Abstract
metastaser til leveren er en viktig faktor i kolorektal kreftdødelighet. Tidligere studier tyder på at kronisk psykologisk stress er viktig i kreft progresjon, men dens effekt på levermetastaser er ikke undersøkt. For å løse dette, vi etablert en levermetastaser modell i BALB /c nakne mus for å undersøke hvilken rolle kronisk stress i levermetastaser. Våre data tyder på at kronisk stress løfter katekolaminer nivåer og fremmer levermetastaser. Kronisk stress var også assosiert med økt tumorassosierte makrofager infiltrering inn i primærtumor og økt ekspresjon av metastatiske gener. Interessant, β-blokker behandling snudd effektene av kronisk stress på levermetastaser. Våre resultater tyder på at β-adrenerge signalveien er involvert i regulering av kolorektal kreft progresjon og levermetastaser. I tillegg sender vi at tilleggsbehandling med en β-blokker kan utfylle eksisterende kolorektal kreft terapi
Citation. Zhao L, Xu J, Liang F, Li A, Zhang Y, Sun J (2015) Effekt av kronisk psykologisk stress på levermetastaser av tykktarmskreft hos mus. PLoS ONE 10 (10): e0139978. doi: 10,1371 /journal.pone.0139978
Redaktør: Obul Reddy Bandapalli, Universitetet i Heidelberg, Tyskland
mottatt: May 30, 2015; Godkjent: 18 september 2015; Publisert: 07.10.2015
Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation (81403350) og uavhengige innovasjon prosjekt Putuo (2012PTKW004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den samlede forekomst og dødelighet av tykk- og endetarmskreft (CRC) er redusert på grunn av tidlig diagnose og nye terapeutiske metoder [1]. Imidlertid gjenstår levermetastaser fortsatt en stor utfordring i å forlenge overlevelse. Om 50 ~ 60% av pasientene utvikler levermetastaser, som har dårlig forventede resultater. I tillegg har dagens terapeutiske strategier er ikke effektive [2]. Kirurgisk reseksjon er den eneste mulige kurativ behandling for CRC levermetastaser. Det er imidlertid begrenset av indikasjon og kontraindikasjon, og bare 10 ~ 20% av pasienter med levermetastaser få kirurgisk behandling. Prognosen for pasienter med ubehandlet levermetastaser er dårlig, og forventet en-års overlevelse er mindre enn 30% [3-4]. For å redusere sykelighet og forbedre prognose, er det viktig å utvikle nye behandlingsformer. Interessant, epidemiologiske studier tyder på at behandling med propranolol (en ikke-selektiv β-blokker) reduserer risikoen for enkelte krefttyper, inkludert CRC [5-8].
Nyere studier tyder på at en distressed følelsesmessige tilstand er en potensiell risikofaktor for kreft progresjon. Som kreftdiagnose kan forårsake store plager, pasienter ofte opplever frykt, angst og depresjon [9]. Disse signalene kan aktivere spennings trasé, inkludert hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen og sympatiske nervesystemet (SNS), og lokke fram fysiologiske responser. Disse banene kan produsere signalstoffer og hormoner som endrer svulsten mikromiljøet.
katekolaminhormoner hormoner, inkludert noradrenalin (NE) og adrenalin (E), er forhøyet under stress, og spiller en nøkkelrolle i den stressrespons. Disse hormonene aktiverer reseptorer på tumorceller og regulerer en lang rekke biologiske funksjoner som er involvert i kreftutvikling, inkludert cellulær proliferasjon, migrering, invasjon, og angiogenese [10-12]. Aktiveringen av β
2-AR signalveien indusert av katekolaminer hormoner spiller en nøkkelrolle i kreft progresjon [13, 14].
Tidligere studier tyder på at stresshormoner-indusert CRC celleproliferasjon er -adrenoseptor avhengig og at kronisk stress kunne fremme tumorvekst av subkutant implanterte tykktarm carcinoma-celler i en naken mus modell gjennom β-AR signalveien [15, 16]. Vi antok at kronisk stress ville fremme CRC metastaser til leveren. Her undersøker vi hvordan kronisk stress påvirker levermetastaser ved hjelp av en
in vivo
metastatisk modell av tykktarmskreft, og avgjøre om β-AR signalveien er nødvendig for utviklingen av CRC.
