Abstract
Lungekreft er den mest dødelige kreftform i verden, og hvert år tusenvis av mennesker dør av denne sykdommen. Tidlig oppdagelse har vist seg å øke 5-års overlevelse for kreft generelt, uavhengig av opprinnelse området i lungen. For å møte denne utfordringen har vi brukt cellebasert SELEX (Systematisk Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse) for å velge et panel av aptamerer i stand til å skille lunge adenokarcinomceller fra normale lunge epitelceller. Disse aptamerer binde ved fysiologisk og formalinfiksert forhold og vise tilhørighet til sine mål med tydelig K
d’s i nanomolar rekkevidde. Våre funn tyder på at de valgte aptamerer har potensial til å bli brukt i kliniske settinger, samt å bedre klassifisering av nonsurgical eksemplarer, en annen aktuell utfordring i lungekreft
Citation. Jiménez E, Sefah K, López- Colón D, Van Simaeys D, Chen HW, Tockman MS, et al. (2012) Generering av lungeadenokarsinom DNA aptamerer for Cancer Studies. PLoS ONE 7 (10): e46222. doi: 10,1371 /journal.pone.0046222
Redaktør: Muy-Teck Teh, Barts The London School of Medicine og odontologi, Queen Mary University of London, Storbritannia
mottatt: 7 mai 2012; Godkjent: 28 august 2012; Publisert: 17 oktober 2012
Copyright: © Jiménez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Offentliggjøring av denne artikkelen ble finansiert delvis ved University of Florida Åpen-Access Publishing fondet og ved National Institutes of Health gi # 69953, Washington, DC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den nest vanligste krefttypen og den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. I USA er det anslått at 226,160 nye tilfeller og 160,340 dødsfall vil skje i 2012 (for ikke-småcellet og småcellet kombinert). Sammenlignet med andre krefttyper, lunge- neoplasmer er meget heterogen, med tumorer å vise mer enn en subtype som et felles trekk [2]. De aller fleste av lunge neoplasmer er karsinom, som er generelt klassifisert som enten ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC) eller småcellet karsinom (SCLC) på grunnlag av morfologisk analyse av farget histologiske prøver [3] – [4]. NSCLC er den vanligste krefttypen lunge, som består 85% av alle lungekrefttilfeller, men det er en mer passiv krefttype. NSCLC er sammensatt av tre forskjellige undergrupper: adenokarsinom (ADC), plateepitelkarsinom (SCC), og stor celle karsinom (LCL). På den annen side er SCLC mindre vanlig, omfattende 15% av alle krefttilfeller lunge, men det er mer aggressiv. Røyking er en risikofaktor tungt forbundet med lungekreft, spesielt SCC [5] – [10]. Lunge adenokarsinom er ofte utviklet av pasienter som aldri har røykt, og genetiske endringer er ofte forbundet med sin debut.
Siden de fleste mennesker med lungekreft på et tidlig stadium ikke viser symptomer, mer enn 70% av lungekreft tilfellene er diagnostisert på senere stadier, hvor 5-års overlevelse er liten. Derfor er forskning rettet mot tidlig oppdagelse, som er avgjørende for å redusere dødelighet og sykelighet, har slått til utvikling av egnede aptamerer. Aptamerer er korte, enkelt-trådet DNA eller RNA-oligonukleotider som er meget spesifikke mål-gjenkjenningselementer basert på deres unike tredimensjonale former [11] – [12]. Mens prosessen kjent som SELEX (Systematisk Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse) ble opprinnelig brukt til å velge aptamerer mot mål som rensede proteiner [13] – [14], cellebasert SELEX har blitt den nyeste metoden for å velge aptamerer mot hele celler , spesielt de aptamerer rettet mot overflateproteiner overexpressed i kreftceller.
