Abstract
Bakgrunn
Withaferin A, som er en naturlig avledet steroid lakton, har vist seg å forhindre angiogenese og metastasering i ulike tumormodeller. Det har også blitt anerkjent av ulike grupper for fremtredende anti-kreftfremkallende roller. Men på tross av disse studier på withanolides, deres detaljerte anti-metastatisk virkningsmekanismen forble ukjent. Den aktuelle studien har klar til å løse maskiner involvert i invasjonen regulering av stabilt derivat av Withaferin A, 3-azido Withaferin A (3-azidoWA) i humane cervical HeLa og prostata PC-3 celler.
Metoder og Principal funn
under~~POS=TRUNC giftig konsentrasjon av 3-azidowithaferin A (3-azido WA) hemmet kreft celle motilitet og invasjon i sårheling og Boyden kammer invasjon ved å undertrykke MMP-2 aktivitet i gelatin zymografi og dens uttrykk har vist seg å være et stort hinder i chemo-følsomhet. Vi har avdekket en ny mekanisme for 3-azidoWA indusert ekstracellulære pro-apoptotiske kandidat tumor suppressor Par-4 protein stimulering i kondisjonert medium og la også merke til en samtidig markert reduksjon i Pakt og perk signale av immunoblot analyse. Videre våre Zymografi resultater tyder 3-azidoWA indusert MMP-2 hemming ble formidlet gjennom sekretorisk Par-4. Hemming av apoptose ved 3-azidoWA kunne ikke gjenopprette MMP-2 gelatinase aktivitet. I tillegg til dette, vår
in vivo
dyre eksperimenter data viste 3-azidoWA opphevet neovaskularisasjon doseavhengig måte i mus Matrigel plugg analysen.
Konklusjon /Betydning
For dette rapporten, fant vi at 3-azidoWA trykt motilitet og invasjon av HeLa og PC-3 celler i MMP-2 avhengig måte. Vår
in vitro
resultatet antyder sterkt at sub-giftig doser av tre-azidoWA forbedret sekresjon av ekstracellulære Par-4 som avskaffet sekretorisk MMP-2 uttrykk og aktivitet. Nedbryting av sekretorisk Par-4 restaurert MMP-2 uttrykk og invasjon evnen til HeLa og PC-3 celler. Videre våre funn underforstått at 3-azidoWA svekket intern fosfor-ERK og fosfor-Akt uttrykk på en doseavhengig måte kan spille en nøkkelrolle i hemming av mus angiogenese ved 3-azidoWA
Citation. Rah B, Amin H, Yousuf K, Khan S, Jamwal G, Mukherjee D, et al. (2012) A Novel MMP-2-hemmer 3-azidowithaferin A (3-azidoWA) opphever Cancer Cell Invasion og angiogenese ved Moduler ekstracellulær Par-4. PLoS ONE 7 (9): e44039. doi: 10,1371 /journal.pone.0044039
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: May 23, 2012; Godkjent: 01.08.2012; Publisert: 04.09.2012
Copyright: © Rah et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ekstracellulære sekretoriske veier anses å spille sentral rolle i. menneskets fysiologi. Kroppens vitale hormoner og vekstfaktorer skilles og de kontrollerer utvikling og differensiering av organer i normal fysiologisk tilstand. Likeledes, systemiske (ekstracellulære) proteiner tilskriver stor
in vivo
funksjon under vev vekst og apoptose [1]. Prostata apoptotisk respons 4 (Par-4) er ubikvitært uttrykt og evolusjonær konservert pro-apoptotiske protein hvis ekspresjon var hovedsakelig korrelert med de celler som gjennomgår apoptose på grunn av eksogene fornærmelser [2]. Bortsett fra dens intracellulære funksjon, har den nye perspektiv av ekstracellulær sekresjon i forskjellige kreftceller forsterkes den terapeutiske potensialet av Par-4 [3]. Nylig, Burikhanov et al. har vist at pattedyrceller generelt forårsaket utskillelse av Par-4. Imidlertid apoptotisk induksjon ved ekstracellulær Par-4 forekommende via celle- overflate GRP-78 ble funnet å fremme celleinvasjon og tumorigenesis [3]. Stabilisering av pro-angiogen GRP-78 ved Par-4 er blitt betegnet et anti-invasiv rolle av ekstracellulær Par-4.
