Abstract
Menneske tykktarm kreft ofte havn tap av funksjon mutasjoner i APC, en repressor av den kanoniske WNT vei, og dermed fører til hyperaktiv WNT-TCF signalering. Re-etablering av Apc funksjon i mus, konstruert for å betinget undertrykke Apc gjennom RNAi, løse tarmsvulster dannet på grunn av hyperactivated Wnt-Tcf signalering. Disse og andre resultater har ført til at søk etter bestemte Wnt pathway antagonister som therapeutics for klinisk problematiske human tykktarm kreft og tilhørende metastaser, som fortsatt i stor grad uhelbredelig. Dette allment akseptert oppfatning synes på kant med en rekke funn ved hjelp av pasient-avledet materiale: Canonical TCF målene trykt, i stedet for å bli hyperactivated, i avanserte tykktarm kreft, og undertrykkelse av TCF funksjonen ikke generelt gi tumorregresjon i xenografter. Resultatene av en rekke genetiske mus studier har også antydet at kanonisk WNT-TCF signale stasjoner metastaser, men direkte in vivo tester er mangelfull, og, overraskende, kan TCF undertrykkelse gir deg flere direkte utsådd metastatisk vekst. Her har vi adressert evnene til forbedret og blokkert WNT-TCF signale å endre tumorvekst og fjernmetastaser ved hjelp xenografter av avanserte menneskelige tykktarm kreft hos mus. Vi finner at endogen WNT-TCF signalering er mest anti-metastatisk siden nedregulering av TCF funksjon med dnTCF generelt øker metastatisk spredning. Konsekvent, heve nivået av WNT signalering, ved å øke nivåene av wnt ligander, er vanligvis ikke pro-metastatisk. Våre nåværende og tidligere data indikerer en heterogen respons på moduler WNT-TCF signalisering i humane kreftceller. Likevel, funnene som en brøkdel av tykktarm kreft testet krever WNT-TCF signalering for tumorvekst, men alle svare på trykt signalering ved å øke metastaser tigge for en revurdering av målet om å blokkere WNT-TCF signale til universelt behandle tykktarm kreft. Våre data tyder på at WNT-TCF blokade kan være effektive i å hemme tumorvekst i bare en undergruppe av tilfellene, men vil generelt øke metastaser
Citation. Seth C, Ruiz jeg Altaba A (2016) metastaser og tykktarmskreft Tumor vekst Skjermavvikende Responses to Modulation av Canonical WNT signalering. PLoS ONE 11 (3): e0150697. doi: 10,1371 /journal.pone.0150697
Redaktør: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, USA
mottatt: 30 oktober 2015; Godkjent: 18 februar 2016; Publisert: 03.03.2016
Copyright: © 2016 Seth, Ruiz jeg Altaba. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra sveitsiske nasjonal Foundation, EU-FP7 konsortium hEALING, den sveitsiske Cancer League og Département d’Instruction Publique de Genève til ARA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er en stor mengde bevis som støtter tanken om at WNT signalering er avgjørende for menneske tykktarm kreft, som er kanskje best eksemplifisert ved to hovedfunnene i- det store flertallet av tykktarm kreft havnen mutasjoner i tumor suppressor APC, en nøkkel WNT-TCF veien antagonist [1], og II- restaurering av APC-funksjon i
APC
kompromitterte mus resulterer i tap av tarmsvulster [2]. Disse og andre resultater har fremmet et søk etter terapeutiske WNT-TCF-stopper til universelt behandle menneskelige tykktarm kreft med hyperaktive kanoniske WNT signale (f.eks [3]). Gitt at APC er, så langt, ikke druggable, arbeidet med å utvikle WNT-TCF antagonister har fokusert på trinnene oppstrøms (f.eks Porcupine og Tankyrase hemmere [4-6] eller nedstrøms (CBP blokkere [7], Ivermectin [8]) fra APC funksjon i ß-catenin ødeleggelse kompleks. Uavhengig av trinnet målrettet, mange skjermer eller validerings analyser har brukt en TCF-luciferase reporter for å overvåke kanoniske WNT pathway svar [9].
de bevisføringer oppsummert ovenfor tyder a. robust handling av wNT-TCF signalering i end-stage tykktarm kreft og kan gi en overbevisende sak for utvikling og bruk av kanoniske wnt antagonister er imidlertid en viktig oppdagelse på kant med dette generelt akseptert syn: uttrykket av wNT-TCF målene er undertrykt, ikke forbedret bygde avanserte tykktarm kreft og metastaser sammenlignet med tidlig stadium svulster [10], [11].
