Abstract
Bakgrunn
Celleoverflate- sialysering fremstår som en viktig funksjon i kreftcelle metastaser. Sialyltransferase ekspresjon har blitt rapportert å bli forandret i tumorer og kan forklare dannelsen av sialyserte tumorantigener. Vi har fokusert på påvirkning av alfa-2,3-sialyltransferase ST3Gal III i viktige trinnene i bukspyttkjertelen tumorigent prosessen.
metodikk /hovedfunnene
ST3Gal III overekspresjon bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer Capan- 1 og MDAPanc-28 ble generert. De viste en økning av tumorassosiert antigen sialyl-Lewis
x. Transfektantene «E-selektin bindingskapasitet var proporsjonal med celleoverflaten sialyl-Lewis
x nivåer. Cellular migrasjon positivt korrelert med ST3Gal III og sialyl-Lewis
x nivåer. Videre intrasplenic injeksjon av ST3Gal III transfekterte celler i atymiske nakne mus viste en nedgang i overlevelse og høyere metastasedannelse i forhold til de mock cellene.
Konklusjon
I sammendraget, overekspresjon av ST3Gal III i disse bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer understreker rollen dette enzymet og produktet sitt i viktige trinn på tumorprogresjon som vedheft, migrasjon og metastasedannelse
Citation. Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, de Llorens R, de bOLOS C, Vidal-Vanaclocha F et al. (2010) α2,3-sialyltransferase ST3Gal III modulerer Bukspyttkjertelkreft cellemotilitet og heft
In Vitro Hotell og forbedrer sin metastatisk potensial
In Vivo
. PLoS ONE 5 (9): e12524. doi: 10,1371 /journal.pone.0012524
Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 7 mai 2010; Godkjent: 31 juli 2010; Publisert: 01.09.2010
Copyright: © 2010 Pérez-Garay et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av La Marato de TV3 foundation (tilskudd 050 932, tildelt RP), spansk Ministerio de Ciencia e Innovacion (gi BIO 2007-61323, tildeles RP), regjeringen i Catalonia (stipend 2005SGR00065, tildelt RL), den Comision interdepartemental de Ciencia y Tecnología (CICYT) av den spanske regjeringen i Madrid (nr. SAF2006-09341, tildelt FVV) og Baskerland regjeringen (nr. IT-487-07 tildelt FVV). M.P.-G. takk Fundació La Marató for en pre-doc og University of Girona for en kortsiktig mobilitet fellesskap. Finansiører har ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Celleoverflate- sialysering fremstår som en viktig funksjon i kreftcelle metastaser. Sialinsyrer og deres derivater er allestedsnærværende i terminale posisjoner av glykokonjugater. De sure sukkere gi netto negativ ladning, og er i stand til å modulere en rekke hendelser i celle-celle, celle-matriks og celle-molekyl interaksjoner [1]. Overføringen av sialinsyrene fra cystidine-5-monophospho-N-acetylneuraminsyre (CMP-NeuAc) til de terminale posisjonene til karbohydratgrupper glykoprotein og glykolipider katalyseres av sialyltransferaser [2].
Menneske sialyltransferaser er en familie på 20 forskjellige intracellulære, Golgi membranbundne glycosyltransferases; gruppert i tre underfamilier [3]. Alfa-2,6-sialyltransferaser formidle overføringen av sialinsyre med en a-2,6-binding til terminal Gal (ST6Gal I-II) [4], [5] eller GalNAc rester (ST6Gal NAc I-VI). Alfa-2,8-sialyltransferaser formidle overføringen av sialinsyre med en a 2,8-binding (ST8 Sia I-IV). Alfa-2,3-sialyltransferaser formidle overføringen av sialinsyre med en a 2,3-binding til terminal Gal-rester. ST3Gal I-II og IV katalyserer overføring til Gal resten ligger på terminal Galβ1-3GalNAc strukturer; ST3Gal IV og VI overføring sialsyre (med alfa 2,3-kobling) til Gal resten ligger på terminal Galβ1-4GlcNAc strukturer; ST3Gal V virker på Gal rester ligger på terminal Galβ1-4Glc-Cer strukturer og til slutt, katalyserer ST3Gal III overføring av sialsyre med en alfa 2,3-kobling til terminal Gal rester ligger på hver Galβ1-3GlcNAc eller Galβ1-4GlcNAc strukturer [6].
