Abstract
thymidin kinaser (TKS) har vært regnet som en av de potensielle mål for kreft terapeutisk på grunn av deres høye uttrykk i kreftceller. Imidlertid har nukleobase analoger rettet mot TKs vist dårlig selektiv cytotoksisitet i kreftceller til tross for effektiv antiviral aktivitet. 3′-deoksytymidin phenylquinoxaline konjugat (dT-QX) ble utformet som en roman nukleobase analog til målet TKs i kreftceller og blokkere cellereplikasjon via konjugert DNA interkalerende kinoksalin enhet. In vitro celle screening viste at dT-QX selektivt dreper en rekke forskjellige kreftceller, inkludert leverkreft, bryst adenocarcinoma og hjerne glioma celler; mens det hadde en lav cytotoksisitet i normale celler, for eksempel normale humane leverceller. Anticancer aktivitet av dT-QX ble tilskrevet dens selektiv hemming av DNA-syntese som resulterer i omfattende mitokondriell superoksyd spenning i kreftceller. Vi viser at kovalent binding med 3′-deoksytymidin entydig rettet cytotoksiske phenylquinoxaline delen mer mot kreftceller enn normale celler. Foreløpige musestudie med subkutan levertumor modell viste at dT-QX effektivt hemmet veksten av svulster. DT-QX er det første molekylet i sitt slag med høyt amendable bestanddeler som viser dette selektiv cytotoksisitet i kreftceller
Citation. Wei Q, Zhang D, Yao A, Mai L, Zhang Z, Zhou Q (2012 ) design, syntese og in vitro og in vivo biologiske studier av en 3′-deoksytymidin konjugat som potensielt dreper kreftceller meget selektivt. PLoS ONE 7 (12): e52199. doi: 10,1371 /journal.pone.0052199
Redaktør: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Storbritannia
mottatt: 02.08.2012; Godkjent: 12 november 2012; Publisert: 26.12.2012
Copyright: © 2012 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Basic Research Program of China (2011CB933100), de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (Hust: 2010ZD023), og den viktige National Science Teknologi Spesifikke prosjekter (2009ZX09301-014). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med kreft er den ledende dødsårsaken på verdensbasis, utvikle trygge og effektive legemidler mot kreft er fortsatt et stort behov. Molekylært målrettet terapi har vært den siste fokus for anticancer medikament utvikling, som vist i eksempelet i Sorafenib [1], [2]. Sorafenib er en multi-tyrosinkinase-inhibitor som potensielt kan minimalisere negative effekter som for eksempel levertoksisitet forårsaket av andre anticancer legemidler inkludert 5-fluoruracil og doksorubicin [3], [4]. I likhet med tyrosinkinaser, har tymidin-kinaser (TKS) vært betraktet som et potensielt anticancer-target [5] – [8]. TKs er de første fosforylerende enzymer i tymidin bergingsveien omdanner tymidin til sin 5′-fosfat skjema for DNA-syntese. I normale pattedyrceller, cytosoliske TKs er bare til stede på et lavt nivå i S-fasen av celler; mens forhøyet nivå av TKs har blitt observert i virusinfiserte celler og raskt prolifererende kreftceller [5] -. [8], f.eks, lungesvulster og brystkreft vev [9], [10]
nukleobase analoger målretting TKs slik som AZT, og acyclovir har vist seg effektiv antiviral aktivitet [11], [12]. Imidlertid har dårlige kreft-selektivitet og sterke bivirkninger vært forbundet med nukleobase analoger inkludert nøytronfangingseffektivitet agenten 5-tymidin boron konjugat og radioisotopisk joderte deoxyuridine [13], [14]. Nylig har en kombinasjonsbehandling med predelivered tymidinkinase fulgt av nukleobase analoger blitt undersøkt i leveren kreftpasienter med begrensede effekter oppnådd [15]. Dette skyldes sannsynligvis at TKS orientert nukleobase-analoger som for eksempel AZT blir raskt fjernet ved nukleobase reparasjonsprosesser etter at de er innlemmet i DNA-syntese av cancerceller via tymidin bergingsveien [16] – [18]. 5-fluorouracil, en annen tymin analog, er en dihyrofolate reduktaseinhibitor og direkte fører til cytotoksisitet i normale hepatocytter [3], [19]. Derfor er alternativ utforming av mer effektive nukleobase analoger rettet mot TKs nødvendig.