WNT-TCF signale er også mye tenkt å kjøre metastaser (f.eks [12]) , fremme såing potensialet av sirkulerende tumorceller og styrke ligand-mediert signalisering i den metastatisk nisje [13], [14]. Det er bemerkelsesverdig, men at ingen direkte tester for den aksepterte evne til forbedret kanonisk WNT-TCF-signalering for å fremme metastaser fra humane kolonkreftceller er blitt rapportert. Det beste bevis for en rolle av kanonisk WNT signalisering i kolon kreftmetastaser avledet fra studier med mus [13], [14], eller fra in vitro-analyser (for eksempel [15], [16]), og andre studier antyder en bevist rolle for forbedret WNT signalering i metastaser (for eksempel [17]). Men forutsatt in vivo funksjon fra in vitro-data, eller menneskets biologi fra mus data, kan være problematisk som mus og mennesker er ganske fjernt arter, og in vitro forhold kan pålegge en WNT-avhengighet til humane tykktarmskreftceller [10].
Eksperimentelt, undertrykkelse av kanoniske WNT signal har vært forsøkt ved å blokkere TCF-funksjonen, som er det siste trinnet i kanonisk WNT signalering. Undertrykkelse av WNT-TCF signalering med pan dominant-negative TCF (dnTCF4), vist seg å være effektive in vitro på humane tykktarmskreftceller (f.eks [18]), er, paradoksalt nok, vanligvis ineffektive i å undertrykke tumorvekst etter pode avanserte menneskelige tykktarm kreft ; I motsetning til dette, kan det øke metastatisk vekst etter direkte såing av kreftceller i lungene [10], [11], [19-21]. Disse funnene hevet muligheten for at blokkeringen av aktiv WNT-TCF-signalisering i humane tarmkreftceller ikke kan generelt være terapeutisk gunstig, i motsetning til det som har vært hevdet (for eksempel [2], [18]). Likevel, tilnærminger og modellen som brukes er forskjellige, og det kan være metodiske forskjeller som ligger til grunn avvikende resultater. For eksempel, er i direkte utsådd metastaser etter haleveneinjeksjon av humane kreftceller [10] ikke fullt ut rekapitulere fjernmetastaser. Videre aksepterte ideen om at Wnt ligander fremme metastatisk vekst avledet fra genmanipulerte mus [13], [14], gjenstår å bli testet direkte med pasient avledet tykktarmskreftceller.
Her har vi sammenlignet gevinst og blokade av funksjon tilnærminger til direkte møte effektene av moduler WNT-TCF signale på menneskelig tykktarmskreft xenograft vekst hos mus og på fjerne organmetastaser in vivo ved bruk av både pasient avledet primære kolon kreftceller og to etablerte cellelinjer. Vi finner at bare et mindretall av tumorceller testet reagerer på TCF blokade ved å redusere tumorvekst, men i motsetning alle celler testet reagerte ved å styrke fjerne organmetastaser. Dessuten gjør forhøyet WNT signalering gjennom forbedret liganden nivåer i kreftcellene ikke øke tumorvekst i alle fall. I stedet, det resulterte i en heterogen metastatisk svar: forbedret WNT signaliserer trykt metastatisk vekst i ett tilfelle, tre tilfeller var statistisk upåvirket, og det forbedret metastaser i en annen sak. Videre analyser av forbedring av metastaser i mCC11 celler viste at dette skjedde i bare én av tre immunkompetente musestammer, og hevder at dette ikke er en svulst celle iboende respons.
Totalt, våre nåværende og tidligere data [10] antyder at blokade av WNT-TCF signalering hos pasienter med kreft i tykktarmen, vil sannsynligvis være skadelig i alle tilfeller, da dette vil føre til en økning i metastaser, uavhengig av en hvilken som helst reduksjon i primær tumorstørrelse i en undergruppe av tilfellene. I motsetning til de resultatene vi rapporterer her tyder på at restaureringen av WNT-TCF pathway aktivitet i humane tykktarm kreft celler kan i stedet ha terapeutisk verdi i en undergruppe av metastatisk kreft.
