Abstract
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) fremmer celle motilitet, invasivitet og metastasering under embryonal utvikling og tumorigenesis. Transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) signalveien er en viktig regulator av EMT. Mye av bevisene tyder på at denne prosessen er Smad3 avhengig. Heri vi vist at eksponering av ASPC-1 og PANC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler til TGF-β1 resulterte i karakteristiske morfologiske endringer av EMT, og forbedring av celle-motilitet og gemcitabin (Gem) motstand sammen med en oppregulering av EMT markører gener slike som vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9. Naringenin (Nar) nedregulert EMT markører uttrykk i både mRNA og proteinnivåer ved å hemme TGF-β1 /Smad3 signalveien i kreft i bukspyttkjertelen celler. Følgelig Nar trykt cellene migrasjon og invasjon og reversert sin motstand mot Gem
Citation. Lou C, Zhang F, Yang M, Zhao J, Zeng W, Fang X, et al. (2012) naringenin Reduserer Invasivitet og metastaser ved å hemme TGF-β-indusert Epitelial å Mesenchymale Overgang i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (12): e50956. doi: 10,1371 /journal.pone.0050956
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 24 februar 2012; Godkjent: 29 oktober 2012; Publisert: 26.12.2012
Copyright: © 2012 Lou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Utsmykkingsfondet Nature Sciences of China (81173633), tilskudd fra staten Key Development Plan Prosjekt (2011CB707705), Stiftelsen Forsknings av Department of Health i Heilongjiang-provinsen (2010-107) og oppstartsfond av The Affiliated Third Hospital of Harbin Medical University (JJ2010-15). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en svært aggressiv svulst preget av tidlig hematogenic og lymphogenic spredning og høy forekomst av lokalt tilbakefall [1]. Svikt i klinisk behandling av kreftpasienter ofte tilskrives legemiddelresistens og metastase [2]. Imidlertid er det fortsatt ingen effektiv terapi tilgjengelig til å reversere multimedikamentresistens og hindre aggresjon og metastasering av pankreatisk tumor [3], [4], [5]. Således kan en bedre forståelse av resistens og metastase i bukspyttkjertelkreft føre til utvikling av mer effektiv terapeutisk strategi.
I løpet av de siste årene, akkumulerende bevis tyder på at epitelial til mesenchymal overgang (EMT) spiller en viktig rolle i tumorprogresjon, metastaser og medikamentresistens i ulike faste tumorer inkludert kreft i bukspyttkjertel [6], [7], [8]. Denne fremgangsmåte er karakterisert ved tapet av epithelial og kjøp av mesenkymale karakteristika [9], [10]. Under EMT progresjon, uttrykket av mesenchymale markører, for eksempel vimentin, N-cadherin og /eller fibronektin, er økt, i kontrakten, at av epitelceller adhesjonsmolekyler, inkludert E-cadherin og /eller cytokeratins, er redusert. I tillegg er epitelceller får også økt aktivitet av matriks-metalloproteinaser (MMP), inkludert MMP2, MMP3, MMP9, som bidrar til en invasiv og metastatiske fenotype [11], [12]. Som det er kjent at tumorcellemetastaser er den ledende årsak til død for kreftpasienter, forblir styringen av EMT fremgangsmåte en prioritet for bukspyttkjertelkreft terapi.
Tidligere studier har vist at transformerende vekstfaktor-β1 (TGF β1) og andre vekstfaktorer spiller sentral rolle i å drive EMT i patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen [13], [14], [15]. TGF-β overekspresjon fremmer tumormetastase i sent stadium av tumor [16]. Utvikle av TGF-p-signalisering inhibitorer har vært ansett som en attraktiv måte for å forhindre tumormetastase. For tiden er en rekke av injiserbare proteinbaserte TGF-β-inhibitorer har blitt utviklet, inkludert antistoffer som forstyrrer TGF-β ligandbinding til reseptoren, og oligonukleotider som målretter TGF-β1 mRNA [17], [18], [19]. Lite molekyl hemmere med et bestemt mål i denne signalveien har betydelige fordeler i stabilitet og biotilgjengelighet i forhold til makromolekylære kandidater. Opp til dags dato, har flere lavmolekylære inhibitorer blitt vist å ha inhiberings effekter på TGF-β reseptorfunksjon [20], [21].
