Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er fortsatt den tredje vanligste kreftformen og den nest vanligste årsakene til kreft-relaterte dødsfall rundt om i verden. Metformin, et biguanid, som er mye brukt for behandling av diabetes mellitus, er nylig blitt vist å ha en undertrykkende effekt på CRC risiko og dødelighet, men ikke alle laboratoriestudier tyder på at metformin har antineoplastisk aktivitet. Her undersøkte vi effekten av metformin og AMPK aktivator AICAR på CRC celler spredning. Som et resultat, har metformin ikke hemmer celleproliferasjon eller indusere apoptose for CRC-cellelinjer in vitro og in vivo. Forskjellig fra metformin, AICAR fremkom antitumoraktivitet og sensibiliserte anticancer virkning av 5-FU på CRC-celler in vitro og in vivo. I ytterligere analyse, viser vi at AMPK-aktivering kan være en nøkkel molekylær mekanisme for den additive effekt av AICAR. Til sammen våre resultater tyder på at metformin har ikke antineoplastisk aktivitet for CRC celler som monoterapi, men AMPK aktivator AICAR kan indusere apoptose og forsterke den cytotoksiske effekten av 5-FU gjennom AMPK aktivering
Citation. Sui X, Xu Y, Yang J, Fang Y, Lou H, Han W, et al. (2014) Bruk av metformin alene er ikke forbundet med Overlevelses Utfall av tykktarmskreft Cell men AMPK Activator AICAR sensitizes Anticancer Effekt av 5-fluorouracil gjennom AMPK aktivering. PLoS ONE 9 (5): e97781. doi: 10,1371 /journal.pone.0097781
Redaktør: Dimitri Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary, Harvard Medical School, USA
mottatt: 16 februar 2014; Godkjent: 23 april 2014; Publisert: 21. mai 2014
Copyright: © 2014 Sui et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (bevilgning nr 81301891 og 81272593) og Natural Science Foundation Zhejiang Provincial of China (gi nr LQ13H160008). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er fortsatt en ledende årsak til kreft-relaterte sykelighet og dødelighet over hele verden, selv om mye av det er gjort framskritt i behandlingen av CRC i løpet av de siste årene [1], [2 ]. Epidemiologiske studier har vist at diabetes mellitus (DM) øker forekomsten og dødelighet av kreft, spesielt gastrointestinal kreft [3], [4]. Det er økende bevis knytter diabetes mellitus med en økt risiko for tykktarmskreft [5], [6]. Imidlertid har enkelte andre studier ikke støttet dette synet. En multisenter, dobbeltblind, placebokontrollert, randomisert kontrollert studie viste at det var ingen statistisk signifikant forskjell i tykktarm-kreftspesifikk overlevelse hos dem som med diabetes [7]. Så, forholdet mellom DM og CRC risiko fremdeles kontroversiell.
metformin (1,1-dimethylbiguanide hydroklorid), et biguanid-derivat som er mye brukt for behandling av diabetes mellitus, er blitt vist å utøve potensielt viktige kreft effekter [ ,,,0],8], [9], men andre har ikke støttet dette synet [10], [11]. Som er involvert i den antineoplastiske effekt av metformin mekanismer er sannsynligvis meget mangfoldig, inkludert aktivering av adenosin monofosfat kinase (AMPK) [12], fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) mutasjon [13], p53 mangel [14] og så videre. Blant disse mekanismene, spiller AMPK- mammalian target of rapamycin (mTOR) aksen en sentral rolle for de antineoplastiske effekter av metformin. Både metformin og 5-amino-imidazol-4-karboksamid-1-b-4-ribofuranosid (AICAR) kan aktivere AMPK pathway. AMPK er en serin /treonin-kinase og et celledelt brennstoff sensor pathway følsom for økning av AMP /ATP-forhold, som er blitt knyttet til en rekke humane tumor suppressorer [15]. Virkningene av metformin er hovedsakelig forklares ved aktivering av AMPK, som inhiberer proteinsyntese og glukoneogenese i løpet av cellulært stress [16].
Hittil har 5-fluorouracil (5-FU) forblir en mye brukt kjemoterapeutisk medikament i behandling av tykk- og endetarmskreft. Nylig er metformin rapportert å ha en synergistisk effekt i kombinasjon med noen kjemoterapeutiske midler [17], [18]. Imidlertid er det uklart om metformin eller AICAR kan anvendes i kombinasjon med 5-FU for å forbedre den anticancer virkning, siden det er ingen studie på korrelasjonen mellom metformin /AICAR og 5-FU-behandling in vitro og in vivo.