Materialer og metoder
Menneske tykktarmskreft prøver og cellekultur
Primær menneskelige tykktarmskreft (CC) prøver CC36 (TNM3), CC14 (TNM4) og mCC11 (levermetastaser fra CC pasient) som brukes for denne studien var som i referansene [10], [21], [22], [23]. Den menneskelige CC HT29 og T84 cellelinjer, sistnevnte stammer fra en lungemetastaser, ble hentet fra Cell linjetjenesten. Alle primære CC celler ble anvendt på et tidlig in vitro passasje i kulturbetingelser standard (DMEM-F12 med 10% FBS, 5% CO
2).
Lentiviral verktøy og infeksjon av humane CCs
Stabil innføring av Beta-galaktosidase (ßGal) -expressing (
lacZ
+) rapportør konstruksjoner som brukes lentivirale partikler ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 2. Alle infiserte kulturer ble undersøkt for ßGal ekspresjon in vitro ved hjelp av X-Gal farging. Cellekultur grupper med 90% homogent uttrykk for ßGal ble valgt for ytterligere infeksjoner (MOI = 2) med GFP
+ lentivectors med eller uten dnTCF4, Wnt1 eller Wnt3a. Grupper med 85% GFP
+ celler ble valgt for alle forsøkene
Real-time kvantitativ PCR
3-5d post-infeksjon, infiserte celler ble samlet i Trizol og mRNA. ekstraherte (Life Technologies). Standard PCR reaksjoner ble utført på avledet cDNA med følgende primere:
Menneske-spesifikke primere:
TBP F: CCACAGCTCTTCCACTCACA
TBP R: GGATTATATTCGGCGTTTCG
HPRT F: GCCAGACTTTGTTGGATTTG
HPRT R: CTCTCATCTTAGGCTTTGTATTTTG
AXIN2 F: AGTGTGAGGTCCACGGAA AC
AXIN2 R: ACTGCCCACACGATAAGGAG
LGR5 F: GGAGCATTCACTGGCCTTTA
LGR5 R: CTGGACGGGGATTTCTGTTA
ASCL2 F: GCGTTCCGCCTACTCGT
ASCL2 R: GGCTTCCGGGGCTGAG
mus-spesifikke primere:
Wnt1 F: GACGGATTCCAAGAGTCTGC
Wnt1 R: ATTGCGAAGATGAACGCTGT
Wnt3a F: GCACCACCGTGGACGACAG
Wnt3a R: CCTCGCTACAGCCACCCCAC
nålevenen injeksjoner i NSG mus: Pure
lacZ
+ cellepopulasjonen
10
6 menneskelige CC cellene i HBSS ble injisert i halevenen til 6 uker gamle hunn immunkompromitterte mus (NSG mangler modne T, B og NK-celler) under autoriserte driftsprosedyrer på dyret anlegget i UNIGE. Dyrene veide 20-25g ved starten av forsøket. Dyrene ble rutinemessig sjekket for symptomer på ubehag og samlet 4 uker etter vaksinasjon følgende godkjente protokoller. Lungene ble samlet i PBS etter disseksjon
underhudssykdommer xenografter i NSG, Nude og SHO mus:. LacZ
+ celler
5×10
5 CC cellene i HBSS ble injisert i subkutant lag seks uker gamle kvinnelige Nude mus (NMRI-Foxn1nu /Foxn1nu, mangler modne T-celler) eller SHO mus (SHO-PkrdcscidHrhr, mangler modne T-celler og B-celler) eller immunsvekkede NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ). Hver mus gjennomført 3 xenografter i flankene. Naken og NSG mus ble kjøpt fra Janvier Labs (Frankrike) og SHO mus fra Charles River (Frankrike). Alle dyrene ble 20-25g ved starten av eksperimentet, og deretter ble rutinemessig sjekket for symptomer på ubehag på tidspunktet for tumormålinger. Dyrene ble avlivet i slutten av 4 uker etter podning og xenotransplantater og organer ble oppsamlet i PBS etter disseksjon. Xenotransplantater ble kappet og lagret i Trizol etter løselighet og senere behandlet for genekspresjon analyser av sanntids kvantitativ PCR.