Vårt nylige studier har vist at naringenin (Nar, 4 «, 5, 7-trihydroksy flavanon), en naturlig dominerende flavanon, inhiberte signifikant transkripsjon av TGF-β1-indusert Smad3, og reduserte binding sannsynligheten for TGF-β1 til dets spesifikke reseptor TβRII, og dermed hemme reseptoren dimerisering og den påfølgende nedstrøms signaltransduksjon. Videre kan Nar forbedre anti-tumor effekt av doksorubicin til A549 og MCF-7 caner celler ved selektivt å inhibere aktiviteten av multilegemiddelresistens-assosiert protein, men ikke p-glykoprotein [22], [23], [24], [25 ]. Resultatene viste også sin potensiale i behandling av kreft som en TGF-β signale antagonist.
Her prøver vi å ta opp hvorvidt Nar utøver sin anti-metastatiske og anti-resistente effekter på bukspyttkjertelen kreftceller ved å hindre svulsten celler EMT gjennom nedregulere TGF-β /Smad3 signalveien. Denne studien kan gi fornuftige forklaringer på Nar anti-tumor effekt og terapeutiske fordeler i kombinasjon Nar med andre anti-kreft narkotika.
Resultater
Nar reverserer TGF-β1-indusert resistens mot gemcitabin i ASPC-1 celler
Tidligere studier viste at ASPC-1 og Panc-1 kreft i bukspyttkjertelen celler var resistente mot gemicitabin (Gem) og hadde en evne til invasivitet og metastasering [26]. Gem er en vanlig kjemoterapeutisk legemiddel for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen i klinikken. For å undersøke hvorvidt Nar øker sensitiviteten av disse to cellelinjer til Gem bestemte vi den potensielle toksisitet av Gem til ASPC-1 og Panc-1-celler ved MTT-assay i nærvær eller fravær av Nar. Som vist i figur 1A og B, eksponering av ASPC-1 og Panc-1 celler til Nar i 72 timer førte til IC
50 (50% vekstinhiberende konsentrasjon) verdier på 347 ± 13,6 uM og 541 ± 11,9 uM, henholdsvis. Nar svakt forbedret celleproliferasjon opp til 100 uM. Videre målte vi den cellulære levedyktigheten etter 24 timers forbehandling av 50 uM Nar, etterfulgt av 72 timers behandling med forskjellige konsentrasjoner av perlen i ASPC-1 celler. IC
50-verdier var 5,3 ± 0,4 uM for Gem alene og 2,6 ± 0,4 uM for perlen, i nærvær av Nar, noe som indikerer Nar øker cytotoksisiteten av Gem til ASPC-en celle (figur 2A) i betydelig grad. Som TGF-β signalreaksjonsvei spiller en viktig rolle i å fremme motstanden av tumorceller til kjemoterapi, undersøkte vi effekten av Nar på cytotoksisiteten av perlen i cellene stimulert med TGF-β1. Som forventet, TGF-β1 stimulering forbedret ASPC-1-celler resistens mot perlen i forhold til ubehandlede celler (IC
50 10 uM versus 5,3 ± 0,4 uM figur 2B). Våre tidligere undersøkelser har allerede vist at Nar signifikant redusert serum TGF-β1 nivået i bleomycin-indusert lunge fiber modell, og som en konsekvens, forhindret tumorcellemetastasering til lungen [22]. Derfor antar vi at Nar kan ha en evne til å reversere TGF-β1-indusert motstand av ASPC-1 celler til Gem. Eksperimenter ble utført for å teste ideen. Cellene ble forbehandlet med 5 ng /ml TGF-β1 i 24 timer, etterfulgt av forskjellige konsentrasjoner av perlen i nærvær eller fravær av 50 pM Nar i 72 timer ble levedyktigheten påvist ved MTT-analyse. Som vist i figur 2B, tilsetning av TGF-β1 øket motstand av ASPC-1 celle for å Gem mens Nar reversert TGF-β1-indusert motstand. Disse resultatene tyder på at TGF-β1 spiller en kritisk rolle i motstanden av tumorceller til chemotherapeutical medikamenter slik som Gem.