endringer i spesifikk sialyltransferase ekspresjon har blitt rapportert å bli forandret i flere tumorer og kan forklare dannelsen av sialyserte tumorantigener, slik som sialyl-Lewis x, sialyl- Lewis en, sialyl-T og sialyl- Tn. I ekstrahepatiske gallegang kreft ST3Gal III nivåer korrelert med tumor utvikling, differensiering og metastase [7]. Brystkreft, den mest uttrykte sialyltransferase ble ST3Gal III som positivt korrelert til tumorstørrelse og antall axilary noder; og dessuten høy ST3Gal III /ST6Gal-forhold ble korrelert med en kortere total overlevelse og dårlig prognose [8], [9]. I tillegg har ST6GalNAc V nylig blitt rapportert å mediere hjernemetastaser av brystkreftceller [10]. I blærekreft ST3Gal jeg spiller stor rolle ved sialylering av T-antigen og dets overekspresjon synes å være en del av den første onkogen transformasjon [11]. I cervix plateepitelkarsinom, ble ST6Gal I og ST3Gal III uttrykk nivåer betydelig økt hos pasienter med lymfeknutemetastaser sammenlignet med de uten metastaser [12], [13] og ST3Gal III, ST3Gal IV og ST6Gal jeg ble økt i cervikal intraepitelial neoplasi . I human renal karsinom en nedregulering av ST3Gal IV mRNA kan være en av de faktorer som er forbundet med ondartet progresjon [14]. I tykktarmskreft økt ST6Gal jeg og ST3Gal III sitt uttrykk i carcinoma prøvene [15]. ST3Gal III ble tydelig øket i kreftvev, sammenlignet med ikke-maligne tykktarmsslimhinne [16] og en høyde på ST6Gal I-aktivitet ble observert i ondartet og overgangs vev [17]. I magekreft, høye nivåer av ST3Gal III en i svulstvev korrelerte med sekundær tumor tilbakefall [18].
Selv om alfa-2,3-sialyltransferase ST3Gal III uttrykk korrelerer med tumor malignitet i flere karsinomer sin mekanistisk rolle er ikke fullstendig evaluert. ST3Gal III er involvert i biosyntesen av sialyl-Lewis-antigener, som er overuttrykt i pankreas adenokarsinom (PDAC) [19], [20], [21], [22], [23], [24], og korrelerer med sin dårlig prognose [25], [26], [27], [28]. I dette arbeidet har målet vært å undersøke den spesifikke påvirkning av alfa-2,3-sialyltransferase ST3Gal III i noen av de viktigste trinnene i PDAC progresjon som vedheft, migrasjon og metastasering. For dette har vi valgt to bukspyttkjertelen adenokarsinom kreftcellelinjer CAPAN-1 og MDAPanc-28, med forskjellig ST3Gal III og sialyl-Lewis antigen uttrykk nivåer, og genererte ST3Gal III overekspresjon kloner. ST3Gal III økt uttrykk var relatert til en økning sialyl-Lewis
x overflatenivå og gjennomførte til en forbedret E-selektinuttrykk bindingskapasitet og cellemigrasjon. Videre intrasplenic injeksjon i atymiske nakne mus av ST3Gal III overepressing celler viste en nedgang i overlevelse mus og høyere metastasedannelse. I sammendraget, økt uttrykk av ST3Gal III i disse bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer belyser hvilken rolle dette enzymet og produktet sitt i viktige trinn på tumorprogresjon som vedheft, migrasjon og metastasering.