Blant sine mange fordeler, har aptamerer vist ingen eller svært lav, immunogenisitet, tillater
in vivo
studier med disse probene [15] – [18]. De har også blitt populært som alternativer til antistoffer, på grunn av aptamerer «lav kostnad (ingen dyr som er nødvendige for produksjon), enkel kjemisk modifikasjon, og cellulært opptak evne. I tillegg, fordi aptamerer er små i lengde med vanligvis 15 til 100 nukleotider (nt), har de bedre vev gjennomtrengning sammenlignet med antistoffer. I 2004 Macugen, en anti-VEGF (vascular endothelial growth factor) inhibitor, ble den første aptamer godkjent av Food and Drug Administration (FDA) for aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) [19]. Andre aptamerer forbli i kliniske studier [20], og har vist stort potensial i biomedisinske feltet, inkludert separasjon, levering av legemidler og target-probe måling. Rapporten beskriver anvendelsen av celle SELEX for å velge et panel av aptamerer som er i stand til å skjelne mellom lunge adenokarsinom og normale lunge epitelceller.
Diskusjon
Resultater og
Siden deres oppdagelse, aptamerer er blitt generert mot forskjellige mål, blant annet proteiner, peptider og levende celler [21] – [22]. For å isolere aptamerer som er i stand til å differensiere lunge adenokarsinomceller fra normale lunge epitelceller, vi brukte cellebasert SELEX-strategi. H23 lunge adenokarsinom og HBE 135-E6 /E7 normal epitelial lunge ble anvendt som positive og negative cellelinjer, henholdsvis. En innledende ssDNA tilfeldig bibliotek som inneholder omtrent 10
14 forskjellige sekvenser av 80 nukleotider (nt) ble beriket av sekvensiell binding med målceller, eluering og påfølgende forsterkning av PCR i 18 runder. Disse DNA-sekvenser som kunne gjenkjenne H23 celleoverflatemembranproteiner som er potensielle markører for målrettet terapi. I tidligere runder av prosessen, ble telleren utvalg innført for å fjerne mulige sekvenser bindingsproteiner felles for både mål- og negative cellelinjer. Denne prosedyren ble utført hver andre rundt hele utvalget. Sekvenser binding til målceller ble eluert og PCR-forsterket, hvoretter ssDNA ble utvunnet og brukt til å overvåke utvelgelsesprosessen ved strømningscytometri. På grunn av at ssDNA-bassengene ble anriket med sekvenser som er spesifikke for målet, ble en økning i fluorescens-intensitet første merke i runde 12 (figur 1A), noe som indikerer at de sekvenser viste bedre binding på overflaten av H23-celler sammenlignet med det opprinnelige biblioteket. Som det merkede kommet, fluorescensintensiteten av de etterfølgende bassenger gradvis inntil en stabil tilstand i fluorescensintensitet ble observert i runder 17 og 18 (figur 1 B), noe som indikerer at maksimal binding hadde blitt oppnådd. I kontrast, ble slik berikelse ikke observert når de beriket bassengene ble testet mot normale lunge epitelceller (figur 1D), noe som tyder på at sekvenser som finnes i disse bassengene var i stand til å skille lunge adenokarcinomceller fra normale lunge epitelceller. Derfor bassenger 14, 16 og 18 ble valgt ut til å bli sekvensert som aptamer kandidater (figur 1C).
Binding analysen av bassenger 11-18 med H23 (A-B) og bassenger 15-18 med HBE135 E6 /E7 (C). Flowcytometri assay for å overvåke bindingen av valgte basseng med H23-celler (målceller) og HBE135 E6 /E7 (negative) celler. Den grønne kurven representerer bakgrunnen bindingen av umerket DNA bibliotek. For H23 celler, var det en økning i bindingskapasitet av bassengene som utvalget kommet, mens det var liten endring for kontrollcellene, HBE 135 E6 /E7. Mål figur 1: Målet med dette tallet er å vise hvordan celleutvelgelsesprosessen ble beriket for H23 cellelinje, men ikke for HBE135E6 /E7 cellelinje
sekvense Prosessen begynte med byggingen av. 454 sekvense biblioteket ved PCR-tillegg av 454-spesifikke primere til 3′- og 5′-endene av beriket bassenger. Å identifisere basseng for hver sekvens, en unik identifikasjonskode (midten identifikasjonskode, MID) ble også PCR-introdusert til 454 sekvense biblioteket. Innsettingen av primere i det anrikede bassengene ble bekreftet ved gelelektroforese (data ikke vist). Etter 454 sekvensering ved UF ICBR kjernen, ble rundt 7000 sekvenser hentet og analysert. De ble gruppert på grunnlag av MID som tilsvarer den samme basseng, og primere ble fjernet ved en Perl program. Sekvensene inneholder bare tilfeldig regionen ble deretter justert ved hjelp av den elektroniske program MAFTT 6.0 [23], og seks aptamer familier som tilsvarer de mest tallrike sekvenser ble valgt som aptamer kandidater. De ble kjemisk syntetisert, biotin-merket ved 3′-enden, renset ved HPLC og kvantifisert. Alle aptamerer vises binding med H23 lunge adenokarsinom-celler, mens ingen signifikant binding ble observert med kontrollcellelinjen HBE 135 E6 /E7, normale epitelceller lungeceller (figur 2 og figur S1). Disse resultatene tyder på at vellykket negativ seleksjon var blitt utført, og at utvalgte aptamerer kunne skjelne mellom lunge adenokarsinom og normale lunge epitelceller, et resultat som gir disse aptamerer med potensial for bruk i lungekreft diagnose, overvåking tumorprogresjon og behandling, eller annen aktuelle applikasjoner.