Vi rapporterer her en roman 3′-deoksytymidin phenylquinoxaline konjugat (dT-QX, figur 1) som selektivt dreper en rekke kreftceller, men ikke normale hepatocytter. Strukturelt er dT-QX en 3′-triazol-3′-deoksytymidin bundet til en DNA-interkalerende kinoksalin del. DT-QX er designet for å målrette tymidin berging vei basert på det faktum at 3′-triazol thymidinderivatene er anerkjent av menneskerettighets tymin kinaser [20], [21]. Formålet med tilsetning av kinoksalin-delen inn i dT-QX struktur var å blokkere cellulær fjerning av tymidin-analoger [16] – [18] via DNA innskyting i DNA-syntese av cancerceller, fordi kinoksalin-del er en kjent DNA intercalator [22]. I tillegg kan kinoksalin struktur hensiktsmessig syntetiseres ved ett trinn kondensasjon av en diketonforbindelse 1 [23] og en orto-fenylendiamin (figur 1). Enda viktigere er det kinoksalin struktur sterkt foranderlig for kjemiske modifikasjoner med et utvalg av substituenter for avanserte struktur aktivitet undersøkelse for å optimalisere den potensielle biologiske aktivitet. Anticancer aktivitet av dT-QX ble så evaluert ved bruk av et panel av kreftceller. Virkningene av dT-QX for inhibering av DNA-syntese og indusering av cellulær oksidativt stress ble også undersøkt. Til slutt ble hemming av tumorvekst ved dT-QX vurdert i mus med subkutane svulster i leveren.
Materialer og metoder
Synthesis
Alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (WI, USA), J 0.5CH
2), 2.24 til 2.19 (m, 3H, CH, CH
2), 1,87 (qui,
3J plakater (H, H) = 7,2 Hz, 1H, 0.5CH
2), 1,79 (qui,
3J product: (H, H) = 7,0 Hz, 1 H, 0.5CH
2), 1,67 (qui,
3J plakater (H, H) = 7,52 Hz, 2H; CH
2), 1,50 til 1,41 ppm (m, 2H; CH
2);
13C NMR (CDCh
3, 100,6 MHz, 01:01 syn /anti):
δ
= 172,3, 172,2, 79,5, 71,6, 44,8, 36,1, 36,1, 33,5, 32,4, 32,2 , 29,1, 27,7, 26,4, 24,7, 24,5 ppm (figur S1); HRMS beregnet for C
9 H
15BrNO [M + H]
232,0337 og [M + 2 + H]
234,0316, funnet 232,0324 og 234.0413.
N
-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-9,10-dioxo-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octahydrophenanthren-2-yloxy)hexanamide (3).
Til en oppløsning av 2 (390 mg, 1,68 mmol) i tørr DMF (50 ml) ble det tilsatt en (355 mg, 1,30 mmol) og kaliumkarbonat (1,8 g, 13,0 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt under N
2 i 16 timer ved romtemperatur og deretter surgjort til pH 5 med 5 N HCl. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert med CH
2 Cl
2 (150 mL x 3). De organiske lag ble oppsamlet, vasket med saltvann (250 ml), tørket med MgSO
4 og konsentrert. Et flash-kromatografisk separasjon (0-40% EtOAc i heksan) ga 3 som en gul olje (320 mg, 0,76 mmol) i 58% utbytte.
1 H NMR (CDCh
3, 400 MHz):
δ
= 7,53 (d,
4J plakater (H, H) = 2,9 Hz, 1H; CH- ), 7,35 (d,
3J plakater (H, H) = 8,8 Hz, 1 H, CH), 7,21 (dd,
3J plakater (H, H) = 8,7 Hz,
4J plakater (H, H) = 2,7 Hz, 1 H, CH), 5,94 (br s, 1H, NH), 4,04 (dd,
3J
(H, H) = 5,3 Hz,
4J product: (H, H) = 2,6 Hz, 2 H, CH
2), 4,00 (t,
3J
(H, H) = 6,4 Hz, 2H; CH
2), 2,65 (s, 1H, CH), 2,53 (d,
3J plakater (H, H) = 14.3 Hz, 1 H, CH), 2,24 (t,
3J plakater (H, H) = 7,6 Hz, 2H; CH
2), 2,21 (d,
4J product: (H, H) = 2,5 Hz, 1 H, CH), 1,82 til 1,70 (m, 4H, 2 CH
2), 1,56 til 1,31 (m, 7H, 3CH
2, CH), 1,18 (s, 3H; CH
3), 0,95 (s, 3H; CH
3), 0,38 ppm (s, 3H; CH
3);
13C NMR (CDCh
3, 100,6 MHz):
δ
= 199,0, 181,3, 172,4, 158,1, 142,6, 134,6, 126,1, 124,2, 112,6, 71,7, 68,9, 68,1, 41,9, 39,2, 39,0, 36,3, 36,3, 35,5, 31,4, 29,7, 29,2, 28,9, 25,7, 25,2, 24,3, 18,8 ppm (figur S2); HRMS beregnet for C
26H
34NO
4 [M + H]
424,2488, funnet 424.2487.