Resultater
stabil overekspresjon av ST3Gal III i CAPAN-en og MDAPanc-28 celler
for å utforske mekanistisk rolle ST3Gal III i bukspyttkjertelen adenokarsinom progresjon, rotte ST3Gal III-genet, som viser nesten identisk akseptor spesifisitet og enzymatisk aktivitet som menneske ST3Gal III-genet [29], ble anvendt. Således ble CAPAN-1 og MDAPanc-28-celler transfektert med pcDNA 3.1 vektoren som koder for rotte ST3Gal III-genet. Parentale celler ble samtidig transfektert med den tomme vektoren pcDNA3.1. Mange stabile cellekloner ble selektert i nærvær av geneticine og ST3Gal III mRNA overekspresjon ble analysert ved semi-kvantitativ PCR (data ikke vist). ST3Gal III mRNA overekspresjon kloner, C31 og C32 (for CAPAN-en modell) og M33 og M34 (for MDAPanc-28-modellen) ble valgt for videre studier. Som kontroller foreldrecellelinjer (CAPAN-1 og MDAPanc-28) og mock transfekterte kloner (CP for CAPAN-en og MP for MDA-Panc 28) ble brukt. ST3Gal III mRNA-ekspresjon ble kvantifisert ved kvantitativ PCR (qPCR) (figur 1). CAPAN-1 foreldre celler hadde tre ganger høyere (
P 0,001
) ST3Gal III uttrykk enn MDAPanc-28 foreldre celler. Når det gjelder CAPAN-en modell, ST3Gal III mRNA uttrykk var 140 ganger høyere (
P 0,001
) i C31 klone og 100 ganger høyere (P 0,001) i C32-klone enn i CAPAN-en og CP kontrollceller. For MDAPanc-28 modell, ST3Gal III mRNA uttrykk var 7 ganger høyere (
P 0,001
) i M34 klone og 3,6 ganger høyere (P 0,001) i M33 klone enn i både kontrollceller, MDAPanc -28 og MP. Evaluering av generell sialyltransferase-aktivitet ble utført ved Glykosylering immunosorbent assay (GISA) som tidligere beskrevet [24]. Som forventet, ble en generell sialyltransferase aktivitetsøkning påvises i de transfekterte celler når sammenlignet med deres tilsvarende kontroller, som er omtrent 3,2 ganger høyere i CAPAN-1 ST3Gal III overekspresjon kloner
versus
CP og CAPAN-1 og 1,3 gangers høyere i MDAPanc-28 ST3Gal III overekspresjon kloner
versus
MP og MDAPanc-28
MDAPanc-28 foreldre celler, MP:. MDAPanc-28 mock celler, M34 og M33: MDAPanc-28 celler transfektert med den ST3Gal III-genet. CAPAN-1: parentale celler, CP: CAPAN-1 mock-celler, C31 og C32: CAPAN-1-celler transfektert med ST3Gal III-genet. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD av 3 separate eksperimenter, hvert på seks replikater (n = 18). * Signifikant forskjellig (
P 0,001
).
ST3Gal III økt de novo uttrykk for SLEX ved enzymatisk konkurranse
Cell overflaten sukker uttrykk mønster for begge modellene var studert ved strømningscytometri ved å bruke spesifikke monoklonale antistoffer mot Lewis-antigener og spesifikke lektiner (resultater vist i figur 2). Analysen av type II Lewis antigener i CAPAN-en modell (figur 2A) viste at CAPAN-en og CP cellene hadde høy middels nivåer av Le
x, SLE
x og H2-antigener og høye nivåer av Le
y antigen. Når sammenlignet med kontroller, som vises C31 og C32 kloner en stor økning i SLE
x ekspresjon på bekostning av fullstendig miste ekspresjonen av ikke-sialylerte antigener (Le
x, H2 og Le
y). Videre følger økningen i SLE
x, ble det observert en nedgang i α2,6-sialsyre, oppdaget av
Svarthyll agglutinin plakater (SNA).