Materialer og metoder
Cell kultur og dyr
Menneskelig tykktarmskreft cellelinje, HT-29, ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences. HT-29 ble dyrket i McCoy’5A medium (Invitrogen), supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Fire uker gamle hann BALB /c nu /nu-mus ble innkjøpt fra Shanghai SLAC Experimental Animal Co., Ltd (lisens No: SCXK [Hu] 2012-0002) og holdt under SPF tilstand. Alle prosedyrer utført ble godkjent av forsøk med dyr Ethics Committee of Putuo Hospital tilknyttet Shanghai Universitetet i tradisjonell kinesisk medisin.
levermetastaser modell
Mus ble injisert med HT-29 tykktarm kreft celler i milt å produsere levermetastaser. Musene ble bedøvet med 2,5% pentobarbitalnatrium ved peritoneal injeksjon. Etter steriliseringen av huden i området kirurgi, ble en abdominal innsnitt parallelt med venstre marg subcostal laget. Tumorceller (1 x 10
7) i 100 pl fosfatbuffret saltløsning ble injisert inn i milten ved hjelp av en 29 G nål. Etter å ha trykket pinhole 1-2 min med aseptiske bomullspinner for å hindre at cellene fra å lekke ut, ble returnert milt inn i bukhulen. Såret ble lukket med 5-0 Vicryl sting
Kronisk stress og Drug Administration protokoll
Mus ble randomisert inn i 6 grupper. Blank-Control (BC, n = 10), Blank- Stress (BS, n = 10), Propranolol-Control (PC, n = 10), Propranolol-Stress (PS, n = 10), ICI118,551-Control (IC, n = 10) og ICI118,551-Stress ( IS, n = 10). Mus i stress gruppene opplevde fysisk tvang i 6 timer per dag i 35 dager med oppstart 7 dager før tumorcelle injeksjon. Alle musene ble avlivet 28 dager etter tumorcelle-injeksjon, og milten og leveren ble høstet og veiet.
p-adrenerge antagonist-studier, (±) -propranolol hydroklorid (en ikke-selektive β-blokkere, 10 mg /kg /dag, Sigma, P0884) og ICI118,551 (en selektiv β
2-blokkere, 25 pm /30 ul, Sigma, I127) [17] ble levert til mus subkutant ved osmotisk minipumpe (Alzet, Model 1004). Legemidlene ble gitt for varigheten av forsøket påbegynt 7 dager før tumorcelle-injeksjon (figur 1).
(A) Mus i stress grupper ble fastholdt i en spesiell plass som hindret dem i å bevege seg fritt. (B) Mus i stress gruppene opplevde fysisk tvang i 6 timer per dag i 35 dager med oppstart 7 dager før tumorcelle injeksjon. En β-adrenerg antagonist ble gitt subkutant ved osmotisk minipumpe. Legemiddeleksponering ble opprettholdt gjennom hele forsøket. HT-29 celler ble injisert inn i milten på dag 0.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
tjueåtte dager etter tumorcelle-injeksjon ble musene avlivet, og blod ble høstet fra øynene og umiddelbart plassert i rene heparin-belagt Eppendorf-rør. E og NE konsentrasjoner i serum ble målt ved ELISA (R 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Kronisk stress-indusert β-adrenerge reseptor aktivering mediert levermetastaser
HT-29 celler (1 x 10
7) var injisert inn i milten hos 60 mus for å etablere levermetastaser og avlivet 28 dager etter tumorcelle-injeksjon for analyse. Alle musene som gjennomgikk tumorinjeksjon i milten utviklet levermetastaser. Representative bilder av milt og lever metastatisk er vist i figur 2A og 2B. For å undersøke rollen til kronisk stress på primærtumorvekst og levermetastaser, evaluerte vi vekten av milt og lever. Kronisk stress økt miltvekt med 20,61% (BC
vs
BS:.. 0,13 ± 0,01 g
vs
0,15 ± 0,01 g,
P
= 0,1784), og ble det observert en signifikant økning i levermetastaser hos mus eksponert for kronisk stress (1,6 ganger endring. 2,73 ± 0,16 g i BC gruppe
vs
4,30 ± 0,27 g i BS gruppe,
P
0,0001, figur 2C). Disse funnene tyder på kronisk tilbakeholdenhet stresset fremmer levermetastaser.
(A) Representative bilder av milt tatt på dag 28 etter tumorcelle injeksjon. (B) Representative bilder av metastatisk lever tatt på dag 28 etter tumorcelle injeksjon. (C) data representerer gjennomsnittlige miltvekt fra de seks gruppene. (D) data representerer gjennomsnittlig levervekt fra de seks gruppene. **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe.