N
-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)-hexanamide (4).
Til en oppløsning av 3 (320 mg, 0,76 mmol) i toluen (25 ml) ble det tilsatt
o
-fenylendiamin (103 mg, 0,95 mmol) og silikagel ( 300 mg). Reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløp under N
2 i 18 timer og deretter konsentrert. Et flash-kromatografisk separasjon (0-40% EtOAc i heksan) ga 5 som et gult, fast stoff (230 mg, 0,46 mmol) i 61% utbytte.
1 H NMR (CDCh
3, 400 MHz):
δ
= 8.9 til 8.7 (m, 3H, 3CH), 7,73 til 7,67 (m, 2 H, 2 CH), 7,30 (d,
3J product: (H, H) = 8,8 Hz, 1 H, CH), 7,02 (dd,
3J product: (H, H) = 8,4 Hz,
4J plakater (H, H) = 2,8 Hz, 1 H, CH), 5,71 (br s, 1H, NH), 4,14 til 4,06 (m, 4H, 2 CH
2), 2,88 (s, 1H, CH), 2,56 (br d,
3J plakater (H, H) = 14 Hz, 1 H, CH), 2.28 til 2.23 (m, 3H; CH
2, CH) , 1,89 til 1,73 (m, 4H, 2 CH
2), 1,59 til 1,47 (m, 7H, 3CH
2, CH), 1,02 (s, 3H; CH
3), 0,99 (s, 3H; CH
3), 0,16 ppm (s, 3H; CH
3);
13C NMR (CDCh
3, 100,6 MHz):
δ
= 172,4, 158,0, 154,8, 148,4, 141,9, 141,3, 137,6, 134,8, 129,2, 129,1, 129,0, 128,6, 125,0, 118,1, 111,2, 79,6, 71,6, 67,7, 59,7, 42,0, 37,3, 36,3, 36,1, 36,0, 34,8, 31,5, 29,2, 29,1, 25,8, 25,3, 22,1, 19,0 ppm (Figur S3); HRMS beregnet for C
32H
38N
3O
2 [M + H]
496,2964, funnet 496.2964.
N
-((1-(2-(Hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-tetrahydrofuran-3-yl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)hexanamide (DT-QX).
Til en løsning av 4 (100 mg, 0,2 mmol) i 5 ml DMF og 10 ml CH
2 Cl
2 ble lagt til 3′-azido-3′ deoksytymidin (54 mg, 0,20 mmol) og en vandig løsning av natrium-askorbat (40 mM, 15 ml). Reaksjonsblandingen ble spylt med N
2 i 10 minutter, og CuSO
4 · 5H
2O (8 mg, 0,03 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt under N
2 ved romtemperatur i 12 timer. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert med CH
2 Cl
2 (150 mL x 3). De organiske lag ble oppsamlet, vasket med saltvann (200 ml), tørket med MgSO
4 og konsentrert. Et flash-kromatografisk separasjon (0-7% MeOH i CH
2 Cl
2) ga dT-QX som et hvitt, fast stoff (114 mg, 0,15 mmol) i 75% utbytte.