Metastase er en flertrinnsprosess som involverer cellemigrering og pericellulær proteolyse av ECM som formidler kreftceller utvekst [4]. Matriks-metalloproteinaser (MMP) er ansvarlig for nedbrytning av miljø barrierer, slik som den ekstracellulære matriks og basalmembran [5], [6]. Blant de MMP-familien, MMP-2 og -9 er generelt ansett for å være den ondartede sykdom av forskjellige tumorer, så vel som dårlig prognose av mange kreftformer [6]. Dermed MMP-er er i stand til å spalte type IV basalmembran kollagen (MMP-2 og -9) og øke verdien for legemiddelutvikling. Overbevisende prekliniske studier fra ulike laboratorier har gitt overveldende støtte for direkte sammenheng mellom MMP-2 over uttrykk og tumorinvasjon /metastase [7], [8]. Under utviklingsfasen, mange av MMP-inhibitorer sviktet i den tidlige fase kliniske studier på grunn av utstrakt homologi mellom katalytiske domener av MMP’er. Videre ble de fleste av de syntetiske /semi-syntetiske hemmere av MMP er trukket tilbake i kliniske studier på grunn av uforutsett lang sikt narkotika intoleranse redusert narkotika compliance [9]. På den annen side, nylig, naturlige produkter og naturlige produktderivater er blitt betraktet som ekstremt potensiale til å oppheve MMP-2 og -9 mediert invasjon /metastase enten
in vitro
eller
in vivo
konfigurert . Disse inkluderer vandige ekstrakt kanel [10], grønn te ekstrakt [11], curcumin [12], og steroide saponin fra bukkehornkløver [4], chitooligosacharides (COS) fra marine naturprodukter [13].
Withaferin A (WFA) er en prototype av withanolide klasse av naturlige produkter som viser ulike farmakologiske aktiviteter, blant annet antitumor, antiangiogenic, kardio, anti-inflammatorisk og immunmodulerende effekter [14], [15]. De bioaktive egenskaper Withaferin A omfatter cytoskeletal ombygging ved binding til Annexin II [16], antiangiogen [17], [18] og antitumoraktivitet [19], [20] ved inhibering av proteasomal chymotrypsin [21] og apoptotisk induksjon ved inhibering av proteinkinase C [22]. Nylig, Oh et al har vist caspase-3-aktivering gjennom Withaferin A [23]. Bortsett fra sin anti-kreft aktivitet, har Withaferin A også blitt dokumentert for sin anti-inflammatorisk eiendom ved å undertrykke alfa-2-makroglobulin [24]. Med vår siste suksess mot utviklingen av et bibliotek av Withaferin A semisyntetiske analoger, rasjonell screening strategien fører til generasjon av 3-azidoWA, den potente kreft kandidat [25]. Selv om betydningen av α-β-umettet funksjonalitet på ring A i Withaferin A og anticancerpotensialet av 3-azidoWA ble tydelig, fremdeles sin virkningsmåte var ikke klar.
I denne studien evaluerte vi den mekanistiske rolle av 3-azidoWA (3-azido WA), en azido Withaferin derivat på motilitet og invasjon av kreftceller. Vi ønsket også å co-forholde denne studien med signalveier
nemlig
, ERK, Akt, som aktiveres i ulike kreftformer og forsterker invasjon og metastasering av ulike kreftceller. Resultatene fra disse studiene gir oss viktig informasjon om mekanistisk rollen 3-azidoWA på oppheving av invasjonen av livmorhals og prostata kreft celler som kan være en-rutet gjennom ekstracellulære Par-4.