Som tidligere studier antydet at kronisk stress akselerert kreft progresjon gjennom β-adrenerge signalering, behandlet vi mus med propranolol eller ICI118,551 å hemme β-adrenerge signalering. Som vist i figur 2D, β-blokker behandling reduserte levermetastaser indusert av kronisk stress. Sammenlignet med mus i BS-gruppen, mus i PS, og er gruppene hadde færre levermetastaser. De metastatisk levervekt av mus i PS og IS grupper var betydelig lavere enn de av mus i BS gruppe (PS
vs
BS:. 3,46 ± 0,28 g
vs
4,30 ± 0,27. g,
P
= 0,0482; IS
vs
BS: 3,35 ± 0,28 g
vs
4,30 ± 0,27 g,
P
= 0,0265).. . Vi observerte ingen signifikant forskjell i levermetastaser mellom propranolol og ICI118,551 behandling (
P
0,05).
Kronisk stress up-regulerer katekolaminer nivåer
Et sentralt trekk av den kroniske stressrespons er opp-regulering av adrenerge stressrespons veien, noe som resulterer i vekttap og økte nivåer av katekolaminer [19]. Psykologisk stress ble bekreftet av vekt miste (Fig 3A) og eksponering for kronisk stress betydelig økt serumnivå av NE med 30,25% (BC
vs
BS. 101,5 ± 1,78 ng /L
vs
. 132,2 ± 2,51 ng /L,
P
0,0001, figur 3B), og moderat økt serumnivåer av E ved 14,24% (BC
vs
BS. 37,43 ± 1,76 mg /L
vs
. 42.76 ± 1.82 mg /L,
P
= 0,047, figur 3B). HPLC-ECD analyse av milt svulstvev viste signifikant økning av E med 18,3 ganger (BC
vs
BS:.. 5,657 ± 1,613 pg /mL
vs
103,4 ± 25,08 pg /mL,
P
= 0,0177, figur 3C og 3D).
(A) kroppsvekt ble overvåket gjennom hele forsøket. HT-29 celler ble injisert inn i milten på dag 0. (B) Data representerer gjennomsnittlig serumnivåer av NE og E i BC og BS-gruppe, *
P
0,05 versus BC gruppe, **
P
0,01 versus BC gruppe. (C) Representative bilder av HPLD-ECD fingeravtrykk av katekolaminer nivåer i milten tumorvev i BC og BS gruppe. (D) Data representerer gjennomsnittlig nivå av NE og E i milten svulstvev i BC og BS gruppe, *
P
0,05 versus BC gruppe.
Effekt av β-adrenerge signalveien på tumormikromiljøet
Tidligere forskning indikerte at β-adrenerge signale regulerer svulsten mikromiljøet ved å rekruttere eller endre aktiviteten til tumor -associated makrofager [20]. For å bestemme hvorvidt kronisk stress påvirker tumor-mikromiljøet, brukte vi strømningscytometri for å kvantifisere cellesammensetningen i HT-29 primærtumorer høstet fra milten.
Som vist i figur 4A, kronisk stress øket CD11b
+ F4 /80
+ makrofager infiltrasjon (4,2 ganger endring. 2,79 ± 0,43% av levende celler i BC gruppe
vs
10,33 ± 1,01% i BS gruppe,
P
= 0,0023 fig 4B). Kronisk stress også økt M-MDSCs infiltrasjon med 2,4 ganger (BC
vs
BS:.. 17.15 ± 0.38% av levende celler
vs
35,51 ± 4,27%,
P
= 0,0128, figur 4C og 4D). Kronisk stress primært-indusert rekruttering av tumorassosierte makrofager og M-MDSCs til den primære svulsten, som G-MDSCs var ikke tilstede (
P
0,05). For å bekrefte at tumor assosiert makrofager og M-MDSCs infiltrasjon ble formidlet av β-adrenerge signalveien, analyserte vi cellen sammensetningen av milt svulstvev høstet fra stresset mus behandlet med propranolol eller ICI118,551. Som vist i figur 4, β-blokker behandling betydelig avskaffet CD11b
+ F4 /80
+ makrofager befolknings i primærtumorvevet (PS
vs
BS:. 6,71 ± 0,57% av levende celler
vs
10,33 ± 1,01%,
P
= 0,0353; IS
vs
.BS:. 6,60 ± 0,68% av levende celler
vs
. 10.33 ± 1.01%,
P
= 0,0374). Men ingen betydning ble observert i CD11b
+ Gr
loLy6C
hi MDSC populasjoner (PS
vs
BS. 28.08 ± 0.80% av levende celler
vs
. 35,51 ± 4,27%,
P
= 0,2722; IS
vs
.BS:. 26.77 ± 0.57% av levende celler
vs
35,51 ± 4,27%,
P
= 0,2116).