Strømningscytometri-analyse for binding av den valgte aptamer EJ4 med H23 (mål-cellelinje) og HBE135 E6 /E7 (negativ cellelinje). Den grønne kurven representerer bakgrunnsbinding av en tilfeldig sekvens (bibliotek). Mål Figur 2: Målet med dette tallet er for å vise at kandidat aptamerer er faktisk aptamerer fordi de binder med den positive cellelinje (H23), men ikke binder med den negative cellelinje (HBE135E6 /E7)
.
Alle de utvalgte aptamerer viste bindende slektskap (tilsynelatende K
d’e) til H23 cellelinje i nanomolar området (45-250 nM) (tabell 1 og figur S6). Disse resultatene tyder på at disse aptamerer blir allment brukbar, da de tett binder seg til sine mål. Videre studier ble utført for å karakterisere de valgte aptamerer. Bindingen ble videre testet mot lungecancercellelinjer, så vel som andre cellelinjer, inkludert eggstokk og tykktarmen, slik som vist i tabell 2. aptamerer EJ2, EJ4 og ADE1 vist noen anerkjennelse mot en eller flere av de følgende cellelinjer: TOV21G, DLD1, og H460. I tilfelle av DLD1, et kolon adenocarcinom-cellelinje, var det interessant å se noen anerkjennelse av de valgte aptamerer, noe som tyder på at en mulig felles celleoverflate mål er til stede i disse to cellelinjene, fordi de tilhører den samme histologiske gruppe. I en tidligere studie i vårt laboratorium, ble målproteinet av Sgc8 aptamer demonstrert å være PTK7 [24], et pseudo-kinase-protein til stede i CEM-celler (målcellen linje for at seleksjon), så vel som andre kreftformer, inkludert eggstokk , lunge, tykktarm, bryst og noen leukemicellelinjer, noe som indikerer at vanlige proteiner kan være til stede som et resultat av kreft [25] – [26]. Aptamerer, EJ4 og ADE1 viste også bestemt spesifisitet mot lunge adenokarsinom-cellelinje med betydelig økning i fluorescens-intensitet i forhold til en tilfeldig sekvens, men ikke til normale lungeceller. Disse resultatene tyder på at disse aptamerer kunne brukes til lungekreft studier.
Fleksibel binding av aptamerer ved forskjellige temperaturer kan utvide deres repertoar av applikasjoner. Ettersom valget ble utført ved 4 ° C, utførte vi bindingsforsøk ved 25 ° C og 37 ° C (figur 3 og figur S2). Som vist i Figur 3 og Figur S3, aptamerer ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 og EJ7 konservert binding ved 25 ° C og 37 ° C med fluorescensintensiteter som ligner de ved 4 ° C. Dette er spesielt viktig i analyser utført under fysiologiske betingelser, slik som de som vurdere
in vivo
anvendelser.