(A) ASPC-1 eller (B) PANC-1-cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Nar i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Levedyktighet av cellene ble undersøkt ved hjelp av MTT. Data representerer gjennomsnitt ± SD (
n
= 4) fra individuelle eksperimenter poeng. IC50 ble utført ved anvendelse av programvaren SPSS.
(A) 50 uM Nar forbehandling i 24 timer, etterfulgt av å kombinere med annen dose Gem i 72 timer i ASPC-1-celler. (B) Forbehandling med 5 ng /ml TGF-β1 i 24 timer, etterfulgt av behandling med forskjellige konsentrasjoner av perlen i nærvær eller fravær av 50 pM Nar for neste 72 timer ble cellene levedyktigheten evaluert ved MTT-analyse. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SD (
n
= 4) fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01; *** p 0,005
Nar undertrykker TGF-β1-indusert migrasjon og invasjon av Panc-1 og ASPC-1 celler
neste fastslått hvorvidt Nar kan inhibere TGF-β-indusert EMT, som også forbinder med cellulær motilitet. Som forventet, morfologiske endringer, inkludert redusert celle-celle kontakt og knutepunkt, den dannede fiber og nål typer falske ben, ble observert etter at cellene ble behandlet med TGF-β1 i 30 timer (figur 3E), noe som indikerer EMT forekomst. I tillegg er en sårheling Analysen ble utført, er resultatet viste at behandling av PANC-1 celler med TGF-β1 i 36 timer førte til 80% lukking av sår (figur 3AJ) sammenlignet med ubehandlede celler (fig 3AG), noe som indikerer at TGF-β1 betydelig akselerert EMT prosess. Imidlertid førte behandling med 50 uM eller 100 pM av Nar i 36 timer eller 72 timer inhiberte signifikant TGF-P1-indusert celle morfologiske endringer og sårheling (figur 3Akl
vs
j; Fig 3Aqr
vs
p). Videre, i fravær av TGF-β1, behandling med 50 uM eller 100 pM av Nar i 72 timer, så også i betydelig grad hindres omtrent 60% viklede celler lukning (fig 3Ano
v.s.
M). Våre data viser at endogen eller eksogen TGF-β1 effektivt forbedrer Panc-1 celler migrasjon men Nar kan reversere denne prosessen. Lignende resultater ble også observert i ASPC-1 celler (data ikke vist).
(A) Sårtilheling analyse, Panc-1 celler dyrket ved 80% konfluens. Monolagene ble snittet med en pipettespiss i det sentrale området av kulturen. TGF-β1 og Nar ble tilsatt som indikert ganger. Fotografier ble tatt ved hjelp av fasekontrastmikroskopi (forstørrelse på x 100) umiddelbart etter innsnitt, og etter 36 timer og 72 timer fra behandlingen. (B og C) Transwell invasjon assay (B for ASPC-1 celler og C i PANC-1cells). I Matrigel-belagte cellekultur innskuddet, ble cellene behandlet som beskrevet i Materialer og metoder. Cellene som hadde invadert til den nedre overflate av filteret ble farget med krystallfiolett og fotografert. (D) Transwell migrasjon analyser. I ikke-Matrigel-belagte cellekultur innsats, å kvantifisere migrasjon, ble de fargede cellene lysert i DMSO og deres absorbans ble målt. (E) Celle ble behandlet med 5 ng /ml TGF-β1 i 30 timer ble fenomenet EMT observert av celle morfologiske endringer. Disse forsøk ble utført tre ganger. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,005
Videre undersøkte vi effekten av Nar på TGF-β1-indusert invasjon og migrasjon i ASPC-en og Panc-1 celler ved hjelp av Transwell analyser. Resultatene viste at TGF-β1 behandling betydelig forbedret evne til ASPC-1 (figur 3Bd
vs
a) og PANC-1-celler (figur 3Cj
vs
g) krysser basalmembran matrisen . Panc-1 celler utstilt mer aggressiv invasiv aktivitet enn ASPC-1 celler reagerer på TGF-β1 stimulering (figur 3Cj
v.s Figur 3Bd.