1 H NMR (DMSO-
d
6
, 400 MHz):
δ
= 11,35 (s, 1H; OH), 8,34 (t,
3
J plakater (H, H) = 5,5 Hz, 1 H, CH), 8.14 til 8.11 (m, 2H, 2 CH), 8.6 til 8.4 (m, 1H, CH), 7,96 (d,
4
J plakater (H, H) = 2,8 Hz, 1 H, CH), 7,79 (m, 3 H, 2 CH, NH), 7,39 (d,
3
J plakater (H, H) = 8,7 Hz, 1 H, CH), 7,11 (dd,
3
J plakater (H, H) = 8,5 Hz,
4
J plakater (H, H ) = 2,8 Hz, 1 H, CH), 6,40 (t,
3
J plakater (H, H) = 6,6 Hz, 1 H, CH), 5,36 til 5,33 (m, 1H, CH), 5,28 (t,
3
J product: (H, H) = 5,2 Hz, 1H, NH), 4,31 (d,
3
J product: (H, H) = 5,5 Hz, 2H; CH
2), 4,18 (m, 1H, CH), 4,06 (t,
3
J plakater (H, H) = 6,4 Hz, 2H; CH
2), 3,67 til 3,60 (m, 2H; CH
2), 2,85 (s, 1H, CH), 2,67 til 2,57 (m, 2H; CH
2), 2,16 (t,
3
J plakater (H, H) = 7,4 Hz, 2H; CH
2), 1,79 til 1,62 (m, 5H, CH
3, CH
2), 1,56 til 1,43 (m, 10H; 5CH
2), 0,93 (s, 3H; CH
3), 0,91 (s, 3H; CH
3), 0,07 ppm (s, 3H; CH
3 );
13C NMR (DMSO
d
6
, 100,6 MHz):
δ
= 172,0, 163,6, 157,4, 154,2, 150,4, 147,5, 145,2, 141,1, 140,9, 137,1, 136,1, 134,1, 129,5, 129,4, 128,9, 128,4, 125,3, 122,4, 117,7, 110,8, 109,5, 84,4, 83,8, 67,4, 60,6, 59,0, 58,5, 41,2, 37,0, 36,8, 35,5, 35,1, 34,9, 34,4, 34,0, 31,3, 28,5, 25,2, 24,9, 21,6, 18,5, 12,2 ppm; HRMS beregnet for C
42H
51N
😯
6 [M + H]
763,3932, funnet 763.3959 (Tall S4 og S5).
4b, 8, 8-trimetyl-9,10-diokso-4b, 5,6,7,8,8a, 9,10-octahydrophenanthren-2-yl 4-metyl-piperazin-1-karboksylat (5).
til en løsning av 1 (650 mg, 2,39 mmol) i DMF (30 ml) ble det tilsatt 4-metyl-1-piperazinecarbonyl-hydroklorid (630 mg, 3,16 mmol) og kaliumkarbonat (3,4 g, 24 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt under N
2 i 18 timer og deretter surgjort til pH 5 med 5 N HCl. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert med CH
2 Cl
2 (150 mL x 3). De organiske lag ble oppsamlet, vasket med saltvann (250 ml), tørket med MgSO
4 og konsentrert. Et flash-kromatografisk separasjon (0-25% EtOAc i heksan) ga 5 som en gul olje (730 mg, 1,83 mmol) i 77% utbytte.
1 H NMR (CDCh
3, 400 MHz):
δ =
7,86 (s, 1H, CH), 7,49 (s, 2H, 2 CH), 3,71 (br s, 2H, CH
2), 3,61 (br s, 2H; CH
2), 2,69 (s, 1H, CH), 2,58 (d,
3
J plakater (H, H) = 13,3 Hz, 1 H, CH), 2,49 (br s, 4H, 2 CH
2), 2,37 (s, 3H; CH
3), 1,47 til 1,42 (m, 5 H, 2 CH
2, CH ), 1,23 (s, 3H; CH
3), 0,98 (s, 3H; CH
3), 0,41 ppm (s, 3H; CH
3);
13C NMR (CDCh
3, 100,6 MHz): δ 198,2, 180,6, 152,5, 149,8, 147,4, 134,6, 129,4, 126,3, 122,5, 68,7, 53,7, 53,6, 41,7, 39,5, 38,7, 36,2, 36,1 , 35,5, 31,2, 26,9, 24,2, 24,2, 18,7 ppm (figur S6); HRMS beregnet for C
23H
31N
2o
4 [M + H]
299,2284, funnet 299,2294.
4b, 8,8-Trimethyl-4b, 5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo [a, c] phenazin-2-yl 4-methylpiperazine-en-karboksylat (Pip-QX).
til en løsning av 5 (330 mg, 0,83 mmol) i toluen (25 ml) ble det tilsatt
o
-fenylendiamin (100 mg, 0,92 mmol) og silikagel (300 mg). Reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløp under N
2 i 18 timer og deretter konsentrert. Et flash-kromatografisk separasjon (0-3% MeOH i CH
2 Cl
2) ga Pip-QX som en gul olje (310 mg, 0,66 mmol) i 79% utbytte.