Vi undersøkte effekten av metformin og AMPK aktivator AICAR på CRC celleproliferasjon. Her viser vi at bruk av metformin alene ikke er assosiert med overlevelse utfall av kolorektal kreft celle men AICAR kan indusere apoptose og forbedre den cytotoksiske effekten av 5-FU gjennom AMPK aktivering, som bør vurderes i de pågående kliniske studier der metformin er brukt i behandling av tykktarmskreft.
Resultater
metformin hemmet ikke tykktarmskreft cellevekst
for å undersøke om metformin påvirker menneskelig tykktarmskreft celleproliferasjon vi undersøkte effekten av stoffet på tre kreftcellelinjer: HCT116, RKO og HT29 celler. Celler ble dyrket i 10% føtalt bovint serum (FBS), behandlet med metformin (1 og 5 mM) og AICAR (5 mM) som en kontroll. AICAR er kjent for å indusere apoptose. MTT-levedyktighet Analysen ble utført etter tilsetning av agentene i 24 timer. Som et resultat, AICAR redusert cellelevedyktighet med 50-70% i de tre cellelinjer, men liten reduksjon av cellelevedyktighet ble funnet i de tre cellelinjene som ble behandlet med metformin (figur 1A), noe som indikerer metformin kan ha noen virkning på tykktarmskreftcelle vekst. For å bestemme hvorvidt metformin hemmer forankrings-uavhengig vekst, utførte vi en soft-agar-kolonidannelse analysen i fravær eller nærvær av 5 mM metformin fornyet daglig. Etter 2 uker ble cellene tellet under et mikroskop. I overensstemmelse med MTT levedyktighetsanalyseresultatene, ble metformin ikke redusere antallet og størrelsen på kolonier (figur 1B). Disse resultatene tyder på at metformin ikke var i besittelse veksthemmende aktivitet i tykktarmskreftcellen.
(A) HCT116, ble RKO og HT29 sådd ut i 96-brønners plater. Etter 24 timer, metformin (1 og 5 mM) og AICAR (5 mM) ble tilsatt til kulturmediet. 24 timer etter tilsetningen av midlene ble effekten av metformin på tykktarmskreft celleoverlevelse utført en cellelevedyktighet assay (MTT). (B) Fotografier av myke agar kolonier av HCT116, RKO og HT29 celler 2 uker etter behandling med 5 mM metformin og 5 mM AICAR. (3) Cancer cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av metformin (1, 5 og 10 mM) for ulike tid, da, ekspresjon av aktiv caspase-3 og /I-forhold LC3-II ble undersøkt ved western blotting.
metformin ikke indusere apoptose, autophagy og cellesyklus arrest
for å undersøke om metformin indusere apoptose og autofagi, ble tre kreftcellelinjer behandlet med ulike konsentrasjoner av metformin (1, 5 og 10 mm ) for ulike tid, da, ekspresjon av aktiv caspase-3 og LC3-II /l-forhold ble bestemt ved western-blotting. Som vist på figur 1C, ble apoptose og autofagi ikke aktivert i dose- og tidsavhengig måte når cellene ble behandlet med metformin. For ytterligere bekreftelse, ble alle disse behandlede celler analysert ved elektronmikroskopi og flowcytometri. Disse tre cellene som vises omfattende apoptotiske celler (figur 2A) og en øket sub-populasjon G1 (figur 2B) etter AICAR behandling. I motsetning til dette var svært få apoptose sett i metformin-behandlede celler. Vi spurte om metformin påvirker cellesyklus. Som vist i figur 2B, observerte vi den samme prosentandelen av celler i G0 /G1, G2and i S-fasen i metformin-behandlede celler i forhold til deres kontroller. Tatt sammen, våre data viser at metformin induserte ikke apoptose, autophagy og cellesyklus-stans.
(A) 24 timer etter tilsetning av 5 mM metformin og 5 mM AICAR, effekten av metformin på tykktarmskreftcelle overlevelse ble observert. Representant celle morfologiske endringer som oppdages ved lysmikroskopi; karakteristiske morfologiske trekk ved apoptose ble observert, inkludert avløsning og celle krymping. (B) Brøkdeler av celler i sub-G1, G0 /G1, S eller G2 /M faser av cellesyklusen er undersøkt etter behandling med metformin og AICAR.