Maackia amurensis agglutinin plakater (MAA) viste ingen forskjeller mellom kloner, sannsynligvis på grunn av det faktum som er i stand til å binde seg til SLE
x struktur (data ikke vist). Type I Lewis antigener SLE
a, Le
a, Le
b og H1 ikke ble påvist i CAPAN-1-modellen (data ikke vist). Dermed disse resultatene dokumentert en multippel enzymatisk konkurranse for Type II kjeder. Analysen av MDAPanc-28 (figur 2B) modell viste at MDAPanc-28 og MP kontrollceller hadde svært lav SLE
x uttrykk og høy α2,6-sialsyre uttrykk og også manglet Type I Lewis antigener. Når M33 og M34 kloner ble sammenlignet med kontroller, en økning i SLE
x med en samtidig reduksjon i α2,6-sialinsyre ble også påvist. Som ovenfor, MAA viste ikke forskjeller mellom kloner sannsynlig fordi den ikke gjenkjenner SLE
x (data ikke vist). Siden ST3Gal III transfektert kloner C31 og C32 oppførte seg på samme måte i CAPAN-en modell samt M33 og M34 ST3Gal III transfektert kloner i MDAPanc-28 modellen, følgende
in vitro Hotell og
in vivo
studiene ble utført kun med de høyeste ST3Gal III og SLE
x uttrykker kloner: C31 for CAPAN-en modell og M34 for MDAPanc-28 modellen
Figur 2A.. CAPAN-en (kontinuerlig dot disposisjon: ………), CP (fordelt dot disposisjon…..), C31 (fet skissere: _______), C32 (vanlig disposisjon: ______). Figur 2B. MDAPanc-28 (sammenhengende dot disposisjon: ………), MP (fordelt dot disposisjon…..), M34 (fet skissere: _______), M33 (vanlig disposisjon: ______). Eksperimenter ble utført for triplo. Representative Cytometry histogrammer vises. Anti-Le
x MAb bindes til Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; anti-SLE
x MAb bindes til NeuAcα2-3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; anti-H2 MAb bindes til [Fucα1,2] Galβ1,4GlcNAc-; anti-Le
y MAb bindes til [Fucα1,2] Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; SNA lektin (
Svarthyll
agglutinin) binder seg til NeuAcα2-6Galβ- strukturer.
ST3Gal III forbedret bukspyttkjertelen adenokarcinomceller vedheft til rh-E-selektin
E -selectin er en celle adhesjon molekyl uttrykt på aktiverte endotelceller som gjenkjenner og binder seg til spesifikke karbohydrat determinanter, som SLE
x og SLE
a tilstede på overflaten glycoconjugates [30]. Bindingsforsøk til rh-E-selektin ble utført for å analysere hvorvidt det annet mønster av Lewis-antigen ekspresjon var i stand til å indusere endringer i adhesjon (resultater vist i figur 3). Begge modellene viste forskjellige vedheft mønstre til rh-E-selektin. MDAPanc-28 parentale celler som vises lavere adhesjon til rh-E-selektin enn CAPAN-1 parentale celler, som var i overensstemmelse med den nedre ekspresjonsnivået av ST3Gal III og SLE
x av MDAPanc-28 sammenlignet med CAPAN-1-celler. I CAPAN-en modell (figur 3A) den ST3Gal III overekspresjon klone, C31, tredoblet vedheft (
P 0,001
) til RH-E-selektin sammenlignet med tilsvarende kontroller CAPAN-1 og CP. For å bekrefte at SLE
x ekspresjon indusert ved ST3Gal III forårsaket den opp-regulert E-selektin-binding, ble cellene tidligere inkubert med anti-SLE
x monoklonalt antistoff (MAb) og bindingen til E-selektin ble hemmet . I MDAPanc-28-modellen (figur 3B), den ST3Gal III overekspresjon klone, M34, firedoblet (
P 0,001
) vedheft til rh-E-selektin sammenlignet med tilsvarende kontroller MDAPanc-28 og MP . Når cellene ble tidligere inkubert med anti SLE
x MAb bindingen til E-selektin ble fullstendig avskaffet. Resultatene viste at i disse modellene, ST3Gal III nivåer modulert
in vitro
binding til rh-E-selektin via SLE
x uttrykk.
CAPAN-1 variant celler (Figur 3A) og MDAPanc-28 variant celler (figur 3B) som på forhånd inkubert med PBS-1% BSA (lyse søyler) eller anti-SLE
x MAb (mørke søyler), ble tilsatt til 96-brønns mikroplater belagt med rh E -selectin eller PBS-1% BSA (negativ kontroll). Adherente celler ble beregnet med et MTT-basert kolorimetrisk analyse. Resultatene er uttrykt som den spesifikke binding til E-selektin (OD 570 nm av celler som er begrenset til E-selektin – OD 570 nm av celler bundet til PBS-1% BSA)
versus
celler tidligere inkubert med eller uten anti -SLe
x MAb. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD av 3 separate eksperimenter, hvert på fem replikater (n = 15). * Signifikant forskjellig (
P 0,001
).
