Abstract
Til tross for bemerkelsesverdig forbedring av postoperative 5-FU-basert adjuvant kjemoterapi, den tilbakefall av magekreftpasienter som gjennomgår kurativ reseksjon fulgt av adjuvant kjemoterapi er fortsatt stort. Derfor er det viktig å identifisere markører prediksjon for det kjemoterapeutiske effekten av 5-FU. Vi har nylig identifisert NF-kB som kandidat tilbakefall prediksjon biomarkør i magekreft. For å evaluere den biologiske betydning av NF-kB i forbindelse med 5-FU-kjemoterapi, analyserte vi NF-kB-avhengige biologiske respons på 5-FU-behandling i magecancercellelinjer. Syv gener som induseres av 5-FU behandling i en NF-kB-avhengig måte ble identifisert, hvorav fem er kjent p53-mål. Knockdown av
RELA
, som koder for p65-subenheten av NF-kB, redusert både p53 og p53 mål proteinnivåer. I kontrast, ble NF-kB påvirkes ikke av
TP53
knockdown. Vi demonstrerte også at cellelinjer som bærer Pro /Pro homozygositet i codon72 av p53 exon4, noe som er viktig for NF-kB-binding til p53, er mer resistente mot 5-FU enn de med Arg /Arg homozygositet. Vi konkluderer med at NF-kB spiller en viktig rolle i respons på 5-FU behandling i magecancercellelinjer, med en mulig kompenserende funksjon av p53. Disse resultater antyder at NF-kB er en potensiell 5-FU-kjemosensitivitet forutsigelse markør som kan gjenspeile 5-FU-indusert stressresponsreaksjonsveier, inkludert p53
relasjon:. Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) en kompensatorisk rolle NF-kB til p53 i Response til 5-FU-basert kjemoterapi i magekreft cellelinjer. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10,1371 /journal.pone.0090155
Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, Tyskland
mottatt: Oktober 17, 2013, Godkjent: 28 januar 2014; Publisert: 27 februar 2014
Copyright: © 2014 Endo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av MIAST (Medical Innovation av Advanced Science and Technology) prosjekt av Grant-i-Aid for Strategic Medical Science Research Center fra departementet for utdanning, kultur, vitenskap og teknologi i Japan, 2010-2014 (SSN, K.Ku. , GW); og Grant-i-Aid for Scientific Research (C) (11863286) (S.S.N.), og (12877914) (K.Ko.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de fleste av magekreft i verden er diagnostisert i Øst-Asia [1], der standardbehandling for avansert magekreft er fortsatt kirurgi og kjemoterapi. Nylig utviklet adjuvant kjemoterapikurer etter kurativ gastrektomi for avansert magekreft har gjort bemerkelsesverdig fremgang når det gjelder å kontrollere tilbakefall og sykdomsfri overlevelse, særlig i den japanske befolkningen [2], [3]. Men 30-40% av pasientene fortsatt opplever tilbakefall til tross mottar kjemoterapi etter kurativ gastrektomi [3], noe som tyder på at pasientens valg basert på molekylær informasjon kan potensielt være svært effektivt for å øke kjemoterapi-mediert ikke-tilbakefall og overlevelse.