(A) CD11b
+ F4 /80
+ celler ble kvantifisert ved flowcytometri i HT-29 primære milt svulster høstet 28 d etter injeksjon. (B) data representerer gjennomsnittet CD11b
+ F4 /80
+ sammensetningen i tumorer høstet fra milten. **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe. (C) MDSCs ble kvantifisert ved flowcytometri i HT-29 primær milt tumorer høstet 28 dager etter injeksjon. (D) data representerer gjennomsnittet CD11b
+ Gr
loLy6C
hi sammensetningen i tumorer høstet fra milten. *
P
0,05 versus BC gruppe.
Effekt av β-adrenerge signalveien på levermetastaser
Tidligere studier tyder på at kronisk stress endrer svulsten mikromiljøet og kan bidra til kreft metastaser
i vivo product: [21]. For å bestemme hvorvidt kronisk stress fremmet levermetastaser, undersøkte vi ekspresjon av TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF i milt tumorer ved RT-PCR og Western blot-analyse. Vi fant ut at TGF-β (9,4 ganger økning,
P
= 0,0040), IL-6 (7,6-dobling,
P
= 0,0005), PTGS2 (8,1 ganger økning,
P
= 0,0002), MMP-9 (9,4 ganger økning,
P
= 0,0081), og VEGF (7,6 ganger økning,
P
= 0,0005) mRNA ekspresjon betydelig øket i mus i BC gruppen sammenlignet med mus i BS-gruppen. Mus behandlet med betablokkere hadde signifikant redusert TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF-mRNA uttrykk i milt tumorer sammenlignet med mus i gruppen BS (fig 5A). Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom propranolol og ICI118,551 behandlinger (
P
0,05).
(A) mRNA uttrykk av TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9 og VEGF i forhold til mus i BC gruppe i milt svulster **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe,
##
P
0,01 versus BS gruppe. (B) Protein ekspresjon av TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF i milt tumorer. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
Vi har også observert øket protein ekspresjon av TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF-protein i mus eksponert for kronisk stress, som var opphevet ved behandling med betablokkere (figur 5B).
Tidligere studier tyder på at kronisk psykologisk stress fremmer metastase ved oppregulering av tumor neovaskularisering og vev invasjon. Her viser vi at VEGF, CD31, og MMP9 protein expression økninger i levervevet indikerer angiogenese og invasjon. Expression øker betydelig hos mus i BS gruppen sammenlignet med mus i BC gruppe (VEGF: økt 2,5 ganger,
P
= 0,0014, CD31: 2,1-dobling,
P
= 0,0004, MMP9: 2,2-dobling,
P
= 0,0028). Hemming av β-adrenerge signale redusert VEGF (PS
vs
BS:.. 0,3091 ± 0,04158
vs
0,5340 ± 0,04043,
P
= 0,0179; IS
vs .
BS. 0,2854 ± 0,02639
vs
0,5340 ± 0,04043,
P
= 0,0067), CD31 (PS
vs
BS. 0,3053 ± 0,03593
vs
0,4333 ± 0,01677,
P
= 0,0320; IS
vs
BS: 0,3040 ± 0,02751
vs
0,4333 ± 0,01677,
P..
= 0,0160) og MMP9 (PS
vs
BS:.. 0,3338 ± 0,01203
vs
0,5277 ± 0,04289,
P
= 0,0121; IS
vs
BS. 0,3187 ± 0,01987
vs
0,5277 ± 0,04289,
P
= 0,0115) protein uttrykk (fig 6).. Til sammen tyder våre resultater at aktivering av β-adrenerg signalering er nødvendig og tilstrekkelig for å forbedre tumor angiogenese, invasjon og metastasering i nærvær av kronisk stress.
(A) leveren metastatisk tumorprøver ble farget for VEGF med immunhistokjemi. (B) leveren metastatisk tumorprøver ble farget for CD31 ved immunhistokjemi. (C) leveren metastatisk tumorprøver ble farget for MMP9 ved immunhistokjemi. Alle bildene ble tatt på 200 ×. (D) Mean optisk tetthet (OD) av VEGF, CD31, og MMP9 i metastatisk leversvulster fra mus i BC, PC, IC, BS, PS, og IS grupper. **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe,
##
P
0,01 versus BS gruppe.