Materialer og metoder
Cell Kultur og Antistoffer
Alle cellelinjer ble kjøpt fra European Collection of Cell Culture (ECACC), Fetal Bovine Serum (FBS), RPMI-1640, Minimum Essential Medium (MEM), Penicillin G , streptomycin, Trypsin-EDTA ble oppnådd fra Invitrogen Corp. 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), Paraformaldehyde, krystallfiolett, Staurosporin, fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), Dithiothretol (DTT), NP-40, proteasehemmer Cocktail, Gelatin, Brij- 35, Comassie brilliantblått (R-250), Brefeldin A (BFA), Tunicamycin, TRAIL, Annexin V-FITC apoptose deteksjon analysesett, dimetylsulfoksyd (DMSO), Bradford-reagens ble oppnådd fra Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO ) Propedium jodid og Ultracruz DAPI monteringsmedium ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Z-VAD Pan kaspase-inhibitor, rekombinant human-VEGF-165 og rekombinant, human FGF (basic 146 aa) ble oppnådd fra R 0,05 verdier ble tildelt betydning
Resultater
3-azidoWA er en anti-proliferative Agent og induserer apoptose i PC-3 og HeLa celler
Withaferin A er en. potent cytotoksisk middel og viste veksthemmende egenskaper i tumor cellekulturforsøk [19], [26]. Så godt som opphavsmolekylet Withaferin A, den deriverte av Withaferin, 3-azidoWA (Fig. 1, A) signifikant utviste anti-proliferativ effekt i et panel av cellelinjer testet (med IC
50 innenfor et område på 800 nM – 1,0 pM) [25] (fig. 1, B). For ytterligere bekreftelse av apoptose ved 3-azidoWA, utførte vi Annexin V-FITC farging av tre-azidoWA behandlet HeLa-celler. Som vist på fig. 1, C 59,1% tidlig apoptotiske celler sammenlignet med 72,5% ved 25 nM staurosporin, først når HeLa-celler ble behandlet med 1,0 mM 3-azidoWA i 24 timer. Ved DAPI farging vi observert at 1,0 uM av 3-azidoWA, ikke 0,5 uM indusert apoptose i Hela og PC-3-celler i løpet av 24 timer inkubasjon i forhold til positiv kontroll staurosporin (fig.1, D). En rest aging relatert tidlige apoptoic celler ble observert i FACS data (ved lavere konsentrasjon av 0,25 uM av 3-azidoWA behandling), men høyere konsentrasjon (1,0 uM) av 3-azidoWA, bly cellene mot apoptose med kromatin kondensering rundt den kjernefysiske periferien ledsaget av kjernestørrelsesreduksjon (hvite pilspisser, fig. 1, D). Aktiv caspase-3, kvantifisert ved western blot-analyse viste at spaltingen av caspase-3 ved 1,0 uM av 3-azidoWA behandling, men ikke i det sub-toksiske doser (0,5 um) (fig. 1, E). Sammen er disse resultater viser at 3-azidoWA er en prospektiv cytotoksisk og apoptose som induserer naturlig produkt-derivat.
(A) Syntese av 3-azidoWA. (B) Effekter av 3-azidoWA på celle spredning av A549 (lungekreft), PC-3, DU-145 (nedbrutt kreft) og HeLa (livmorhalskreft) cellelinjer ble bestemt ved MTT-analyse. (C) 3-azidoWA sammen med kjøretøyet DMSO og positive kontroll staurosporin behandlede celler ble analysert ved hjelp av FACS, (som angitt); grafisk representasjon av resultatene viser andel av ikke-apoptotiske celler (Q3), tidlig apoptotisk (Q4), nekrotisk (Q1) og (Q2 sen apoptotiske celler). (D) HeLa-celler (5 x 10
4) ble dyrket i kammers objektglass og behandlet med 3-azidoWA (0,25, 0,50 og 1,0 uM) sammen med kjøretøyet DMSO og positiv kontroll staurosporin (25 nM) i 24 timer. Etter fiksering ble cellene farget med kjernefysiske flekken DAPI og fotografert i henhold fluorescens mikroskop (100x forstørrelse) for å identifisere de apoptotiske kjerner (hvite pilspisser). (E) HeLa-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av 3-azidoWA som angitt, procaspase-3 og kaspase-3 spaltet uttrykk ble bestemt ved Western blotting med lasting kontroll β-aktin.