Effekten av ulike cytokiner på vedheft av kreft i bukspyttkjertelen celler til leversinus endothelial (HMS) celler
fordi ST3Gal III og SLE
x ekspresjonsnivåer var direkte proporsjonal til
in vitro
rh-E-selektin adhesjon, binding av kreft i bukspyttkjertelen celler til primære dyrkede HSE-celler ble evaluert. Den CAPAN-1-modellen ble valgt for dette forsøket på grunn av sin høyere vedheft til rh-E-selektin. Først, bestemmes at det er spesifikk adhesjon av CAPAN-1 parentale celler til HSEC stimulert med TNFa-α, IL1-β eller lipopolysakkarid (LPS) i 16 timer før analysen (resultater vist i figur 4A). Behandling med TNF-α og IL1-β sterkt øket antallet adherente celler, og IL1-β viste seg å være de beste stimuli for vår modell. Når inkubasjon med anti-E-selektin MAb, ble økningen i heft helt avskaffet. Disse dataene viste at HMS cellecytokin forbehandling, spesielt IL-1β, fremmet sin E-selektin uttrykk, noe som forårsaket en økning på CAPAN-en heft
HSE-celler ble inkubert med. Sel = Antimurin CD62 E (E-selektin) MAb eller IgG = Isotype-matchet kontroll antistoff. Sperre CAPAN-1-celler ble merket med calcein og tilsatt til HSE kontrollceller, TNF-α stimulerte HSE-celler, LPS stimulerte HSE-celler eller IL-1β stimulerte HSE-celler. Resultatene er uttrykt som% Spesifikk adhesjon til HSE-celler [78]. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD av 3 separate eksperimenter, hvert på tre replikater (n = 9). * Signifikant forskjellig (
P 0,001
) når man sammenligner anti-E-selektin inkuberes HSEC å kontrollere celler. # Signifikant forskjellige (
P 0,001
) når man sammenligner behandlinger. Tumor celleadhesjon assay for å Primære Dyrkede HSE-celler (Figur 4B). CAPAN-1-variant-celler ble merket med Calcein og tilsatt til IL-1β stimulerte HSE-celler, eller (-) ikke stimulerte HSE kontrollceller. Sel = Anti-murine CD62 E (E-selektin) MAb ble tilsatt til IL-1 p HSE-celler eller – HSE-celler før tumorcelle tilsetning. * Signifikant forskjellig (
P 0,001
) når man sammenligner CAPAN-1, CP, og C31 celler. # Signifikant forskjellige (
P 0,001
). Når man sammenligner hver klon (CAPAN-1, CP og C31) heft for de ulike HMS-cellen behandlinger
ST3Gal III økt svulst celle adhesjon til HSE-celler
neste bestemmes adhesjonen av forskjellige ST3Gal III og SLE
x nivåer som uttrykker CAPAN-1 celler til IL-1 p pre-behandlede eller kontrollmus HSE-celler (resultater vist i figur 4B). CAPAN-en og CP kontrollceller viste en basal vedheft til HMS-celler, som i betydelig grad økt i IL-1B forbehandlede HSE-celler og returnert til basalnivået i anti-E-selektin MAb forhånds inkuberes HSE-celler. C31 viste en basal adhesjon til HSE-celler (høyere enn CAPAN-1 og CP kontrollceller), som i betydelig grad økte i IL-1 p forbehandlede HSE-celler, og også returnerte til basalnivåer i anti-E-selectin MAb preinkubert HSE-celler. Disse dataene viste at E-selektin spilt en viktig rolle formidling vedheft til HSE-celler, selv om en ikke-E-selektin avhengig basal adhesjon (høyere for C31 enn for kontrollceller) eksisterte. Videre høy ST3Gal III og SLE
x uttrykker C31 cellene hadde en høyere vedheft til HMS-celler enn medium ST3Gal III og SLE
x uttrykker kontrollceller.
ST3Gal III uttrykk økt celle migrasjon
for å undersøke om ST3Gal III overekspresjon kloner kan føre til anskaffelse av en mer vandrende celle fenotype, evaluert vi cellemigrasjon på kollagen type-i ved hjelp av en transwell migrasjonsanalyse (resultatene vist i figur 5). Begge cellemodeller viste forskjellige trekkmuligheter, med CAPAN-en modell som ni ganger mer vandrende enn MDAPanc-28 modell. Når det gjelder CAPAN-en modell (figur 5A), ST3 Gal III og SLE
x overekspresjon klone C31 utstilt dobbel (
P 0,001
) migrasjon evner enn kontrollcellene CAPAN-1 og CP. For MDAPanc-28-modellen (figur 5B), er ST3Gal III og SLE
x overekspresjon klon M34 økt migrasjon av fire i forhold til kontrollcellene MDAPanc-28 og MP. Resultatene viste en positiv sammenheng mellom ST3Gal III og SLE
x nivåer og trekkmuligheter.