AICAR forsterkes Anti-kreft effekten av 5-FU in vitro og in vivo
Det har blitt erkjent at 5-FU blir vanligvis brukt i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler for å forbedre dets terapeutiske virkning for CRC pasienter. For å undersøke hvorvidt AICAR kan sensibilisere anticancer virkning av 5-FU, evaluerte vi virkningen av AICAR på 5-FU-indusert apoptose. Vi fant at levedyktigheten til celler behandlet med AICAR i kombinasjon med 5-FU var signifikant lavere enn den til kontroller (figur 3A). Strømningscytometri viste at andelen av apoptotiske celler var signifikant høyere i celler behandlet med AICAR i kombinasjon med 5-FU i forhold til kontroller (figur 3B). Disse resultatene tyder på at AICAR forbedrer 5-FU-indusert apoptose i kolorektal kreftceller.
(A) HCT116, ble RKO og HT29 sådd ut i 96-brønners plater. Etter 24 timer, metformin (5 mM), AICAR (5 mM), 5-FU (20 uM) og AICAR pluss 5-FU ble tilsatt til kulturmediet. 24 timer etter tilsetningen av midlene ble effekten av metformin og AICAR på tykktarmskreft celleoverlevelse utført en cellelevedyktighet assay (MTT). (B) Representative resultater av annexin V-FITC /PI farging og kvantitativ analyse; Verdiene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter; * P. 0,05
For å undersøke om metformin og AICAR kunne påvirke tumorvekst in vivo, vi deretter injisert naken mus subkutant med HT29 celler. Musene med tumorxenografter nådde 100 mm
3 ble tilfeldig delt inn i 5 forsøksgrupper: kontrollgruppen, metformin 200 mg /ml /d (i drikkevann, som tilsvarer 15 mg /kg) gruppe, AICAR 400 mg /kg /2 dager gruppe, 5-FU 40 mg /kg /2 dager gruppe og AICAR pluss 5-FU gruppe i 5 uker. Behandling ble administrert via intratumoral injeksjon. Alle mus tolerert denne behandlingen godt uten betydelig toksisitet og hadde stabil kroppsvekt. Først ble metforminnivåer analysert (3 timer og 15 timer etter metformin injeksjon) ved hjelp av høy ytelse væskekromatografi og metformin nivåer i musesera var i gjennomsnitt 1.15 (± 0.31) g /ml for topp som tilsvarte omtrent humane toppnivåer for 500 mg po (Muntlig) daglig. Forsøkene ble utført in triplo, og resultatet viste at nivåene av metformin i plasma hos hunn nakne mus ble vanligvis oppnådd i mennesker. Da tumorstørrelsene fra xenotransplantater ble målt. Som et resultat, ble tumorstørrelse fra xenotransplantater av AICAR gruppe ikke metformin gruppe som er mindre sammenlignet med kontrollgruppen. Videre er størrelsene av AICAR pluss 5-FU gruppe var betydelig mindre i forhold til AICAR alene eller 5-FU gruppe, noe som tyder på at AICAR kunne potensere 5-FU-indusert kreft effekt av HT29 (figur 4A).
( A) vekst~~POS=TRUNC kurve~~POS=HEADCOMP av xenograft tumorer som ble behandlet med angitte legemidler. (B) Effekten av AICAR på AMPK aktivering. Uttrykket av aktiv caspase-3, ble p-AMPK og p-mTOR analysert ved Western blotting.
AICAR kan øke Anticancer av 5-FU gjennom AMPK aktivering
Det har vært erkjent at effekten av AICAR er i hovedsak forklares med aktivering av AMPK, som regulerer cellulær energi metabolisme. For å undersøke hvorvidt AMPK-aktivering kan være assosiert med den additive virkning av AICAR, ble fosforylering av AMPK og mTOR vurdert ved Western blotting ved anvendelse av spesifikke antistoffer. Vi har funnet at p-AMPK indusert av 5-FU ble forsterket av AICAR, sammen med nedsatt p-mTOR og øket aktiv caspase-3 (Figur 4B), som indikerer at aktivering av AMPK ved AICAR potenseres 5-FU-indusert apoptose.