subkutan
lacZ
+/-
xenograft i NSG mus
mCC11
lacZ
+ celler ble infisert med en lentivector på 90% effektivitet. Parallelt mCC11 vekt (
lacZ
-) celler ble infisert med GFP
+ lentivectors uttrykker Wnt1. mCC11-
lacZ
+ ble deretter blandet 1: 1 med mCC11-
lacZ
– /Wnt1
+ celler og totalt 5×10
5 celler ble injisert i hver av de tre områdene per seks uker gamle kvinnelige immunsupprimerte NSG mus under godkjente forhold. Dyrene ble rutinemessig sjekket for symptomer på ubehag daglig ved tidspunktet for tumorvekstmålinger. Alle dyrene ble avlivet i slutten av 4 uker etter podning og tumorer og organer oppsamles i PBS ved slutten av forsøkene.
Beta-galaktosidase X-Gal-farging
Alle organer ble vasket med kald PBS etter samling og fiksert med 4% PFA ved 4 ° C i 2-12h. Farging ble gjort for 4-8h med X-Gal. Stained Prøvene ble deretter vasket med steril PBS og inspiseres for synlige metastaser under et dissekere mikroskop.
lacZ
+ metastaser ble talt opp og fotografert.
Exome sekvensering av APC
Exome sekvensering av DNA av tykktarmskreft primære celler som brukes ble utført på Genomics Facility ved Universitetet i Genève Medical School. Bare APC ble analysert i detalj for denne studien. Bare kjente APC-mutasjoner som fører til tap av funksjon rapporteres her.
Animal omsorg
Alle mus ble brukt under godkjente protokoller fra Office Cantonale de Vétérinaire de Genève (OVC). Dyrene ble overvåket flere ganger ukentlig for godt å være under veterinær veiledning. Musene ble avlivet på slutten av forsøkene og før svulster nådd lokale lovlige grensen gjennom injeksjon av ketazol /xylazin eller CO
2 innånding.
Resultater
Modulation av kanoniske WNT signalering i humane tarmkreft xenotransplantater i mus generelt ikke endrer tumorvekst
Primære humane tarmkreftceller (CC14 og CC36) samt metastatiske tarmkreftceller (mCC11) og et metastatisk cellelinje (T84) ble transdusert med stabilt GFP
+ dominant-negative TCF4 (dnTCF), Wnt1, eller med kontroll lentivectors. Subkutane grafts til svekket immunforsvar NSG mus ble valgt fordi kutan tykktarmskreft metastaser forekomme hos pasienter og fordi ingen prefekt ortotopiske grafts er mulig i mus: Selv injeksjon i endetarmsveggen fører til fartøyet lekkasje, gitt sin tynnhet og volumene og press involvert i injeksjons , som fører til systemisk spredning. Videre subcutanous grafts er enkle og reproduserbar.
Nivåene av uttrykk for bona fide tykktarmskreft WNT-TCF aktivitet biomarkør
AXIN2
, samt Wnt-regulerte stamcellemarkører
LGR5 Hotell og
ASCL2 plakater (f.eks [2]), ble bestemt ved RT-qPCR i transduced celler in vitro og i subkutane xenografter (fig 1A). Alle celler in vitro og in vivo svart på trykt eller forbedret WNT-TCF signalering som demonstrert av de endogene nivåer av
AXIN2
mRNA; alle celler trykt
AXIN2
mRNA nivåer i respons på skoleveien blokade av dnTCF, og alle cellene økt
AXIN2
mRNA nivåer i respons på skoleveien aktivering av Wnt1 (fig 1A).
LGR5 Hotell og
ASCL2
var tilsvarende regulert riktignok med celletype forskjeller (figur 1A).
(A) Kvantifisering av nivåene av
AXIN2
,
LGR5 Hotell og
ASCL2
av RT-qPCR in vitro og in vivo i xenografter i de fire celletyper som brukes i denne studien, med WNT-TCF downregulation via dnTCF4 eller oppregulering via Wnt1 misexpression. Tallene er prosenter av eksperimentell enn kontroll Ct verdier, etter normalisering med housekeeping gener
TBP Hotell og
HPRT
. Merk at i alle tilfeller den kanoniske WNT-TCF mål og aktivitet reporter
AXIN2
er indusert av Wnt1 (grønne bokser) og undertrykt av dnTCF4 (røde bokser). (B) GFP + fluorescerende bilder av dissekerte svulster mCC11 (øverste rad) og T84 (nederste rad) celler. Modulering av WNT-TCF aliserte in vivo forårsaker små endringer i voksende tumorer. Skala barer = 0,6 cm. (C) Histogram av kvantifisering av tumorvekten etter disseksjon, for hver av de fire tykktarmskreftceller som benyttes. Se teksten for detaljer. p-verdier ble bestemt med to-tailed Student t-tester.