1 H NMR (DMSO
d
6
, 400 MHz):
δ
= 08.14 til 08.05 (m, 3 H, 3 lm), 7,81 til 7,79 (m, 2H , 2CH), 7,49 (d,
3
J plakater (H, H) = 8,4 Hz, 1 H, CH), 7,29 (dd,
3
J plakater (H , H) = 8,4 Hz,
4
J plakater (H, H) = 2,4 Hz, 1 H, CH), 3,63 (br s, 2H; CH
2), 3,46 (br s , 2H; CH
2), 2,88 (s, 1H, CH), 2,58 (m, 1H; CH
2), 2,38 (br s, 4H, 2 CH
2), 2,16 (s, 3H; CH
3), 1,51 til 1,38 (m, 5 H, 2 CH
2, CH), 0,96 (s, 3H; CH
3), 0,90 (s, 3H; CH
3 ), 0,06 ppm (s, 3H; CH
3);
13C NMR (DMSO
d
6
, 100,6 MHz):
δ
= 154,4, 153,3, 150,5, 147,5, 142,3, 141,6, 134,7, 130,2, 130,2, 129,4, 129,0, 125,7, 125,2, 119,3, 58,9, 54,7, 54,6, 46,2, 44,6, 44,0, 41,6, 37,7, 36,1, 35,4, 34,7, 31,8, 22,2, 19,0 ppm (figur S7); HRMS beregnet for C
29H
35N
4O
2 [M + H]
471,2760, funnet 471,2767.
Biologisk Studier
Dyret protokollen ble godkjent av korrektur Committee of College of Life Science and Technology ved Huazhong University of Science and Technology. Kreftcellelinjer HepG2, Hep3B, MCF-7 og C6 ble oppnådd fra ATCC (VA, USA). Humane leverceller HL-7702 og murine lever kreftceller H22 var fra Shanghai Institute of Life Science Cell Culture Center (Shanghai, Kina). Celler ble opprettholdt i høy glukose DMEM eller RPMI-1640-medium (Invitrogen, CA, USA) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1,0 mM natriumpyruvat, 50 U /ml penicillin og 50 ug /mL streptomycin ved 37 ° C og 5% CO
2. Stamløsninger av dT-QX, Pip-QX eller AZT ble fremstilt i DMSO, og doksorubicin Hydrokloridsaltet ble direkte oppløst i vann. Alle biologiske kjemikalier ble oppnådd fra Sigma Aldrich (WI, USA) med mindre annet er angitt. Alle eksperimenter ble gjentatt uavhengig av hverandre minst tre ganger.
Celleviabilitet MTT-analyse.
Cells (5000 per brønn) ble sådd ut på 96-brønners plater i vekstmedium over natten før hver behandling i triplicates. dT-QX, Pip-QX eller AZT var ved en endelig konsentrasjon på 0, 0,1, 1, 10, 20, 50, 100, eller 200 pM med total DMSO mindre enn 0,2%. Doxorubicin ble anvendt som en sammenligning ved en sluttkonsentrasjon på 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 eller 2,0 uM. Etter 72 timer ble MTT-analysen utført som rapportert [23]. Cellen levedyktighet av hver behandling ble plottet med GraphPad Prism-programmet, og IC
50 verdier ble oppnådd ved hjelp av sigmoidal dose-responsanalyse levert av programvaren (versjon 4.00, GraphPad Software, CA, USA).
anti-BrdU fluorescens analysen.
Hep3B, HepG2 eller HL-7702 celler (50.000 per brønn) ble sådd i vekstmedier over natten på 48-brønners plater og behandlet med 0, 10 eller 50 mikrometer dT-QX for 5 timer. Anti-BrdU analysen ble utført i henhold til produsentens anbefaling (BD Biosciences, NJ, USA). I korthet ble BrdU-oppløsning (0,1 mg /ml) tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer. Cellemediet ble fjernet, og cellene ble fiksert med 3,7% formaldehyd i PBS. Celler ble permeablized med 0,1% triton-100 i PBS og blokkert med 3% FBS i PBS-løsning. Cellulær DNA ble denaturert ved DNaseI (0,3 mg /ml) i PBS-løsning. Den innlemmet BrdU ble farget med Alexa Fluor®488 anti-BrdU monoklonalt antistoff (BD Biosciences, NJ, USA). Kjernene ble kontra farget med Hoechst 33342 løsning. Celle bilder av hver behandling ble tatt med Olympus IX71 invertert mikroskop utstyrt med et digitalt kamera under passende lys. Virkningene av Pip-QX og AZT på DNA-syntese i Hep3B ble vurdert på samme måte som beskrevet ovenfor.
Fluorescence studie av mitokondrie superoksid produksjon.