). Interessant, 50 pM Nar hemmet signifikant invasiv evne ASPC-en (figur 3BB
vs
a) og Panc-1 celler (Fig. 3 C h.
vs
g) i fravær eller tilstedeværelse av TGF-β1 (figur 3B e
vs
d;. Figur 3Ck
vs
j), 100 pM Nar viste mer markert hemmende effekt enn 50 mikrometer av Nar i disse to celle linjene (Figur 3Bc
vs
bf
vs
e Figur 3Ci
vs
hl
vs
k). I transwell migrere assay for å kvantifisere de migrerte celler, oppløst vi cellene og deretter farget med krystallfiolett i DMSO. Absorbans ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en plateleser. Lignende resultater ble også erholdt (figur 3D). Til sammen tilbyr vi sterke bevis på at Nar kan sterkt hemmer både basal og eksogene TGF-β1-indusert migrasjon og invasjon i ASPC-en og Panc-1 celler.
Nar hemmer prosessen med epitelial til mesenchymale overgang ( EMT) ved å redusere ekspresjon av mesenchymale markører
for å teste hvorvidt Nar regulerer produksjonen av ekstracellulær matriks og ekspresjon av markørgener i EMT ASPC-1 og PANC-1-celler i nærvær eller fravær av TGF-β1, sanntids RT-PCR-analyse ble utført. Primerne for mesenchymale markører er vist i tabell 1. Totalt RNA ble isolert fra celler behandlet med et kjøretøy eller 5 ng /ml TGF-β1 eller 5 ng /ml TGF-β1 plus Nar (50 uM, 100 uM). Celler behandles med 5 ng /ml TGF-β1 i 24 timer førte til en betydelig økning i EMT markører mRNA som vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9. I mellomtiden har vi funnet at nivåene av TGF-β1-indusert EMT markører mRNA ble betydelig redusert i Nar-behandlede celler (figur 4A, B, C D). For å vurdere om endringer av E-cadherin, vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9 i genuttrykket er også assosiert med sine endringer i proteinnivå, ble western blot utført etter at cellene behandlet med 5 ng /ml TGF-β1 med eller uten 50 mM Nar (figur 4E 0,05,
## p. 0,01
v.s
Control.
* p 0,05, ** p. 0,01
v.s
5 ng /ml TGF-β1 alene. (E og F). Proteinet ekspresjon av EMT markører ble målt ved hjelp av western blot (F for ASPC-1-celler og G for PANC-1 celler). (G og H) verdi av densitometrisk scan ble anvendt for å kvantifisere endringer av mesenchymale markører (H for ASPC-1-celler, I for PANC-1 celler). Data var middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Nar utøver sin effekt på TGF-β1 signalveien ved å regulere Smad3
I klassisk Smad-avhengige veier, TGF β-indusert aktivering av reseptor-komplekset fører til fosforylering av Smad2 og Smad3, i samarbeid med Smad4 som TGF-β-indusert transkripsjon regulatorer. I motsetning til dette, Smad6 og Smad7 hemme aktivering av reseptor-regulert Smads [27], [28], [29]. I den foreliggende undersøkelse, utførte vi RT-PCR for å undersøke genekspresjon som er involvert i reguleringen av TGF-β signalering. ASPC-1 og Panc-1-celler ble forbehandlet med 50 pM eller 100 pM Nar i 24 timer, etterfulgt av behandling med eller uten TGF-β1 i ytterligere 24 timer. De mRNA nivåer av TβRI, TβRII, Smad2, Smad3, Smad4, og Smad7 ble overvåket av RT-PCR og kvantifisert. Resultatene viste at Nar ikke hadde noen innflytelse på mRNA-nivåene av TβRI, TβRII og Smad2, selv ved høye konsentrasjoner (100 um) (Figur S1). Imidlertid, behandlet med TGF-β1, Nar markert nedregulert mRNA nivået av Smad3 (figur 5A 0,05; ** P 0,01. *** P 0,005. (C) og (D) Panc-1-celler ble transfektert med GFP-Smad3 eller GFP-C1 plasmid i 6 timer, deretter vasket, endret for å fullmedium, 100 uM Nar i 24 timer, deretter eksponert for 5 ng /ml TGF- β1 eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGF-β1 og 100 uM Nar for neste 24 timer for QRT-PCR (C) eller western blot (D).