Tumorvekst ble overvåket hver to dager ved å måle volumet før svulster nådde de juridiske grenser. Ved slutten av forsøket ble alle GFP
+ svulster samlet på samme tid og fotografert. Ikke i noe tilfelle var eksperimentelle tumorer større enn kontrollene (fig 1B og 1C). I stedet 4/8 T84 xenografter uttrykker dnTCF (T84
dnTCF) mislyktes i å vokse og de som gjorde var innenfor rekkevidden av kontroller. Dessuten var det en liten nedgang i tumorvekt for mCC11
Wnt1 sammenlignet med kontroller (figur 1B og 1C). Disse resultatene tyder på at opp eller ned modulering av kanonisk WNT signalering kan ha en kontekstavhengige og avvikende effekter in vivo. Men ikke i noe tilfelle gjorde forbedret WNT signale resultert i større svulster og blokade av WNT-TCF signale ikke har universell anti-tumor effekter.
blokkaden av TCF aktivitet fører til en generell økning i fjerne organmetastaser
for å tydelig spore metastatiske kolonier i fjerne organer, podet vi kreftceller med integrerte
lacZ
-expressing lentivectors å tillate identifisering av menneskelig ßGalactosidase
+ (ßGal
+) celler i mus vev etter Xgal reaksjonen (fig 2A; [10], [24]). Pode
lacZ
+ CC14
dnTCF, CC36
dnTCF eller mCC11
dnTCF (Fig 2B) resulterte i en netto økning i metastaser i lungene av NSG mus, og i sin metastatisk indeks (antall
lacZ
+ metastatiske kolonier over sum svulst vekt i gram siden hver mus gjennomført 2-3 subkutan flanketransplantater) (figur 2C). Dette indikerer at nedmodulering av WNT-TCF-aktivitet (med ca. 50% som foreslått av
AXIN2
nivåer (figur 1A) forbedrer den fulle eksperimentelle metastatiske fenotype. Gitt at dnTCF aktivitet hindret veksten av en tredel (4 /12) av T84
dnTCF tumorer (figur 1C), en generell metastatisk respons i denne celletypen var ikke helt menings å kvantifisere. Men metastatisk indeks av T84
dnTCF mus som utviklet svulster var lik som T84
kontroll (ikke vist).
(A) Diagram av prosedyren brukes til å analysere effekten av nedregulering av av WNT signalering på fjernmetastaser in vivo. Podet celler er
lacZ
+, som tillater visualisering av store kolonier og til og med enkeltmetastatiske celler i fjerntliggende organer, spesielt lungene (bunn innfelt). det innfelte til høyre viser en stor forstørrelse av
lacZ +
metastaser av forskjellige størrelser etter i toto Xgal flekker å avsløre
lacZ
+ metastatiske celler (mørk blå flekker). (B) Representative bilder av venstre lungelapper fra mus podet subkutant med kontrollceller eller de med sperret WNT-TCF signaliserer gjennom ekspresjonen av dnTCF4 som angitt. (C) Kvantifisering av antall lungemetastaser per dyr vist som den metastatisk indeks (antall metastaser enn tumorvekt) (øverste rad), og tumorvekten (nederste rad) som angitt i hvert enkelt tilfelle. (D) Kvantifisering av størrelsen av lungemetastatiske kolonier som antydet pr venstre lungelapp side. I alle tall feilfelt er standardavvik og p-verdiene stammer fra uparet, to-tailed Student t-tester. Målestokk = 7mm for (A); 25mm for (B).