Hep3B eller HL-7702 celler (50.000 per brønn ) ble sådd ut i vekstmediet over natten på 48-brønners plater. Celler ble behandlet med 0 eller 50 uM dT-QX i 8 timer og deretter ble mediet fjernet. En oppløsning av MitoSOX Red mitokondriell superoksyd indikator (Invitrogen, CA, USA) i PBS ble tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 20 min. Cellene ble deretter vasket en gang med PBS og mot-farget med Hoechst 33342-løsning. Fluorescent bildene ble tatt med Olympus IX71 invertert mikroskop under passende lys. Studien med 100 uM Mn (III) tetrakis (1-metyl-4-pyridyl) porfyrin tetratosylate hydroksyd (MnTmPyP, EMD Chemicals, Inc., USA) som en positiv kontroll på Hep3B-celler ble utført på lignende måte.
subkutan levertumor hos mus.
Murine leverkreftceller H22 ble opprinnelig opprettholdt i RPMI-1640 vekstmedium og deretter vokser i BALB /c-mus (Hubei Laboratory Animal Center, Kina) intraperitonealt. Mus ble avlivet etter 4 dager og H22 ble cellene høstet med PBS-oppløsning. H22-celler ble vasket en gang med sterilt PBS og ble injisert subkutant (3×10
6 celler per mus) ved den nedre del av ryggen av naive BALB /c-mus. Når tumorer nådde en gjennomsnittlig størrelse på (8×8 mm, 340 mm
3), ble ni musene tilfeldig delt i tre grupper (3 per gruppe) og injisert med 100 ul saltvann (med 0,1% DMSO), AZT (50 pM i steril PBS med 0,1% DMSO) eller dT-QX (50 uM i steril PBS med 0,1% DMSO) på tumorstedet på dag 1 og dag 7. tumor~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP og kroppsvekt ble registrert daglig. På dag 12, etterfulgt den første injeksjon ble alle musene avlivet og bilder av svulster ble registrert. Statistisk analyse (en enveis ANOVA med Tukey multiple sammenligningstest) av behandlingene ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism software.
Resultater og diskusjon
Syntese av dT-QX ble oppnådd ved kobling av AZT med phenylquinoxaline 4 via kobber (I) -catalyzed klikk reaksjon (figur 2). Mellomprodukt 3 ble oppnådd fra nukleofil substitusjon av bromoalkyne 2 med oksidert terpenone 1. Phenylquinoxaline 4 ble oppnådd ved kondensering med
o
-diaminobenzene og silikagel under tilbakeløpskjøling i toluen, som var mye bedre enn acetonitril, DMF eller etanol. Konjugeringen av AZT med phenylquinoxaline 4 til dT-QX ble oppnådd i 75% utbytte ved hjelp av in situ-reduksjon av kobber (II) ved askorbat [20], [21]. Phenylquinoxaline 4, en referanse-molekyl, ble funnet å være dårlig oppløselig i 1% DMSO vandig oppløsning og følgelig ble modifisert til en
N
metylpiperazin-derivat Pip-QX, som vist i figur 2. Pip-QX ble syntetisert på tilsvarende måte dT-QX via omdannelse av 1 til piperazinderivatet 5, fulgt av kondensering med
o
-diaminobenzene i et totalt utbytte på 61%. Pip-QX fungert som en av referanseforbindelser i følgende biologiske studier. Flere grupper av DT-QX og kontroll forbindelser ble syntetisert, og alle partier utføres konsekvent ikke bare i kjemi, men også i biologiske studier.
Den biologiske aktiviteten til DT-QX ble først vurdert ved hjelp av celle levedyktighet analyse på et panel av kreftcellelinjer inkludert menneskelige leveren carcinoma HepG2 og Hep3B, mus leveren carcinoma H22, bryst adenokarsinom MCF-7, og rottehjerne glioma C6 celler. Humane lever HL-7702-cellelinjen ble brukt som en representant for normale celler i studien. HL-7702-celler transformeres humane normale hepatocytter med lavt uttrykk av kreftmarkører [24]. Behandling av HL-7702 med dT-QX har ikke ført til noen betydelig cytotoksisitet ved konsentrasjoner så høye som 200 uM (figur 3a). EF
50 av dT-QX på alle kreftcellene ble funnet å være i området 6,6 til 42,1 uM. Den mest fremtredende cytotoksisitet ble observert på human leverkreft Hep3B celler med mer enn 80% celledød ved 20 uM, etterfulgt av bryst MCF-7 adenom og hjerne glioma C6 celler. I sterk kontrast, Pip-QX ikke-selektivt drepte alle cellelinjer inkludert HL-7702 på 50 mikrometer (figur 3b). Den andre referanseforbindelsen, AZT som et 3′-deoksytymidin analog, ble funnet å utvise lav cytotoksisitet mot disse cellelinjer (figur 3c), mens samtidig behandling av AZT pluss Pip-QX også ikke-selektivt drept alle cellelinjer (figur 3d ), lik som Pip-QX behandling alene. Disse resultatene antydet at selektiv dreping av kreftceller enn normale leverceller ved dT-QX var på grunn av den unike kovalent konjugering av cytotoksisk phenylquinoxaline gruppe med 3′-deoksytymidin. Til sammenligning ble den anticancer medikament doxorubicin funnet meget giftige for alle disse cellene. Faktisk, doxorubicin var enda mer giftig mot normal lever 7702 celler enn leverkreft Hep3B eller H22 celler i konsentrasjoner over 0,5 mikrometer (Figur 3e).