CAPAN-1 variant celler (CAPAN-1, CP og C31)
(
Figur 5A
) Hotell og MDAPanc-28 variant celler (MDAPanc-28, MP og M34)
(
Figur 5B
)
ble sådd på 8 mikrometer porer-Type i kollagen-belagte innleggsdeler, som er lagt inn på toppen av brønner inneholdende DMEM-1% FBS og inkubert ved 37 ° C (6 timer for CAPAN-1-modellen og 18 timer for MDAPanc-28-modell). Non-migrerte celler ble eliminert og migrerte cellene fiksert, farget og telles. Resultatene uttrykkes som migrerte celler per brønn. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD av verdiene oppnådd i 3 separate eksperimenter (n = 9). * Signifikant forskjellig (
P 0,001
).
ST3Gal III overekspresjon øker tumorgenesen og reduserer overlevelse i atymiske hårløse mus
Siden
in vitro
resultatene som er beskrevet ovenfor foreslått en viktig rolle for den ST3Gal III-genet i tumorprogresjon,
in vivo
analyser ble utført for å studere hvorvidt ST3Gal III kan være viktig i tumormetastase. Først ble dannelsen av metastasering og overlevelse av atymiske nakne mus etter intrasplenic injeksjon med ulike mengder av de CAPAN-1 og MDAPanc-28 foreldre celler analysert. I våre hender, da 1,5 x 10
6, 3 x 10
6 og 5 x 10
6 CAPAN-1-celler ble injisert, det nakne mus døde av emboli dannelse, sannsynligvis på grunn av CAPAN-1 størrelse og aggregering kapasitet. Injeksjon av 1 × 10
6 CAPAN-1 celler ikke danner emboli og genererte milt svulster, selv uten metastatisk fokuserer. Siden MDAPanc-28-celler er 4-5 ganger mindre enn CAPAN-1-celler, 7 x 10
6 MDAPanc-28-celler ble injisert intrasplenically inn i nakne mus, som er generert liten makroskopisk metastatiske fokus i 2/3 av musene, 20 -22 uker senere. Derfor ble MP og M34-celler valgt å studere innflytelsen av ST3Gal III overekspresjon i metastasedannelse og nakne mus overlevelse. Eksponensielt voksende 7 x 10
6 levedyktige MP og M34-celler, som deler de samme morfologiske egenskaper, ble injisert i milten hos atymiske nakne mus (n = 8 /gruppe) og overlevelsesanalyse ble utført ved anvendelse av Kaplan-Meier-metoden ( Figur 6). Mus injisert med ST3Gal III overekspresjon celler (M34) viste en stor reduksjon i overlevelse (
P = 0,019
) sammenlignet med mus injisert med kontroll MP celler. Mesteparten av M34 injiserte mus (5/8) døde etter 103-110 dager etter injeksjon, mens MP injiserte mus overlevde frem til slutten av studien (190 dager). Alt M34 injiserte mus ble obdusert, og analysen viste milt tumorer i 62,5% av dem (5/8) og flere makroskopiske metastatisk fokus til tarmen, pessar, nyre, ganglier eller suprarenale kjertler i 75% av musene (6/8) . All MP injisert mus ble obdusert (dager 103, 138, 161 og 190 etter injeksjonen) og ingen av dem (8/8) viste tegn på enten milt svulster eller makroskopisk metastaser. Således overekspresjon av ST3Gal III i MDAPanc-28-celler, noe som fører til en høyere ekspresjon av SLE
x og en høyere adhesjon og migrasjon, kan være direkte korrelert med en nedgang i overlevelse når de injiseres i nakne mus. Dessuten er det utrustet celler med et større tumordannelse evne og metastatisk potensiale når intrasplenically injiseres.
Cells (7 x 10
6) ble intrasplenically injiseres i nakne mus på dag 1 av forsøket. Musene ble daglig undersøkt og ofret når de så syke. Forskjellene mellom gruppene ble vurdert av lang-rank test (
P
= 0,019, n = 7-8 /gruppe).