Til sammen våre funn tyder på at kronisk stress fremmer CRC levermetastaser gjennom β-adrenerge signalering, og understreker viktigheten av svulsten mikromiljøet i regulering tumorcelle invasjon.
diskusjon
til tross for forbedringer i omfattende terapi for CRC, klinikere står overfor utfordringer i å behandle pasienter med levermetastaser på grunn av begrenset effekt. I denne studien fant vi at kronisk stress økt vekst og metastasering av CRC gjennom β-adrenerge signale (Fig 7).
β-adrenerge signale betydelig forbedret tumorcelle spredning til leveren, og farmakologisk hemming av β- adrenerge signale redusert levermetastaser. Våre studier tyder også på at propranolol kan utfylle eksisterende terapeutiske strategier for å bremse eller hindre levermetastaser fra CRC, bedre overlevelse av pasienter som lider psykisk stress.
Den negative virkningen av kronisk stress på utfallet av kreft er godt etablert. Kronisk stress aktiverer SNS og HPA-aksen for å oppmuntre til frigjøring av katekolaminer, og videre regulere svulsten mikromiljøet og påvirke tumorprogresjon [19]. Katekolaminer er potente stimulatorer av vaskularisering. Tidligere studier viser at kronisk restraint stress fører til økte nivåer av vev katekolaminer og forbedret tumor angiogenese gjennom regulering av VEGF og MMP uttrykk [22]. I tillegg, betablokkere hadde blitt vist å reversere stress-forbedret angiogenese [23]. Andre studier viser at kronisk stress forhøyet stresshormoner som øker CRC vekst
in vivo product: [16]. Her utvider vi på disse studiene ved å undersøke rollen av katekolaminer i CRC metastaser til leveren. Våre resultater viser at kronisk stress betydelig løfter E og NE nivåer i serum og svulstvev.
For å finne ut om kronisk stress var tilstrekkelig til å regulere angiogenese
in vivo
, kartla vi blodåre tetthet av levermetastatisk tumor gjennom VEGF og CD31 farging og fant en signifikant økning angiogenese i stressede mus, henholdsvis. I samsvar med tidligere studier som viser at SNS regulerer angiogenese, tyder våre data β-blokker behandling opphevet stress indusert vaskularisering. Vi viser også at kronisk stress eksponering regulerer MMP9 uttrykk i leveren metastatisk tumor. Samlet våre data tyder på at β-adrenerge signale regulerer både svulst vascularization og invasjon.
Kronisk stress kan også endre svulsten mikromiljøet og fremme tumorprogresjon ved å undertrykke verten immunitet [2, 24]. TAMs og MDSCs er to store immunsuppressive celler i svulsten mikromiljøet. TAMs undertrykke anti-tumorigene immunceller, og dermed fremme metastase [25]. Imidlertid har de mekanismen for TAMs engasjement i levermetastaser ved eksponering for kronisk psykisk stress ikke blitt definert. MDSCs også akkumuleres hos pasienter som rapporterer høye nivåer av psykologisk stress [26-27]. Våre data bekrefter tidligere funn om at kronisk stress former svulsten mikromiljøet ved å rekruttere flere makrofager og MDSCs i primærtumor, som kan legge til rette for metastasering.
Våre data viser at eksponering for kronisk stress vesentlig endrer den primære svulsten mikromiljøet, noe som kan legge til rette for spredning til fjerntliggende organer. Viktigere, kan farmakologisk inhibering av β-adrenerg signalering være en ny strategi for å minimalisere CRC metastaser i leveren. Våre resultater er konsistente med epidemiologiske funn som knytter bruken β-blokker til redusert metastaser og tykktarmskreft dødelighet [28, 29]. Våre data øker spennende muligheten for at β-blocker behandling kan være en ny strategi for forvaltning av kronisk stress hos pasienter med CRC. I tillegg våre funn markere betydningen av å vurdere pasientens psykologi i utviklingen av nye terapeutiske tilnærminger for å begrense kreft progresjon og redusere metastatisk priser CRC.
Takk
Forfatterne takker tekniker Yuejin Gao ved divisjon av forsøksdyrlære i Putuo Hospital tilknyttet Shanghai Universitetet i tradisjonell kinesisk medisin for utmerket veiledning om dyreforsøk og mus omsorg.