Diskusjoner
Selv om økende bevis støtter ideen om at hyperinsulinemi og hyperglykemi fremme kreftutvikling hos pasienter med diabetes mellitus [19], [20], er det fortsatt kontroversielt hvorvidt risikoen for tykktarmskreft er også forbundet med diabetes mellitus og metformin behandling kan redusere risikoen for CRC [10].
metformin, et biguanid derivat, er en mye brukt og godt tolerert legemiddel for behandling av type 2 diabetes mellitus. Effektiviteten av metformin som et antidiabetisk medikament kan forklares ved dets evne til å redusere hepatisk glukoneogenese og stimulerer glukoseopptak i muskulatur, noe som resulterer i reduserte sirkulerende glukosekonsentrasjonen [21]. Metformin nivå hos mennesker er i mikromold nivåer, men gut kan eller ikke kan se mili-molar nivåer. Nyere data indikerer at metformin kunne beskytte mot kreft inkludert CRC og har anti-tumorvirkninger i mus transplantater [22], [23]. Interessant er det en konflikt rapport om den potensielle rolle metformin og kreft. Bodmer og kolleger fant at bruk av metformin ikke var assosiert med en redusert risiko for tykktarmskreft og metformin også endret ikke risikoen for lungekreft [10], [24]. Det er også rapportert at det var ingen statistisk signifikant sammenheng mellom metformin eksponering og spres kolorektal kreft ved diagnose [25]. Metfromin kanskje ikke på vanlige kreftceller, men arbeider på stamceller. Det har vist seg at metformin kan selektivt målrette kreft stamceller [26], og virker sammen med kjemoterapi for å blokkere tumorvekst og forlenge remisjon i flere cancercelletyper [26], [27]. Metformin kan også hemme den inflammatoriske respons forbundet med cellulær transformasjon og kreft stamcellevekst [28]. I tillegg kan metformin akselerere veksten av BRAF V600E-drevet melanom ved oppregulering VEGF-A [29] og fremme den angiogene fenotype i ERalpha negative MDA-MB-435 brystkreftmodell [30]. Samlet sett metformin kan bare ha effekter i forebyggingen startfasen, men etter at kreften har blitt etablert, kan det ikke ha en effekt. Våre data viser også at metformin eksponering ikke hemme tykktarmskreft cellevekst, indusere apoptose eller autofagi og cellesyklus arrest. Etter avtale med in vitro, in vivo studie viste at metformin ikke undertrykke tumorvekst, men AMPK aktivator AICAR dukket antitumor aktivitet. Derfor metformin kan ha noe antineoplastisk aktivitet for CRC celler som monoterapi.
kreft effekter av AICAR er mediert av aktivering av AMPK og reduksjon av mTOR signale [31]. AMPK aktivering kan undertrykke mTOR vei til å hemme cellevekst og spredning. AICAR har blitt rapportert å forbedre effektiviteten av konvensjonelle kjemoterapeutiske midler ved behandling av lokale og metastatisk nasofaryngeal karsinom (NPC) [32]. AMPK aktivatorer slik som AICAR tilveiebringe en terapeutisk strategi for hematologiske maligniteter [33], [34]. Først kan AICAR indusere apoptose i B-celle kronisk lymfatisk leukemi celler [35] og drepe kronisk myelogen leukemi (KML) celler gjennom PKC-avhengig induksjon av autophagic celledød [36]. For det andre har AICAR antileukemisk effekter på BCR-ABL-uttrykkende celler [37] og barndommen akutt lymfatisk leukemi (ALL) celler [38]. For det tredje kan AICAR indusere G (1) /S arrest og Nanog downregulation via p53 og forbedre erytropoide differensiering [39]. Endelig kan AICAR også indusere apoptose uavhengig av AMPK og p53 gjennom oppregulering av BH3-bare proteiner BIM og NOXA i kronisk lymfatisk leukemi celler [40]. I tillegg til NPC og leukemi, er AICAR involvert i nervestamcellevekst undertrykkelse og cellesyklus-stans ved å nedregulere fosfo-retinoblastom protein og cyklin D [41]. AICAR kan hemme veksten av retinoblastom ved å redusere angiogenese og indusering av apoptose [42] eller aktivering av AMPK [43]. AICAR er også vist å hemme spredning av EGFRvIII uttrykke glioblastom gjennom AMPK vei [44]. Videre kan AICAR brukes i kliniske studier som et hjertebeskyttende henhold til ATP-utarmet forhold og har vist seg å være en øvelse mimetisk i dyr [45]. Etter avtale med disse resultatene, rapporterte vi at AICAR kan indusere apoptose å dukke antineoplastisk aktivitet. Videre AICAR forsterket den cytotoksiske effekten av 5-FU gjennom AMPK aktivering.
I konklusjonen, vår studie viste at bruk av metformin alene er ikke forbundet med overlevelses utfall av kolorektal kreft celle men AMPK Activator AICAR kan indusere apoptose og dukke antineoplastisk aktivitet. Videre kan aktivering av AMPK være en viktig årsak som AICAR kan forsterke den cytotoksiske effekten av 5-FU i kolorektal kreftceller.