Strømningscytometri-analyse for den valgte aptamer EJ4 med H23 (mål-cellelinje) ved fysiologisk temperatur ( 37 ° C). Binding ved 4 ° C ble benyttet som positiv kontroll. Den grønne kurven representerer bakgrunnsbinding av en tilfeldig sekvens (bibliotek). Formålet Figur 3: Målet med denne figur er å vise bindingen av det valgte aptamer EJ4 ved 25 ° C og fysiologisk temperatur, 37 ° C
Cancer deteksjon avhengig av undersøkelse av vev fra biopsier. , som er festet i henhold til kjemiske betingelser for å bevare integriteten og antigenisiteten av tumorprøver for senere bruk. En viktig analyse i kreftdiagnose er farging, hvor fersk dissekerte vev er festet før behandling med prober, så som antistoffer og aptamerer, spesielt for tumormarkører. Tidligere studier har vist at aptamerer er i stand til merking av formalinfiksert vev parafin (FFPE) etter deparaffinization og antigen gjenfinning [27] – [28]. For å bestemme evnen til binding av de valgte aptamerer under disse betingelsene, ble cellene fiksert med 10% formalin før inkubering med merkede aptamerer. Som kontroll for disse forsøk, to kjente aptamerer for leukemi, Sgc8 og TD05, og deres tilsvarende bindings-cellelinjer ble anvendt for å vise at prosessen med fikseringen ikke produserer noen fluorescens signal. Derfor noen fluorescens påvises bør være en indikasjon på en forpliktende hendelse mellom aptamerer og sitt mål. Som vist i figur S3, begge kontrollene beholdt sin opprinnelige bindingsprofil, noe som indikerer at ingen kunstig økning i fluorescens-intensitet oppstått som et resultat av feste forhold. EJ2, EJ5, EJ7, ADE1, og ADE2 aptamerer opprettholdt lignende binding til det som vises ved 4 ° C (figur 4) som indikerer at aptamerer kan binde seg til sine mål selv under faste forhold. Disse resultatene antyder sterkt at utvalgte aptamerer har potensiale til å bli brukt som gjenkjennelsesmolekyler i kliniske prøver.
Bindingsassay av aptamerer med H23 (target) celler pre-fiksert med 10% formalin. Venstre kolonne viser bindingen av utvalgte aptamerer med ubehandlede celler ved 4 ° C. Høyre kolonne viser binding av utvalgte aptamerer faste celler. Den lysegrønne kurve representerer bakgrunnsbinding av en tilfeldig sekvens (bibliotek). Mål figur 4: Målet med dette tallet er å vise bindingen funksjonaliteten i et valgt aptamer EJ4 til celler som har blitt fikset med 10% formalin
Under valget av celler er det forventet at aptamerer samhandle. spesielt med overflatene til målcellene; dette problemet har blitt rapportert i flere studier [29] – [31]. I vårt eksperiment ble celler behandlet med to enzymer, trypsin og proteinase K, i 3 og 10 minutter, vasket med PBS, og deretter inkubert med aptamerer. Alle de valgte aptamerer tapt binding etter behandling med begge proteaser (figur 5 og figur S5 For alle forsøk ble fluorescensintensiteten betydelig redusert,. Men det signal som svarer til analyser med proteinase redusert til bakgrunnen, som indikerer at målproteinet ble fjernet fullstendig . etter behandling
Strømningscytometri-analyse for utvalgte aptamerer etter behandling med proteaser, ubehandlede celler ble anvendt som positiv kontroll (A) celler ble behandlet med trypsin for 3 og 10 min før binding med valgt aptamer EJ4 (B).. celler ble behandlet med proteinase K til 3 og 10 min før binding med aptamer EJ4 Sikt figur 5:. Hensikten med denne figur er å vise at målene for de valgte aptamerer er proteiner som er tilstede i cellen overflaten av kreftceller (H23).