Kvantifisering av størrelsen på
lacZ
+ metastatiske kolonier i lungene viste at det var en jevn økning i antall store ( 100 celler per koloni) metastaser etter undertrykkelse av WNT-TCF signalisering i mus med CC36
dnTCF, CC14
dnTCF og mCC11
dnTCF xenografter sammenlignet med kontroller (figur 2D). Videre både CC36
dnTCF og mCC11
dnTCF tumorbærende mus viste også et større antall mikrometastaser ( 10 celler per koloni) over kontroller (Fig 2D). Disse resultatene tyder på at nedregulering av kanoniske WNT signalering kan føre til både en økning i antall metastatiske celler som når en fjern organ samt en økning i størrelsen på metastatiske kolonier.
Forbedring av Wnt ligand nivåer gjør ikke generelt øke antall fjerntorganmetastaser
for å teste for fjernmetastaser fra en primær svulst området til et fjernt organ, lungene i dette tilfellet, kontroll og Wnt1-uttrykke
lacZ
+ celler ble podet inn fullt immunsupprimerte NSG mus subkutant (fig 3A). Mens CC14
Wnt1, eller CC36
Wnt1 svulster hadde ingen signifikant endret nivåer av lungemetastaser sammenlignet med kontroller (Fig 3B og 3D), T84
Wnt1 svulster produsert færre og mCC11
Wnt1 svulster produsere mer metastaser og hadde en endret metastatisk indeks og koloni størrelsesfordeling (figur 3C og 3D). Dette viser at metastatisk utfallet av WNT signale utløst av ligand handlingen kan være situasjonsavhengig, men som forbedret WNT signalering er ikke universelt pro-metastatisk.
(A) Diagram av prosedyren brukes til å analysere effekten av oppregulering av WNT signalering på fjernmetastaser in vivo. (B) Representative eksempler på venstre lungelapper av mus med subkutane svulster i forskjellige tykktarmskreftceller som angitt, enten bærer kontroll (øverste rad) eller Wnt1-uttrykke (nederste rad) lentivectors, etter X-Gal farging. Scale bar = 25mm. (C) Kvantifisering av metastatiske indeksen i hvert tilfelle per mus. (D) Kvantifisering av størrelsen av lungemetastatiske kolonier som antydet pr venstre lungelapp side. Merk at kontrollene er de samme som brukes for figur 2 som Wnt1 og dnTCF eksperimenter ble utført samtidig, men vises separat for klarhet.
Forbedret WNT signale modulerer antall direkte seeded metastaser i en kontekst avhengig måte
For å gi ekstra støtte metastatisk fenotype observert med mCC11
Wnt1 og T84
Wnt1 celler i full metastatiske analysene beskrevet ovenfor, vi direkte seeded kreftceller i lungene, ved å injisere
lacZ
+ mCC11
Wnt1 eller
lacZ
+ T84
Wnt1 celler i sirkulasjonen av NSG mus via halevenen (fig 4A). mCC11
Wnt1 celler dannet mange flere og T84
Wnt1 celler mye færre metastaser sammenlignet med kontroller (fig 4B og 4C). Kvantifisering av metastatiske kolonier pr størrelse avdekket endringer i alle kategorier, fra encellete mikrometastaser til store kolonier med 100 celler (figur 4D). Disse dataene støtter fjernmetastaser resultater og hevder at WNT signalering kan påvirke metastatisk vekst, uavhengig av eventuelle andre effekter inkludert på stroma av primærtumor. Disse resultatene bekrefter også at, paradoksalt nok, forbedrede wnt ligand-nivåer er pro-metastatisk i en celletype og anti-metastatisk i en annen.
(A) Skjematisk fremstilling av protokollen som brukes for å teste effekten av økt WNT signale på metastatisk vekst etter direkte injeksjon inn i sirkulasjonen hetteglasset halevenen. (B-D) Representative eksempler (B), total kvantifisering (C) og kvantifisering av metastatisk kolonistørrelse (C) av X-Gal farget lungeområder etter injeksjon av kontrollceller eller av celler med forsterkning eller WNT signalering, som angitt. mCC11 metastatisk vekst forsterkes mens det av T84 er undertrykt (C, D). Legg merke til at det totale antallet av metastatiske kolonier representert i (C) for mCC11 er per venstre lunge lapp, mens det gitt deres mangel, at for T84 er de hele lungene. Scale bar = 7mm for (B).