Materialer og metoder
Cell Culture
menneskelige kolorektal kreft cellelinjer HCT116, ble RKO og HT29 kjøpt fra ATCC (LGC Standards SLU, Barcelona, Spania). Cellelinjene ble opprettholdt i McCoys 5A eller Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Gibco BRL, Rockville, MD, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen), og 2 mmol /L L-glutamin ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2.
Material
5-FU ble innkjøpt fra Jinyao amino Acid Co., Ltd (Tianjin, Kina). AICAR og metformin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Anti-fosfor-eIF2α og fosfor-AMPK ble kjøpt fra Cell Signaling.
Måling av celleviabilitet og apoptose
Celleviabilitet ble bestemt ved MTT-analyse. Celler ble sådd ut i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater ved en tetthet på 1 x 10
4 celler per brønn. Midlene ble tilsatt i de konsentrasjoner som er angitt i 24 timer. Absorbansen ble målt på en mikroplateleser (Synergy HT, Bio-Tek, USA) ved 570 nm.
Phartmingen annexin V-FITC Apoptose Ddtection Kit I (BD, USA) ble brukt til å påvise apoptose og estimeringen prosedyren ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. 2 x 10
6-celler ble sådd ut på en 6 cm plate. Etter festing over natten, ble cellene vasket to ganger med PBS og ble mediet erstattet med medium 5 mM metformin eller 20 ug /ml 5-FU. Alle celler, inkludert de flytende cellene i dyrkingsmediet ble høstet. Cellene ble resuspendert i iskald 1 x bindingsbuffer ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml. 100 ul av cellesuspensjonen ble hver blandet med 5 pl FITC Annexin V og 5 ul PI. Blandingen ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke og deretter analysert ved FACSCalibur Flowcytometer (BD Biosystems, Heidelberg, Tyskland).
myk-agar-kolonidannelse Assay
500 celler var suspenderes i medium inneholdende 0,3% lav-smelte agarose, sådd ut i en seks-brønns plate som var belagt med 0,5% lav-smelte agarose, og tillatt å vokse i 2 uker ved 37 ° C i 5% CO
2. Koloniene som inneholdt mer enn 50 celler ble tellet under et mikroskop. Tre brønner ble analysert for hvert eksperiment.
Cell-syklus Analyse
Cellene ble trypsinert, skylt to ganger i iskald PBS og resuspendert i 200 ul citrat-buffer (250 mM sukrose, 40 mM tri-natriumcitrat, 5% dimetylsulfoksid (DMSO) justert til pH 7,6 med 40 mM eddiksyre). Propidiumjodid (40 ug /ml) ble tilsatt til cellene og inkubert i 45 minutter i mørke ved 4 ° C før analyse.
Western Blot analyse
Cellene ble høstet fra dyrkede retter og ble lysert i en lyseringsbuffer [20 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% NP-40, 1% aprotinin, 1 mM phenylemethylsulfonyl fluorid (PMSF), 1 mM natriumvanadat]. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av en BCA Protein Assay Kit (Pierce). Cellelysatene (40 ug protein /linje) ble separert på en 5 til 20% Tris-Tricine Klar Gel SDS-PAGE (Bio-Rad) for nitrocellulosemembran blotting. De blottet Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i 1 time og ble inkubert med primære antistoffer. De immunoreaktive bånd ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens hjelp av pepperrot perox-amidase-konjugert IgG sekundære antistoffer. Bandet tetthet ble målt ved densitometri, kvantifisert ved anvendelse av gel som plotter makroer av NIH bilde 1,62, og normalisert til en indikert prøven i den samme membranen.
In vivo Subkutan tumor Model
Alle de in vivo eksperimentelle protokoller ble godkjent av animal Care komité av Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University. Levedyktige HCT116-celler (1 x 10
7cells i 0,1 ml fosfatbuffer saltvann) ble injisert subkutant inn i høyre dorsale flanke av 6 uker gamle hunn BALB /c nakne mus (seks mus pr gruppe). Tumorvolumet ble bedømt hver 2. dag i 4 uker. Tumorvolumet ble beregnet ved følgende formel: (kort diameter)
2 x (lengste diameter) /2
Statistiske analyser
Resultatene er uttrykt som verdier for gjennomsnitt ± standardavvik (. SD). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 11.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Vi utførte paret t-test (tosidige) statistisk analyse, statistisk signifikans ble satt til p. 0,05