Et panel av kreftcellelinjer (svart farge) og en normal lever hepatocytt cellelinje (rød farge) ble behandlet med a) dT-QX; b) Pip-QX; c) AZT; d) Pip-QX pluss AZT og e) doksorubicin, respektivt. Celleviabilitet ble vurdert etter 72 timers inkubering ved MTT-analyse. Den prosentvise levedyktighet ble beregnet og utstyrt med dose-responskurver ved bruk av GraphPad Prism software. Alle behandlingene ble utført i triplikater og gjentas minst tre ganger.
For ytterligere å forstå den selektive cytotoksisitet av dT-QX mot kreftceller, vi først undersøkt celleproliferasjon ved anvendelse av anti-BrdU fluorescens-analyse. BrdU (5-brom-3′-deoksyuridin) er en tymidinanalog som er innarbeidet i cellegenomet som det replikerer [25]. Følgelig, nivået av BrdU i cellekjernen gjenspeiler nivået av celledeling og proliferasjon. Tatt i betraktning de ovennevnte celle levedyktighet resultater, human HL-7702, HepG2 og Hep3B celler ble undersøkt som representanter for normale celler og kreftceller. Anti-BrdU-analysen ble utført ved 5 timer etter dT-QX behandling for å tillate tilstrekkelig opphopning av forbindelse i celler og for å bestemme dens virkning på cellulær DNA-syntese. Nivået av BrdU i cellekjerner ble målt ved anvendelse av en fluoriserende anti-BrdU-konjugat [25] (grønn farge) med cellekjerner mot farget med Hoechst 33342 (blå farge) som vist i figur 4.
BrdU assay ble utført etter at celler behandlet med forbindelsene i 5 timer. Den innlemmet BrdU ble farget med anti-BrdU Alexa Fluor®488 monoklonalt antistoff (grønn farge) med cellekjerner mot farget med Hoechst 33342 (blå farge). a) BrdU-inkorporering i HL-7702, HepG2 eller Hep3B celler behandlet med DMSO eller dT-QX; b) BrdU inkorporering inHep3B celler behandlet med DMSO, AZT eller Pip-QX.
I normale menneskelige HL-7702 celler, behandlinger av DMSO og DT-QX resultert i tilsvarende nivåer av BrdU innlemmelse i cellekjerner , noe som indikerte tilstedeværelse av dT-QX ikke forstyrrer med celledeling og proliferasjon. Imidlertid var signifikant tap av grønn fluorescens observert i kreft HepG2 og Hep3B celler med dT-QX behandling, sammenlignet med den for DMSO-kontroll (figur 4a). Disse resultatene indikerer at DT-QX selektivt hemmet cellulær DNA-syntese av HepG2-celler og Hep3B på et tidlig stadium av behandlingen resulterer i selektiv dreper begge av kreftceller. Inhiberingen av BrdU-inkorporering var mye mer uttalt på Hep3B celler med fullstendig tap av grønn fluorescens i cellekjernene (figur 4a). Dette var i samsvar med cellenes levedyktighet resultater som dT-QX var mer effektive i å drepe Hep3B enn HepG2 celler. Jo mer uttalt cytotoksisitet på Hep3B celle enn HepG2 kan skyldes det faktum at Hep3B er stammer fra hepatitt B-infeksjon [26].
For å belyse hvilke chemophore av DT-QX var ansvarlig for hemming av DNA-syntese, anti-BrdU fluorescens-analysen ble utført med AZT eller Pip-QX på Hep3B celler (figur 4b). Behandling av AZT ga ingen signifikant hemming av DNA-syntesen, mens Pip-QX vesentlig hemmet DNA-syntese i cellene, i likhet med den i dT-QX, noe som indikerer phenylquaxinoline chemophore var ansvarlig for inhibering av DNA-syntese observert. I kombinasjon med cellelevedyktighetsresultatene, er det foreslått at konjugering med 3′-deoksytymidin entydig modifisert det cytotoksiske phenylquinoxaline chemophore for å gjøre det mer selektiv mot kreftceller enn normale hepatocytter. Resultatene bekreftet også at conjugating kinoksalin delen med 3′-triazol-3′-deoxythymine førte til selektivt rettet mot kreftceller ved å blokkere deres DNA-syntese.