Mangel på korrelasjon av APC status og WNT-TCF modulasjon fenotype
Det kan argumenteres for at vi har valgt celler som kanskje ikke har mutert APC, og dermed gjengi våre resultater ikke generelt gjelder de fleste menneskelige tykktarm kreft. Men ser vi at T84 havner
APC
mutasjoner og at exome sekvensering av
APC
i CC14 avslører tilstedeværelsen av tap av funksjon mutasjoner (chr5 112173848 G- T, Cosmic id 18566, E
853- STOPP, chr5 112175951 G- A, E
1554- . rammeskifte)
For å utvide disse funnene vi gjentatte forsøkene med dnTCF og Wnt1 hjelp av godt -kjent
APC
mutant tykktarmskreft cellelinje HT29 (fig 5A). I disse cellene Wnt1 og dnTCF4 regulert TCF mål som forventet (figur 5B). Svulster uttrykker HT29
dnTCF var litt, men betydelig mindre, men dette var også tilfelle for HT29
Wnt1 tumorer (figur 5C), tyder på mangel på en klar tumorvekst respons på modulering av WNT signalering. Dessuten var det ingen betydning forskjell i antall
lacZ
+ metastaser fra HT29
Wnt1 svulster sammenlignet med HT29
kontroller (Fig 5D og 5E). I motsetning til dette øker med HT29
dnTCF var signifikant (figur 5D og 5E). Analyser av metastatisk kolonistørrelse bekreftet økning i mikro- og macrometastases fra HT29
dnTCF, men ikke HT29
Wnt1, svulster sammenlignet med HT29
kontroller (Fig 5F).
(A) strategi som brukes for subkutan til lungemetastaser. (B) Heat kartet normalisert mRNA uttrykk nivåer enn kontroller (og over housekeeping gener) for de markerte gener i HT29 celler dyrket in vitro eller i xenografter in vivo. Alle tall er forholdstall enn kontroller. (C, D) Effekter av modulering av WNT signalering med dnTCF eller Wnt1 uttrykk på subkutan tumorvekst (C) og metastatisk indeks (Met indeks) (D). (E) Representative eksempler på venstre lunge bilder for hvert tilfelle som nevnt. Metastaser er farget mørk blå etter Xgal reaksjon på grunn av sin celle-iboende uttrykk for
lacZ
. (F) Kvantifisering av
lacZ
+ metastatisk kolonistørrelse i tre kategorier som vist. Scale bar = 20mm for (E).
Sammen utgjør disse dataene støtter den generelle oppfatningen at cellen iboende reduksjon av kanoniske WNT signale responser i kreftceller er pro-metastastic, og hevder at statusen til APC er ikke bare korrelert til utfallet av modulering av wNT-TCF signalering.
Ulike kanoniske wnt ligander øker antall fjernt mCC11 metastaser
for å utelukke at effekten av økt metastaser etter forbedret Wnt1 var på grunn av en spesifisitet av liganden anvendes, vi gjentok den fulle metastatisk protokollen med mCC11 celler som uttrykker Wnt3a eller Wnt1, som begge aktiverer kanonisk WNT-TCF signalering og, som forventet, øke nivåene av den WNT-TCF target
AXIN2 Hotell og WNT-regulert kolon stamcelle markør
LGR5
over dem i kontrollceller (fig 6A). mCC11
Wnt3a
lacZ
+ celler produseres svulster som ligner på kontroller i størrelse, men gjengitt forbedring av fjerne lungemetastaser fra mCC11
Wnt1 svulster med lignende koloni størrelsesfordelingen (figur 6B og 6C og ikke vist).
(A) Forbedret Wnt1 og Wnt3a produsere tilsvarende endringer i mål genuttrykk tiltak ved RT-qPCR. (B) Representative eksempler på X-Gal stained venstre lungelapper med metastaserende kolonier som beskrevet. (C) Kvantifisering av metastatisk indeksen og vekt for mCC11 vekt, mCC11
Wnt1 og mCC11
Wnt3a. Både Wnt1 og Wnt3a forbedre metastaser enn kontrollene, men bare Wnt1 svulster er litt mindre. Scale bar = 20mm for (B).
mCC11
Wnt1 celler fremme metastaser fra søsken ikke-Wnt1-uttrykke celler
For å forsikre seg om at Wnt ligander fra mCC11
Wnt1 celler utøve ikke-celle autonome signalering in vivo,
lacZ
-negativ mCC11
Wnt1 celler ble blandet med
lacZ
+ vekt søsken mCC11 celler og co-injiseres for å danne subkutane svulster ( fig 7A). Etter at tumorvekst vi testet for den forbedrede nærvær av ßGal
+ mCC11 vekt- celler i lungene. mCC11
Wnt1-celler i betydelig grad fremmet den metastatiske adferd søsken mCC11 vekt- celler (fig 7B og 7C), noe som indikerer at Wnt1 ligander kan også virke ikke-autonomt i denne sammenheng.