3- azidoWA hemmer Cell Motility, invasjon og kolonidannelse
Som withanolides var kjent for å hemme invasjon evnen til kreftceller [27], beregnet vi for å studere effekten av 3-azidoWA på invasiv potensialet i HeLa og PC-3- celler
in vitro.
sårheling analyser ble benyttet for å bestemme hvorvidt sub-giftig konsentrasjon av 3-azidoWA kunne hemme bevegeligheten av Hela og PC-3 celler. Etter 48 h, cellemonolaget tallet var såret, er kjøretøyet DMSO behandlede celler hadde helt fylt i den frie flaten (figur 2, A.), Mens behandling med 0,50 og 0,75 uM av 3-azidoWA signifikant (p 0,05) hemmet motilitet av Hela og PC-3 celler, som gjorde behandling med staurosporin (fig. 2, A og B) (fig. S1, A og B).
(A) HeLa-celler (0,5 × 10
5 celler /brønn) ble dyrket til konfluens i seks brønners vevkulturplate og skrapet med sterile spiss; 3-azidoWA ble tilsatt til kulturer som angitt. Oppskrapte områder ble fotografert (forstørrelse 100x) ved null time og deretter senere på nytt 24 timer senere for å vurdere graden av sårheling. (B) De oppskrapte områder ble kvantifisert i tre tilfeldige felt i hver behandling og data ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. (C) HeLa (1 x 10
3) celler /brønn ble dyrket og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av forbindelse 3-azidoWA i 5 dager ved 37 ° C og deretter farget med krystallfiolett (for detaljer se materialer og metoder), antall fargede kolonier ble tellet, ble fotografert (100x) og (D) data beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Kolonner mener; barer SD fra tre uavhengige eksperimenter. P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med ubehandlet kontroll. (E) Cellemigrering ble bestemt ved hjelp av den modifiserte Boyden kammer analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. HeLa-celler (2 x 10
5) ble sådd i øvre kammer i nærvær eller fravær av 0,25, 0,50 og 0,75 uM av 3-azidoWA. Celler ble tillatt å migrere i 24 timer, og da trekkende celler på den nedre halvdelen av innsatsen membranen ble farget med 0,1% krystallfiolett og tellet under 200x forstørrelse. (F) for invasivt celler ble tellet ved bruk av bilde programvare som antallet migrerte celler pr høyeffekts felt (HPF). Fem felter ble tellet i triplikat (n = 3) fra hver pakning. Celle bildene ble innhentet ved hjelp av mikroskop Nikon Eclipse E200 innebygget med kameraet. Kolonner mener; barer SD fra tre uavhengige eksperimenter. P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med ubehandlede kontroll
kolonidannelse evne til HeLa og PC-3-celler ble dempet ved 3-azidoWA behandling på en doseavhengig måte.. Som vist på fig. 2, C subletale doser av 3-azidoWA redusert kolonidannelse muligheten av HeLa-celler på statistisk signifikant måte (P 0,05). (Fig. 2, D) (Fig. S1, C og D)
En kritisk hendelse i tumorinvasjon og metastase er muligheten for tumorceller å invadere gjennom den ekstracellulære matriks, slik at tumorceller til å gå utover rammen av primærtumor miljø [28]. For å undersøke effekten av 3-azidoWA på celle invasjon, ble Boyden kammer invasjon analysen utført for å bestemme evnen av HeLa og PC-3-celler til å invadere gjennom biologiske matriser
in vitro
. Som vist på fig. 2, E og F, (fig S1, E og F, P . 0,01) behandling med 3-azidoWA (0,50 og 0,75 pM) hemmet celle invasjon (P 0,05) .For å overprøve muligheten for endring av celle invasjon grunn programmert celledød, vi velger nøye fysiologisk relevante konsentrasjoner av tre-azidoWA. Alle disse resultatene samlet indikerer at sub-giftig doser av tre-azidoWA endre vekstkinetikk av HeLa og PC-3 celler. Dette kan være en positiv indikator for å teste sin antineoplastiske aktivitet i livmorhalsen og prostata kreft celler.