Diskusjoner
Vår tidligere studier viste at alfa-2,3-sialyltransferase aktivitet korrelert til sialyl-Lewis antigen uttrykk på bukspyttkjertelkreft celleoverflater [24]. Vi deri utvidet våre undersøkelser for å spesifikt studere mekanistisk rolle ST3Gal III i oppkjøpet av lim, trekkende og metastatiske evner i bukspyttkjertelen adenokarsinom kreftcellelinjer. Vi har funnet ut at: 1) ST3Gal III mRNA uttrykk nivåer korrelert med SLE
x overflate uttrykk; 2) ST3Gal III indusert sialysering økt kreft i bukspyttkjertelen vedheft til rh-E-selektinuttrykk og IL1-p pre-stimulert HSE-celler, via SLE
x-E-selektin interaksjon; 3) en positiv sammenheng mellom migrasjon og ST3Gal III og SLE
x uttrykk; og 4) den intrasplenic injeksjon av ST3Gal III-overuttrykkende cellelinjer i atymiske nakne mus induserte en økning i tumorgenesen og en nedgang i overlevelse.
ST3Gal III overekspresjon kloner (C31, C32, M33 og M34) viste en økning i Sle
x uttrykk i forhold til de tilsvarende kontroller (utransfekterte celler, CAPAN-1 og MDAPanc-28, og celler transfektert med tom vektor, CP og MP). Selv Type I underlaget anses ST3Gal III foretrukne akseptor, er Type II underlaget også en god akseptor. Den enzymatiske undersøkelser utført for å karakterisere ST3Gal III-aktivitet viste at type I og type II-akseptor-substrater ført til ganske lik V
max verdier, mens K
m-verdiene var mye høyere for type II. Som en følge av innlemmelse ratene var omtrent to ganger for type I enn for type II-strukturer [31]. Lignende resultater ble oppnådd i senere arbeider på studerer naturlige [32], [33] eller syntetiske akseptorer spesifisiteter [34], [35], [36], [37], [38]. Tatt i betraktning at cellelinjer brukt i denne studien ikke gir uttrykk for type I Lewis antigener og som ST3Gal III kan opptre på både type I og II underlag, overekspresjon av ST3Gal III handlet på type II forløpere som fører til et økt uttrykk av SLE
x. Nylig, og i overensstemmelse med våre resultater, har det blitt beskrevet at overekspresjon av ST3Gal III i gastrointestinale karcinomceller resulterte også i SLE
x determinant økning [39]. Videre disse forfatterne beskrevet at mRNA nivåer av ST3Gal III korrelert med økt SLE
x uttrykk nivåer i konfluente celler, men ikke med mRNA-nivåer av ST3Gal IV og ST3Gal VI, som er enzymer som er rapportert til å handle fortrinnsvis på Type II kjeder. Til sammen utgjør disse dataene forsterke rolle ST3Gal III i biosyntesen av SLE
x i disse karsinomceller. Sammen med SLE
x økning, en reduksjon i α2,6-sialinsyre ble observert i begge modeller. I tillegg, C31 og C32 viste et fullstendig tap av ikke-sialylert Type II Lewis-antigener (Le
x, H2 og Le
y). Disse resultatene er trolig forklares med flere enzymatisk konkurranse for Type II kjeder. På den ene side, det var konkurranse mellom alfa-1,2-fucosyltransferases, alfa-1,3 (4) fucosyltransferases og alfa-2,3-sialyltransferaser [23], [40], [41], og på den andre siden mellom a-2,3-sialyltransferaser og alfa-2,6-sialyltransferaser [6], [31], [42].