Konklusjon
i konklusjonen, har vi valgt et panel av aptamerer i stand til å skille lungekarsinom fra normale lunge epitelceller. Disse aptamerer viser høy affinitet mot H23 cellelinje med tilsynelatende K
d «
s i det nanomolare området, men ingen påvisbar affinitet for normale lunge epitelceller. Aptamerer viste også binding under fysiologiske betingelser, så vel som etter kjemisk fiksering, noe som tyder på at de kan være anvendelig for
in vivo
eksperimenter. Proteinase behandling indikerte at alle aptamerer i dette panelet binder til proteiner på målcellen overflaten. Alle disse resultatene tyder på brede potensielle anvendelser av utvalgte aptamerer på grunn av deres spesifisitet for cancervev, men ikke for friske celler. Disse aptamerer kan også brukes som molekylære prober i kliniske prøver, for eksempel fersk hentet svulster og bevart histologiske prøver.
Materialer og Metoder
Bibliotek Design
Primerne var utformingen for å tilfredsstille de følgende egenskaper: et minimum hårnål struktur, tilsvarende smeltetemperatur (T
m) og minimal baseparing. Primerne og en 80-mer-biblioteket ble utviklet ved hjelp av IDT Oligo Analyzer 3.1 programvare [32]. Den fremre primer ble merket med fluoresceinisotiocyanat (FITC) ved 5′-enden, og den reverse primer ble merket med biotin ved 5′-enden. Biblioteket besto av en randomisert 44-nt regionen flankert på 5′-enden av FITC- merket primer og flankert på 3′-enden av den komplementære tråden av umerket revers primer.
Instrumentering og reagenser
biblioteker og primere ble syntetisert ved hjelp av 3400 DNA synthesizer (Applied Biosystems). Alle reagenser for DNA-syntese ble kjøpt fra Glen Research. DNA-sekvenser ble renset ved omvendt fase HPLC (Varian Prostar ved anvendelse av en C18-kolonne og acetonitril /trietylammoniumacetat som mobil fase). PCR ble utført på en Biorad Thermocycler, og alle reagenser ble anskaffet fra Takara. Overvåkingen av utvelgelsesprosessen, bindingsanalyser, og bestemmelse av dissosiasjon konstanter for de valgte aptamerer ble utført av flowcytometrisk analyse ved hjelp av et FACScan cytometer (BD Immunocytometry Systems).
Cell Kultur og buffere
i alt åtte etablerte cellelinjer ble brukt i dette prosjektet, alle kjøpt fra American Tissue Culture Collection (ATCC). H23 (CRL-5800) adenokarsinom NSCLC ble valgt som den positive cellelinje, mens den negative cellelinje som ble valgt var HBE135-E6 /E7 (CRL-2741), normale humane bronkiale epitelceller. Den H23-cellelinjen ble opprettholdt i RPMI-1640 (ATCC) dyrkningsmedium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS varme-inaktivert) og 1% penicillin-streptomycin. Den normale bronkial lunge-cellelinjen ble opprettholdt i en Keratin serumfritt medium supplert med 5 ng /ml humant rekombinant EGF, 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (Invitrogen), 0,005 mg /ml insulin og 500 ng /ml hydrokortison (Sigma -Aldrich). Celler ble inkubert ved 37 ° C under 5% CO
2 atmosfære. Andre cellelinjer som benyttes for selektivitet analysen var CAOV3 og TOV21G ovarian kreft cellelinjer, A549 lunge adenokarsinom, H520 lunge plateepitelkarsinom, H460 stor celle lungekarsinom, og DLD1 kolon adenokarsinom, og alt ble opprettholdt i henhold til ATCC spesifikasjoner. Under utvelgelse, ble to buffere brukt: vaskebuffer (IM) (glukose, 0,45% vekt /volum og MgCl
2 5 mM i PBS) og bindingsbuffer (BB) (1 mg /ml tRNA og 1 mg /ml BSA i WB). Alle tidligere reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich.
In vitro
Utvalg
Fordi begge cellelinjer som brukes under valget, adenokarsinom og normale menneskelige bronkial epitelceller, er tilhenger cellelinjer, utvalget ble utført på cellemonolagene. Omtrent 20 nmol av den syntetiserte bibliotek ble oppløst i 700 ul av bindingsbuffer. Før prosessen ble igangsatt, ble DNA pool denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i fem minutter, fulgt av rask avkjøling på is. Dette tvang DNA-sekvenser for å ta i bruk de mest gunstige sekundære strukturer. DNA-bibliotek ble så inkubert med ca. 3 x 10
6 målceller (H23) ved 4 ° C i 30 minutter. Deretter ble cellene vasket 3 ganger med vaskebuffer for å fjerne ubundet sekvenser. Etterpå ble de bundne sekvensene gjenvunnet ved oppvarming ved 95 ° C i 10 minutter og deretter sentrifugering ved 14.000 rpm for å fjerne celleavfall.