Hemming av matriksmetalloproteinase 2 Gelatinase aktivitet og uttrykk av 3-azidoWA
tumorcelle invasjon gjennom matrisen og vev obstruksjon trenger den kombinerte effekten av økt cellemotilitet og kontrollert proteolytisk nedbrytning av matrisen. Høye nivåer av MMP-er i tumorvev er korrelert med kreftcelle matrise nedbrytning, invasjon og metastasering [29]. Som 3-azidoWA hemmet cellemotilitet undersøkte vi om tre-azidoWA utøver anti-gelatinase aktivitet. Som vist i fig. 3, A og B (fig. S2, A), øvre rad, økende konsentrasjon av 3-azidoWA selektivt opphevet gelatinase aktivitet og ekspresjon av 72 kDa MMP-2 bånd som bekreftes av gelatin zymografi og Western blot-analyse. Effekten av MMP-2 inhibering av 3-azidoWA var mer uttalt enn utgangsmolekylet withaferin A (fig. 3, C) (fig. S2, B) .Further vi undersøkt hvorvidt 3-azidoWA kunne hemme andre gelatinase (MMP-9) og resultatene viste at 3-azidoWA spesifikt blokkere MMP-2 aktivitet i HeLa og PC-3-celler, men ikke MMP-9 (fig. 3, A midterste rad) (fig. S2, A midterste rad). Sammen utgjør disse funnene tyder på at 3-azidoWA sterkt og selektivt opphever MMP-2 uttrykk og aktivitet på en doseavhengig måte.
(A) HeLa-celler ble ubehandlet eller behandlet med 0,50 mikrometer og 0,75 mikrometer 3- azidoWA i 48 timer, ble kondisjonerte medier analysert for MMP-2 amp; -9 Gelatinase aktivitet. (B) HeLa-celler ble etterlatt ubehandlet eller behandlet med 0,25, 0,50, 0,75 og 1,0 mM 3-azidoWA i 48 timer, for å kondisjonert medium ble oppnådd ble anvendt for Western blot-analyse etterfulgt av Coomassie blå farging avsløre 68 KDa BSA band for lasting styre . (C) HeLa-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av moder withaferin A i 48 timer og aktiviteten til MMP-2 ble bestemt ved gelatin zymografi. (D) (E) HeLa-celler ble behandlet med TRAIL i 180 minutter og sammen med Tumicamycin i 60 minutter (som angitt). Betinget media ble utsatt for gelatin zymografi analyse for MMP-2 aktivitet og Western blot analyse for ekstracellulære Par-4, etterfulgt av Coomassieblå farging for lasting kontroll.
3-azidoWA induserer ekstracellulær Par-4 sekresjon av Classical Pathway
som par av apoptose inducing agenter lette utskillelsen av ekstracellulære par-4 [3], vi søkt å undersøke et panel av medisinske planter avledet rene naturprodukter som kan fremme apoptose og /eller øke utskillelsen av par-4 (data ikke vist). Overraskende har vi funnet at så lite som 0,5 um (mye under cytotoksiske dose) av 3-azidoWA, men ikke til opphavsmolekylet Withaferin A (data ikke vist) indusert det ekstracellulære Par-4-sekresjon på doseavhengig måte (fig. 3, B midten rad), bekreftet av Western blot. Videre observerte vi 3-azidoWA behandling utvidet sekresjon av ekstracellulære Par-4 i de betingede media som i hovedsak etterlignet effekten av 300 ng TRAIL (TNF-relatert apoptose induserende ligand) og 1,0 uM av Tunicamycin behandling (Fig. 3, D og E midterste rad). For å vurdere om dette sekresjon av Par-4 skjedde via den klassiske BFA-sensitive pathway involverer ER /Golgi rute, avsluttet vi protein trafficking fra ER til Golgi med Brefeldin A (BFA) og fant utskilt Par-4 nivå ble bremset i kondisjonerte media etter 3-azidoWA og TRAIL behandling i nærvær av Brefeldin A (fig. 4, A og B øverste rad). Her foreslår vi at 3-azidoWA induserer ekstracellulære Par-4 sekresjon av klassisk BFA sensitive veien.
av PC-3 celler. (A) PC-3-celler ble etterlatt ubehandlet eller forbehandlet med BFA (1,0 pM) i 120 minutter og deretter behandlet med 3-azidoWA som indikert i 48 timer. Som vist på fig. (B). (B).