Den selektive hemmingen av nukleært DNA syntese av DT-QX i kreft -celler førte til den hypotese at dT-QX kan selektivt inhibere mitokondrie DNA-syntese og forårsake mitokondriell dysfunksjon i tillegg. Dessverre er den anti-BrdU fluorescerende analysen var ikke følsom nok til å observere et slikt hemming i celler. Alternativt har mitokondriell dysfunksjon på grunn av DNA tømming av nukleosid-analoger blitt rapportert å forekomme samtidig med forhøyet superoksyd nivå i mitokondriene etter behandling i 4 dager [27]. Derfor ble effekten av dT-QX på mitokondriefunksjon vurdert ved anvendelse av en fluorescens-basert mitokondriell superoksid bildeanalyse. Hep3B celler ble undersøkt som representant for kreftcelle modell på grunn av uttalt hemming av DNA-syntese på tidlig stadium av DT-QX observert i anti-BrdU analysen (figur 4a).
Betydelig rød fluorescens indikerer superoksid produksjon ble påvist i Hep3B celler etter behandling med 50 uM dT-QX til 8 timer, sammenlignet med det DMSO (figur 5). Cytosoliske Tilstedeværelsen av røde flekker av superoksid ble bekreftet av kontrafarging cellekjerner med Hoechst fargestoff. Det ble også funnet at behandling av Hep3B celler med dT-QX for en kortere tid, slik som 3 eller 5 h induserte ikke signifikant rød fluorescens, noe som tyder på produksjon av mitokondriell superoksyd ble akkumulert og var sannsynligvis på grunn av hemming av cellulær DNA-syntese. I tillegg er en positiv styring med et Mn (III) -chelator som virker som et NADPH /GSH: O
2
– oksidoreduktase i celler [28] førte til et tilsvarende nivå av rød fluorescens i Hep3B celler til det behandlede med dT-QX (se fig S8). I motsetning til dette ble lav bakgrunn rød fluorescens observert i humane normale HL-7702-celler behandlet med DT-QX, lik den som er behandlet med DMSO (figur 5). Dermed disse resultatene antydet at dT-QX kan føre til mitokondriell dysfunksjon ved å indusere mitokondriell superoksyd spenning i kreftceller som følge av inhibering av DNA-syntese.
kreftcellelinje Hep3B eller normale HL-7702-celler ble behandlet med DMSO eller 50 uM dT-QX i 8 timer. Nivået av mitokondriell superoksyd ble påvist med MitoSOX mitokondrie superoksyd-indikator (rød farge). Cellekjerner ble kontra farget med Hoechst fargestoff (blå farge).
En foreløpig vivo antitumor studie med DT-QX i ble utført i en musemodell. Subkutane svulster ble etablert med murine H22 lever kreftceller [29]. Tumorene fikk nå en gjennomsnittlig størrelse på 8,8 x 8,8 mm. Den relativt lave løseligheten av dT-QX i PBS-løsning begrenset av administrerings å være intra-tumorinjeksjoner. Således, AZT eller dT-QX (100 mL x 50 uM hver) ble injisert direkte inn i tumorer på dag 1 og dag 7. Uavhengig av behandlinger, døde ingen mus heller ikke var det en signifikant kroppsvekttap ble observert under 12-dagers studium. Tumorvekst profilen over 12 dager etter første injeksjon er vist i Figur 6a. Tumorer i mus behandlet med AZT vokste raskt, lik de av negativ kontroll (saltoppløsning); mens veksten av tumorer ble betydelig hemmet i dT-QX behandlede mus (figur 6a). På dag 12 etter den første injeksjonen, størrelsene av tumorer i mus injisert med dT-QX var tydelig mindre enn de med AZT eller saltvann (figur 6b). Statistisk analyse bekreftet også at behandlingen av DT-QX var signifikant forskjellig fra de to andre (
P
0,01). Disse resultatene antydet at intra-tumor injeksjon av dT-QX ved en lav dosering (ekvivalent med 0,13 mg /kg per mus) var ganske effektiv til å inhibere veksten av subkutane tumorer i en musemodell.
Subkutan tumor var etablert ved å injisere H22 celle ved den nedre del av ryggen av BALB /c-mus subkutant (3 x 10
6 celler per mus).