Supernatanten som inneholdt DNA-sekvensene ble oppsamlet, og den valgte bassenget ble PCR-amplifisert ved å bruke FITC- og biotin-merkede primere. Deretter ble dannelsen av enkeltkjedet DNA (ssDNA) oppnådd ved inkubering med streptavidin-belagte Sepharose-kuler, skaffe den biotinylerte strengen. Counter valg ble gjennomført etter å observere noen berikelse med målcellene. For å kunne velge aptamerer med høy spesifisitet og selektivitet, nivåene av vasker (antall vaskinger, vask tid og volum av vaskebuffer) ble øket i etterfølgende runder. Anrikningen av bassengene ble overvåket ved hjelp av flow cytometri, sekvensert med 454 teknologi, og analysert for aptamer kandidater.
flowcytometrisk analyse
Strømningscytometri ble anvendt for å overvåke anrikning av ssDNA-sekvenser er bundet innenfor bassengene under utvelgelsesprosessen, samt å vurdere bindende affinitet og spesifisitet av de valgte aptamerer. De dyrkede celler ble vasket med WB før og etter inkubering med FITC ssDNA bassenget eller utvalgte DNA-sekvenser. Fluorescensintensitet ble bestemt på et FACScan cytometer (BD Immunocytometry).
454 Sekvensering og analyse
Etter 18 runder med valg, beriket bassenger 14, 16 og 18 ble valgt for sekvensering. 454-spesifikke primere og MID var PCR-forsterket og lagt til hver sekvens som finnes i hvert basseng, noe som gir en 125-bp produkt. Reaksjonene ble bekreftet ved gel elektroforese, rengjøres med en PCR rensing kit (Qiagen), og sendt til ICBR kjernen ved University of Florida for analyse.
Rundt syv tusen sekvenser ble hentet og analysert. Først sekvenser ble gruppert på grunnlag av deres MID for å bestemme den tilsvarende anrikede bassenget. For det andre ble primere og MID fjernet av Perl program for å la bare tilfeldig delen av sekvensen for homologi analyse med MAFFT 6,0 programmet.
bmdingsanalyser
ulike familier av sekvenser hentet fra flersekvensanalyser ble syntetisert, biotin-merket ved 3′-enden, og testet for binding med den positive og negative cellelinje. I tillegg ble binding selektiviteten for hver kandidat bestemt ved inkubering av en 250 nM aptamer oppløsning med 4 x 10
5 mål eller mot-celler i 30 minutter ved 4 ° C. Cellene ble vasket to ganger med WB og inkubert med streptavidin PE perler i 20 minutter ved 4 ° C. Etter vasking ble cellene suspendert i 200 ul WB. Fluorescens ble bestemt med en FACScan cytometer ved å telle 3 × 10
4 arrangementer. En randomisert 80-mer-sekvensen ble brukt som kontroll.
bindingsanalyser med faste celler
For å bestemme evne aptamerer å binde seg til faste celler, prosedyrer som ligner de som er beskrevet ovenfor ble fulgt , med unntak av den innledende behandling av cellene. Kort sagt ble adherente celler H23 frigjøres fra fatet ved inkubasjon med ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning, og deretter fiksert med 10% formalin løsning i 15 min ved 4 ° C, vasket og suspendert i bindingsbuffer.
selektivitet og spesifisitet analyser
for å bestemme spesifisiteten av disse aptamerer, ulike cellelinjer, inkludert CAOV3, DLD1, A549, H520, H460, og TOV21G, ble brukt i bindingsanalyser. Fluorescensintensiteten ble målt for å bekrefte binding. Alle forsøkene fulgte flowcytometri eksperimentelle prosedyren beskrevet ovenfor.