(A) Diagram av protokollen anvendt for å teste de ikke-autonome virkninger av overuttrykt wnt ligander på søsken, ikke-overuttrykkende mCC11 celler podet på samme tid. Bare
lacZ
+;
Wnt1
– celler spores etter Xgal reaksjon. (B) Representative bilder av X-Gal stained venstre lungelapper under de beskrevne forhold. (C) Kvantifisering av metastatisk indeks og tumorvekt pr tilstand. Scale bar = 25mm for (B).
mCC11
Wnt1 cellene ikke vise økt metastaser enn kontrollene i naken eller SHO mus
Resultatene presentert ovenfor viser at kanoniske WNT signalering er pro-metastatisk i mCC11 celler, og at Wnt ligander opptre både autocrinely og ikke-autonomt in vivo, noe som tyder på at den primære svulsten stroma er usannsynlig å være den eneste målet for pro-metastatisk WNT signalering. Men vi finner også at celle-autonome undertrykkelse av TCF funksjon med dnTCF fører til en markert økning i fjerne organmetastaser fra disse cellene, som med alle andre celler som ble testet. Vi antok derfor at blokade av WNT-TCF signalisering i mCC11 celler kan være ubetinget og generelt pro-metastatisk (i tråd med resultatene i de andre testede celler), men som forbedret WNT signale kan øke metastaser fra mCC11 celler gjennom en ikke-celle autonome, mCC11-spesifikk mekanisme.
for å teste om den forbedrede metastatisk fenotype av mCC11
Wnt1 avhengig av miljøet, vi radikalt endret miljøet av podet kreftceller ved å endre belastningen av muse vertene ( fig 8A). mCC11
Wnt1 subkutane svulster vokste som kontroller gjorde i naken eller SHO mus (fig 8B og 8C), men i kontrast med den potente metastatisk fenotype av mCC11
Wnt1 celler i NSG mus som er beskrevet ovenfor, mCC11
Wnt1 svulster ikke viser en økning i antall metastaser sammenlignet med kontroller i podede naken eller SHO-mus (figur 8B og 8C). Disse resultatene tyder på at mCC11 celler ikke viser en celle iboende metastatisk forbedring i respons til økt WNT-signalering.
(A) Diagram av den fremgangsmåte som anvendes for å innpode mCC11 celler subkutant og analysene av resulterende fjernt lungemetastaser. (B) Kvantifisering av tumor vekter og metastaserende indekser som viser mangel på markedsføring av metastaser ved mCC11
Wnt1 celler podet på naken eller SHO muse verter.
Diskusjoner
Ninety tre prosent av humane tykktarm kreft havn hyperaktive av den kanoniske WNT vei, oftest gjennom tap av funksjon av APC (https://cancergenome.nih.gov/). Dette, sammen med resultatene med genetisk musemodeller, har gitt støtte til en funksjonell rolle i hyperaktiv Wnt-Tcf signalering i initiering og utvikling av tarmsvulster med celler i kultur in vitro og i musemodeller in vivo (for eksempel [2], [18], [25], [26]). Flere bevislinjer som stammer også fra arbeid med transgene mus har vist foreslått at forbedringen av Wnt aktivitet, i den metastatisk nisje ved virkningen av Periostin [13] eller ved å fremme vandringsadferd av sirkulerende tumorceller [14], driver metastaser i ulike krefttyper. Disse og andre data er tatt for å foreslå at høy kanoniske WNT signalering i ulike menneskelige kreftformer, inkludert de av tykktarmen, er avgjørende for tumorvekst og metastaser hos pasienter, og hevder for utvikling av terapeutiske WNT-TCF pathway antagonister (f.eks [3 ]).
