsøk på å utvikle nye kjemoterapeutika med mindre skadelige bivirkninger for å behandle kreft, naturlige produkter og deres syntetiske analoger har fått stor oppmerksomhet [37]. For eksempel har mange studier vist at flere Chalcone forbindelser, både hentet fra naturen og syntetiske versjoner, utstillings cytotoksiske og antitumor aktivitet [38]. I denne studien, beregnet vi å undersøke anti-kreft-aktivitet og den underliggende mekanisme for TMOC, en syntetisk chalconforbindelse forbindelse, ovarie cancer-cellelinjer. Vi viste at TMOC vesentlig hemmet proliferasjonen og kolonidannelse av A2780, A2780 /CDDP og SKOV3-celler (fig. 2), noe som tyder på at TMOC kan være et effektivt kjemoterapeutisk middel mot både cisplatin sensitive og resistente eggstokkreft celler. Viktigere, fant vi at TMOC utstilt mindre toksisitet til pre-neoplastiske menneskelige eggstokkene epitelceller enn å neoplastiske celler under samme konsentrasjon.
Vi fant at TMOC indusert G
0 /G
en cellesyklus arrest gjennom nedregulering av cyclin D1 og CDK4, og den opp-regulering av P16, P21 og P27-proteiner (fig. 3C). Cyklin D1 /CDK4-komplekset er ansvarlig for cellesyklusprogresjon i begynnelsen G
1 fase og er ofte overuttrykt i forskjellige humane karsinomer inkludert eggstokk-kreft [39] – [41]. Det p16-proteinet er en spesifikk hemmer av CDK-cyclin D kompleks, hindrer fosforyleringen av Rb og cellesyklus gjentatt innkjøring i G
0 /G
en fase [39]. p21 og p27, som tilhører Cip /Kip familie, negativt regulerer cellesyklusprogresjon ved å hemme CDK-komplekser cyklin [42].
Apoptose er normalt et balansert system strengt regulert ved hjelp av anti-apoptotiske og pro- apoptotiske effektorer, inkludert proteiner av Bcl-2-familien. Den anti-apoptotiske proteiner BCL-2 og Bcl-XL fremme celle overlevelse mens pro-apoptotiske proteiner Bax induserer programmert celledød. Forholdet Bax /Bcl-2 er kritisk for induksjon av apoptose, og bestemmer hvorvidt cellene vil gjennomgå apoptose [43]. I denne studien, TMOC behandling resulterte i økningen av Bax, men førte til nedgang på Bcl-2 og Bcl-xL (fig. 4E). Økningen av forholdet Bax /BCL-2 0,07 til 1,90 kan være ansvarlig for samtidig apoptose på grunn av avbrudd i mitokondrie membran potensial og inaktivering av viktige cellulære proteiner som PARP-1.
Akkumulerende studier tilveiebringe et sterkt bevis på at det STAT3 aktiveringen har vært forbundet med en rekke tumorer, inkludert multippel myelom, eggstokk-kreft, brystkreft, prostatakreft, og så videre [44]. Dermed har undertrykkelse av STAT3 signalveien dukket opp som en effektiv måte for kreftterapi. I foreliggende undersøkelse viser resultatene fra Western blots viste at fosforylering av STAT3 og dens oppstrøms-protein-tyrosin-kinaser c-Src (fig. 6A og 6D) ble inhibert med TMOC, som også ble støttet av den nedregulering av den transkripsjonelt regulert mål som cyclin D1, BCL-xL og c-myc [33]. Dessuten, identifiserte vi at TMOC kunne oppregulerer ekspresjonen av PTEN i alle tre cellelinjer, men bare opp-regulert ekspresjon av p53 i A2780 celler. Selv er p53 rapportert til negativt regulere fosforylering og DNA-bindende aktivitet av STAT3 gjennom tilrettelegging tumor suppressor PTEN [36], [45], våre data viste at TMOC fremkalte anti-spredning funksjon og hemmet fosforylering av STAT3 uavhengig p53 status, noe som kan tyde på at anti-kreft aktivitet av TMOC er p53-uavhengig.
i konklusjonen, gir vi sterke bevis for at TMOC hemmer cellevekst og bevegelighet, og induserer cellesyklus og apoptose av menneskelige eggstokkreft celler gjennom undertrykke STAT3 og c-Src aktivering. Imidlertid kan videre studier være nødvendig for å validere den potensielle anvendelse av TMOC i kreftbehandling.