Temperatur effekt på aptamer bindende
Utvalg ble utført ved 4 ° C.To avgjøre om temperaturen vil påvirke bindingen mellom aptamer og målcellene , bindingsanalyser ble utført ved ytterligere to temperaturer, 25 ° C og 37 ° C.
bestemmelse av dissosiasjonskonstanten
affinitet aptamer og dens target ble evaluert ved metning assay. En prøve inneholdende 5 x 10
5 H23-celler ble vasket og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av aptamer inntil metning var oppnådd. Alle bindingsanalyser ble gjentatt tre ganger, og den midlere fluorescensintensitet ble beregnet ved å subtrahere den fluorescensintensiteten av en kryptert sekvens. Data ble samlet inn, og dissosiasjonskonstant (K
d) ble oppnådd ved å tilpasse til en enkelt bindingssete metningsmodell ved hjelp av Sigmaplot 11.2v (Jandel, San Rafael, CA).
Protease Fordøyelse
trypsin og proteinase K-behandling.
H23-celler ble vasket to ganger med PBS og deretter inkubert med 3 ml av enten 0,05% trypsin /0,53 mM EDTA i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS), Cellgro, eller 0,1 mg /ml proteinase K i PBS ved 37 ° C i 3 og 10 minutter. FBS ble tilsatt for å stoppe proteinase aktivitet. Cellene ble vasket med WB og senere brukes til bindingsanalysene beskrevet ovenfor.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Karakterisering av utvalgte aptamerer. Flowcytometri analyse for binding av aptamerer ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 og EJ7 med H23 (target cellelinje) og HBE135 E6 /E7 (negativ cellelinje). Den grønne kurven representerer bakgrunnen binding av en tilfeldig sekvens (bibliotek)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046222.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Aptamer bindende i fysiologiske forhold. Strømningscytometri-analyse for binding av aptamerer ADE1, ADE2, EJ4, EJ5 og EJ7 med H23 (mål-cellelinje) ved 25 ° C og 37 ° C. I dette sett av eksperimenter, binding ved 4 ° C ble benyttet som positiv kontroll. Den grønne kurven representerer bakgrunnen binding av en tilfeldig sekvens (bibliotek)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046222.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
kontroll eksperiment for faste behandlede celler. Binding analyse av aptamer Sgc8 med (A) CEM (mål) celler og (b) Ramos (kontroll) celler før (venstre) og etter (høyre) fiksering, som viser at ingen kunstige fluorescens signal ble produsert
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046222.s003 product: (TIF)
Figur S4.
bindingsanalyser etter fiksering med 10% formalin. Bindingsanalysen av aptamerer med H23 (target) celler pre-fiksert med 10% formalin. Venstre kolonne viser binding av aptamer ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 og EJ7 med ubehandlede celler ved 4 ° C. Høyre kolonne viser binding av de samme aptamerer EJ5 med faste celler. Den lysegrønne kurven representerer bakgrunn binding av en tilfeldig sekvens (bibliotek)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046222.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
bindingsanalyser etter proteinase behandling. Strømningscytometri-analyse for aptamerer ADE1 og ADE2, EJ5 og EJ7 etter behandling med proteaser; ubehandlede celler ble anvendt som positiv kontroll. (A) og (C) Celler ble behandlet med trypsin for 3 og 10 min henholdsvis før binding med aptamerer ADE1 og ADE2, EJ5, og EJ7. (C) og (D) celler behandlet med proteinase K til 3 og 10 min før binding med aptamerer henholdsvis
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046222.s005 plakater (TIF)
Figur S6.
Tilsynelatende Kd-er for utvalgte aptamerer. Metnings bindende kurver for utvalgte aptamerer ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 og EJ7. Celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av den aptamer i tre eksemplarer. Gjennomsnittlig fluorescens intensitet uselektert bibliotek ble trukket fra hver tilsvarende aptamer konsentrasjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046222.s006 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Dr. Tahir Bayrac for nyttige råd som bidro til dette arbeidet, Dr. Kathryn Williams for hennes kritisk gjennomgang av manuskriptet og DNA-sekvensering kjernen, ICBR, ved University of Florida for deres hjelp under 454-sekvensering.