på den annen side, SB- 431 542, et velkjent spesifikk hemmer av TβRI, har vist seg å hemme fosforylering av Smad2 /Smad3 [30]. I vår studie, SB-431 542 unnlot å påvirke mRNA uttrykk for Smad3 og Smad7 (figur 5E), men redusert fosforylering av Smad3 i Panc-1 celler (Figur 5G). Det tilsvarende resultat ble også observert i ASPC-1-celler (data ikke vist). Våre data antyder at Nar har en annen mekanisme fra SB-431542 for å inhibere TGF-β-medierte biologiske effekter. Til sammen våre resultater sterkeste at Nar utøver sin effekt på TGF-β1 signalveien hovedsakelig gjennom nedregulere Smad3.
Diskusjoner
EMT fremmer tumorceller migrasjon og invasiv fra stedet av opprinnelse og diffusjon for å fjerne vev og organer, og også medierer tumorceller utvikler resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter. Denne prosessen blir utløst av både den autokrine og parakrine TGF-p-signaler. Flere studier har vist at TGF-B alene eller i kombinasjon med andre vekstfaktorer så som EGF spiller viktige roller i å mediere EMT i mange maligne tumorer inkludert kreft i bukspyttkjertel [31], [32]. Dermed regulerer TGF-β signalveien er effektiv strategi for å kontrollere kreft progresjon.
I denne studien fant vi at Nar økt følsomhet for kreft i bukspyttkjertelen celler til perle i nærvær eller fravær av TGF-β1. TGF-β1 betydelig forbedret motstand av ASPC-1 celler til Gem men Nar fullstendig reversert TGF-β1-indusert motstand, noe som tyder på at Nar kan blokkere TGF-β1 å mediere signaltransduksjon. Dette funn var også i en god overensstemmelse med våre tidligere rapporter om at Nar har evner til å inhibere TGF-β1 sekresjon og for å redusere sannsynligheten binding av TGF-β1 til dets spesifikke reseptor TβRII [22], [23]. En av våre tidligere studier viste at Nar forbedret anti-tumor effekt av doksorubicin til A549 og MCF-7-celler caner ved selektivt modulerende legemiddel-avgivelsesveier [25]. Andre forskere har også funnet at Nar utstilt høye antineoplasic aktiviteter mot den klassiske MDR underlinjen stammer fra mage (EPG85-257), bukspyttkjertel (EPP85-181), og tykktarm (HT-29) karsinomer kreftcellelinjer samt andre avledet multiresistent cellelinjer [33]. Disse data antyder at det kan være en sammenheng mellom TGF-β1 signalveien og flermedisinresistens veier, som skal undersøkes i fremtiden.