De molekylære mekanismene som regulerer bukspyttkjerteltumormetastase er fremdeles dårlig forstått. Ett viktig skritt er festingen av tumorceller til aktiverte endotelceller, noe som innebærer deres adhesjon til endotele selectins som gjenkjenner oligosakkarid determinanter uttrykt på kreftceller overflate. Sle
x har blitt rapportert til å delta i de første trinnene i bloduttredelse gjennom interaksjon med E-selektinuttrykk ved å tilrettelegge den rullende og festing av kreftceller til endotelceller [27], [28], [43], [44 ], [45]. En direkte korrelasjon mellom ST3Gal III-nivåene, SLE
x nivåer og tykktarmskreft celleadhesjon til IL-1β aktiverte humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) er beskrevet [46]. Sle
x uttrykker tykktarm kreft celler er også rapportert å følge leversinus endotelceller via E-selektin-SLE
x interaksjon [47]. Videre er det flere verk rapportert en sammenheng mellom SLE
x, og vedheft til cytokin stimulert HUVEC i H7721 hepatokarsinom [48], [49], [50], [51] og i lunge adenokarcinomceller [52]. Etter avtale med disse dataene, våre resultater viste en direkte sammenheng mellom bukspyttkjertelen adenokarsinom vedheft til
in vitro
rh-E-selektin og ST3Gal III nivåer i bukspyttkjertelen kreftceller, via SLE
x. Dessuten, når studere vedheft av bukspyttkjertelen adenokarcinomceller til leversinus endotelceller, ST3Gal III og SLE
x overekspresjon C31 celler viste en forbedret evne til å forholde seg til IL-1β stimulert HSE-celler sammenlignet med kontroller. HSE celle forbehandling med IL1-β og TNF-α cytokiner økte betydelig CAPAN-1 celle adhesjon til HSE-celler, og returnerte til basalnivåer i anti-E-selektin pre-inkubert HSE-celler. Disse resultatene er i samsvar med tidligere arbeid rapporterer at E-selektinuttrykk er lav eller fraværende i HSE-celler under normale forhold, men kan være oppregulert av cytokiner [53], av hepatocytter [54] eller som en respons på metastatiske tumorceller [ ,,,0],55]. Vedheft av ST3Gal III og SLE
x overekspresjon C31 celler til ikke-stimulerte HSE-celler var betydelig større sammenlignet med kontrollceller CAPAN-1 og CP. Denne adhesjon ble ikke tilbakestilt når pre-inkubering HSE-celler med anti-E-selectin, noe som kan forklares ved en ikke-E-selektin avhengig, men SLE
x-mediert, kreft i bukspyttkjertelen celle adhesjon til ikke-stimulerte HSE-celler . Denne interaksjon kan være mediert av andre SLE
x binding celleadhesjonsmolekyler slik som P-selektin [55], [56], eller I-typen Lektiner. Faktisk er en tidligere studie rapportert binding av ST3Gal III overekspresjon tykktarmskreftceller til ikke-aktivert HUVEC, noe som tyder på denne ikke-E-selektin avhengig SLE
x-formidlet adhesjon kan være på grunn av I-type lektiner [46].
Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om en positiv sammenheng mellom cellemigrasjon og ST3Gal III og SLE
x uttrykk nivåer i bukspyttkjertelen adenokarcinomceller. Til tross for fraværet av studier på kreft i bukspyttkjertelen celler, noen undersøkelser støtter våre funn. Når tumorcelleoverflaten α2,3-sialinsyre ekspresjon på MDA-MB-231 brystkreftcellelinje ble trukket ned (ved inhibering av cellulær α2,3-sialyltransferase-aktivitet med soyasaponin I), cellemigrering betydelig redusert [57]. ST3Gal III overekspresjon på glioma cellelinje U-374 økt α2,3 bundet Sialinsyren uttrykk på celleoverflaten, og resulterte i en mer
in vitro
invasiv fenotype [58]. I tillegg H7721 hepatokarsinom celler viste en direkte sammenheng mellom mengden av overflate SLE
x ekspresjon og migrering [50], [51], [59]. Videre SLE
x var avgjørende for H7721 migrasjon, siden migrasjon ble hemmet av anti-SLE
x MAb og etter sialsyre rest eliminering [60]. Cell migrasjon er en flertrinnsprosess som spiller en sentral rolle i metastasering. Den første responsen av trekkende celler til en migrering fremmende middel er å polarisere og utvide fremspring. Disse fremspring er stabilisert med ekstracellulære matriks-adhesjonsmolekyler, slik som integriner, og tjener som trekksider for migrasjon som cellen beveger seg fremover over dem [61]. Det er en raskt voksende mengde bevis som viser at sialysering påvirkninger migrasjon evner ved å modulere inte funksjon [58], [62], [63], [64]. Dermed hypoteser vi at ST3Gal III kan påvirke cellemigrasjon ved å endre inte sialysering. En økning i α2,3-sialinsyre på C31 og M34-celleoverflaten kan også endre de sialylering nivåer av deres griner, modulering av deres ekstracellulære matrise-adhesjon.