I tillegg Nar inhiberte signifikant TGF-β1-indusert EMT ved å redusere ekspresjon av vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9 både mRNA og proteinnivåer. Vi deretter undersøkt TGF-β /Smads signalveien relaterte gener ekspresjon i ASPC-1 og PANC-1cells, og fant at Nar spesifikt nedregulert Smad3 ekspresjon i disse to cellelinjer og eksogen ekspresjon av Smad3 effektivt kunne omgå den inhiberende effekt av Nar på TGF-β1-indusert EMT fenotype som migrasjon. Andre forskere rapporterte at Smad ubiquitinering regulatoriske forhold (Smurfs) indusert Smad3 ubiquitinering for proteasomal degradering resultat i forstyrre dannelsen av Smad3 komplekser for å slå av TGF-β signale transduksjon [34]. I vår studie, kan effekten av Nar mink Smad3 proteinnivået være uavhengig av TGF-β1, som presise mekanismen er fortsatt uklart. Men våre resultater viser tydelig at Nar hindrer EMT prosessen med tumorceller ved å nedregulere TGF-β /Smad3 signale transduksjon. Dette funnet tilveiebringer en rimelig forklaring på hvorfor Nar har gunstige antitumormetastatisk effekt in vivo med svak toksisitet overfor tumorceller in vitro [22], [35]. SB-431542 [36], en liten molekyl inhibitor av TβIR, hadde blitt vist å inhibere TGF-β-indusert EMT ved regulering av fosforylering av Smad2 /3 i tumorceller, som er i overensstemmelse med våre resultater. Forskjellen mellom Nar og SB-431 542 i reguleringen av TGF-β /Smads signalveien antyder at de kan ha ulike biofunctions.
I konklusjonen, Nar undertrykker migrasjon, invasjon og Gem motstand av kreft i bukspyttkjertelen celler ved å hemme TGF-β /Smad3-mediert EMT. Disse funnene viser at Nar kan tjene som en ny potensiell agent for å hindre tumorprogresjon og metastase for kliniske applikasjoner.
Materialer og metoder
Material
naringenin (Nar) ble kjøpt fra Shanxi Huike Botanical Development Co. (Kina). SB-431542 ble levert av Sigma-Aldrich (Tyskland), ble de lagret som en stamløsning i dimetylsulfoksid (DMSO), som ble brukt etter fortynning med medium for hver analyse. Konsentrasjonen av DMSO overskred ikke 0,05% i en hvilken som helst analyse. Cytokin rekombinant humant TGF-β1 ble innkjøpt fra R & D system (Minneapolis, MN, USA) og rekonstituert i 10 mM sitronsyre inneholdende et bærerprotein (0,1% BSA), pH 3,0 til en konsentrasjon på 2 mg /ml. Gemicitabin (Gem) ble levert av Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.LTD (Kina). Trizol reagent og Super III Platinum Two-Step QRT-PCR Kit med SYBR Grønn ble oppnådd fra Invitrogen ™ (USA). BCA ™ protein Assy Kit var fra Thermo Scientific (USA). Sepectra ™ Multicolor bredt spekter protein Stige og DL1000bp, DL500bp DNA Ladder markører ble hentet fra Takara Bioteknologi Co (Dalian, Kina).
Proteasehemmer og fosfatase inhibitor cocktail tre ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Tyskland) .Vimentin primært antistoff (mus monoklonalt IgG Sc-32322) ble gitt av Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA), cellelyse buffer og Phospho-Smad3 (Rabbit mAb IgG Ser423 /425), E-cadherin (Rabbit mAb), N-cadherin (kanin-mAb), GAPDH (kanin-mAb) primært antistoff og andre antistoffer (anti-kanin-IgG-HRP-bundet antistoff og anti-mus IgG HRP-bundet antistoff) ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology Inc (USA). MMP2 antistoff (ab80737, mus monoklonalt IgG), MMP9 antistoff (ab76003, Rabbit monoklonalt IgG) ble kjøpt fra Abcam (Hong Kong). Alle andre reagenser var av analytisk ren.
Cellekultur
ASPC-1 og Panc-1-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellekulturmedium og føtalt bovint serum ble ervervet fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Kulturflasker og retter var fra Corning (Corning, New York). Celler ble dyrket i RPMI 1640 eller DMEM-medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 U /ml), og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Cellene ble dyrket hver 3-4 d. I hver analyse medikamentene ble fortynnet med X-VIVO 15 kjemisk definert serumfritt medium (Lonza, Sveits)
celleveksthemmende analyse
ASPC-1og PANC-1-celler ble sådd ut ved en tetthet på 10 x 10
3-celler eller 3 x 10
3 per brønn i 100 pl RPMI 1640 eller DMEM-medium i 96-brønners plater og dyrket i 24 timer, henholdsvis. Celler ble utsatt for en serie av konsentrasjoner av Nar i 24 timer, 48 timer eller 72 timer ble levedyktigheten av celler målt ved anvendelse av methylthiazoletetrazolium (MTT) -metoden, som tidligere beskrevet [37]. I korte trekk ble 150 ul MTT-løsning (0,5 mg /ml i fosfatbufret saltvann [PBS]) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Etter inkubering ble 150 ul DMSO (Sigma) tilsatt til hver brønn i 10 minutter ved romtemperatur. Absorbansen ble målt ved 490 nm ved hjelp av en plateleser (Thermo, Erlangen, Tyskland). Den midlere prosentandel av celleoverlevelse i forhold til ubehandlede celler, ble beregnet fra data for tre individuelle eksperimenter. Konsentrasjonen av medikamentet ved hvilken celle lethaling var 50% ble beregnet ved hjelp av kurvetilpasning SPSS (versjon 12,0, SPSS, Chicago, IL). For kombinert med ulike legemidler, etter at cellene var inkubering over natten, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende (50 uM, 100 uM) Nar alene eller i kombinasjon med TGF-β1 (5 ng /ml) i 24 timer og deretter utsatt for Gem for ytterligere 72 timer ble levedyktighet av celler påvises ved MTT-analyse.
sårtilheling analysen
scratch ble gjort over monolaget i ASPC-1 celler og Panc-1 celler. Celler ble dyrket i 6-brønns plater og de konfluente celler i kultur (80%), cellemonolagene ble nøye såret ved å skrape med en steril plastpipette spiss. Cellene ble vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), behandlet med 5 ng /ml TGF-β1 eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGF-β1 og 50 eller 100 uM Nar. For hver scratch, ble bildene tatt på 0, 36 timer, 72 timer ved hjelp av en invertert mikroskop (NIKON ECLIPSE TS100 10 × 4. Japan) i de samme feltene. Hvert eksperiment ble utført minst to ganger.
Matrigel invasjon og migrasjons assays
bølgen analyser ble utført ved bruk av 24-brønners Falcon BD ™ Cellekultur innsatsen (8 um porestørrelse, Becton Dickinson USA). I korthet ble cellene sådd ut på 60 mm engangs cellekulturskåler (Shanghai sunab Bio Tech Development Inc. porselen) og ble for-behandlet dem med 50 eller 100 uM Nar i 24 timer, deretter eksponert for 5 ng /ml TGF-β1 eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGF-β1 og 50 eller 100 uM Nar for neste 24 timer. Filteret ble belagt med 15 ul av basalmembran matriks (vekstfaktor reduseres, fenol rød-fri, LDEV Frie, BD Biosciences). De behandlede celler ble trypsinisert og resuspendert i x-vivo-15 medium og sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
4 celler eller 2 x 10
4 per brønn på toppen kammeret. Den nederste kammeret ble fylt med 0,6 ml x-vivo15 med 5% FBS inneholdt med prøver (kontroll, 5 ng /ml TGF-β1, 50 uM og 100 uM Nar, kombinasjonen av 5 ng /ml TGF-ß1 og 50 uM eller 100 mikrometer Nar) som chemic tiltrekkende. Etter analysekamrene ble inkubert i 24 timer i en CO
2 inkubator, ikke-invaderende celler ble forsiktig fjernet med en bomullspinne. Filtermembranen ble fiksert med kald metanol og farget med krystallfiolett i 15 min. Cellene på den øvre overflate ble forsiktig fjernet med en bomullsdott, og cellene på den nedre overflate av filtrene ble shooted under et Leica DM 2500 patologisk bilde og analysesystem (Tyskland) ved 50 x forstørrelse. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
Migrasjon analysene ble utført ved hjelp av 24-brønns BD Falcon ™ Cell kultur innsats. Kort fortalt ble full-lengde human Smad3 cDNA amplifisert fra pCMV5B-Smad3 vektor [38]. Smad3 fragment ble ligert inn i GFP-C1-konstruksjon (Clonetech) for GFP-C1-Smad3 (GFP-Smad3). Panc-1 celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) ved 37 ° C i en 5% CO
2.