Hvis du vil velge for mage kreftpasienter som kan ha nytte av kjemoterapi, er det viktig å forstå individuelle følsomhet før kjemoterapi [4]. Postoperativ adjuvant kjemoterapi av magekreft gir en mulighet til å teste pasient avledet svulster før de får kjemoterapi. I et forsøk på å identifisere potensielle biomarkører i denne innstillingen på proteinnivå, vi tidligere rapportert en cellelinje panel screening system som bruker kvantitativ protein expression profilering med omvendt fase Protein Arrays (RPPAs) [5], [6] kombinert med en celle- basert vekstanalyse system basert på konseptet av NCI-60-cellelinjen screening panel [7], [8]. Kandidat biomarkører ble isolert på grunnlag av korrelasjonskoeffisienter fra protein uttrykk og narkotika følsomhet matrise og så videre validert ved hjelp av kirurgisk-fjernet prøvene [9]. Basert på denne tilnærmingen vi identifisert to biomarkører på proteinnivå, herunder NF-kB og JNK, hvis nivåer hadde god korrelasjon med kjemoterapeutiske respons. Jo høyere ekspresjon av NF-kB så ut til å korrelere med en dårligere prognose, mens JNK vist en invers korrelasjon. Disse markørene ble også validert på molekylnivå ved hjelp av gastrointestinale kreftcellelinjer. Det er blitt vist at siRNA-mediert av p65 knockdown nesten utelukkende påvirker 5-FU følsomhet hos for tiden brukte kjemoterapeutiske medikamenter; men dette er ikke tilfelle for JNK knockdown [9]. Derfor konkluderte vi med at NF-kB spiller en dominerende rolle i 5-FU behandling og JNK kan være en indikator på kronisk betennelse i mage bakgrunn slimhinner [10]. I forlengelsen av dette valideringsstudie, søkte vi å utforske disse proteinene funksjonelt og avklare rollen til NF-kB som en stress-induserbare transkripsjonsfaktor under 5-FU behandling. Vi evaluerte også rollen som p53 etter 5-FU-mediert transaktivering av NF-kB [10], [11], fordi det er velkjent at p53 er aktivert som reaksjon på dette genotoksiske middel [12]. I denne studien rapporterer vi en potensiell rolle kompenserende av NF-kB for p53 ved analyse av en p53-NF-kB bindings polymorfe sete, kodon 72 av p53. Sammen utgjør disse funnene tyder på at NF-kB /p53-codon72 kan være en robust biomarkør for 5-FU følsomhet.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Nine menneskelig gastric kreft cellelinjer, inkludert Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY, og MKN45 ble hentet fra Riken Bioresource Senter Cell Bank. IWT-en var en
de novo
cellelinje som ble etablert i vårt laboratorium fra en japansk mannlig magekreft pasient som hadde tilbakefall peritonitt carcinomatosa. Bruken av IWT-en cellelinje har blitt godkjent av Iwate Medical University Institutional Review Board (H25-116, og HG H25-15) og familien til donor pasient som døde på tidspunktet for etablering av cellelinjen med en skriftlig informert samtykke med hensyn til å ta prøvene og gjør cellelinjen. Celler ble dyrket til 70-80% konfluens i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2.
Fremstilling av cellelvsat
Celler ble høstet ved sentrifugering og cellepelletene ble lysert ved bruk av rosa-buffer inneholdende 9 M urea (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 4% 3 – [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1 -propanesul-fonate (CHAPS, Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), 2% pH 8,0 til 10,5 pharma-Lyte (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan), og 65 mM DTT (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan) som tidligere beskrevet [5], [13].
Western blot
SDS-PAGE ble utført ved hjelp NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel elektroforese (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), XCell Sure Lock Mini-celle (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og Power PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). De oppløste proteinene i gelen ble overført til en nitrocellulosemembran ved hjelp av iBlot tørr Blotting System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De resulterende Membranene ble blokkert med 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i TBS (TBST) i 1 time. Membranene ble deretter inkubert med de indikerte primære antistoffer, inkludert pan-aktin, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, USA); p21, Tigar, og PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); og NF-kB, α-tubulin, og PCNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan). Deretter ble membranene vasket to ganger i 5 minutter med TBST, inkubert med et HRP-konjugert sekundært antistoff i 1 time, og deretter vasket to ganger i 5 minutter i TBST. Chemiluminescence gjenkjenning reagenser ble inkubert med membraner i 1-5 minutter og deretter bildene ble anskaffet ved hjelp av Image Quant LAS500 (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan). For å evaluere protein induksjon av 5-FU, ble vestlige blotter kvantifisert ved hjelp ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/).
Immunocytochemistry
Celler ble dyrket til 70-80 % konfluens i RPMI-1640 supplert med 10% FBS i fire-kammer polystyren fartøy vevskultur-behandlede objektglass, og deretter behandlet med 5-FU som er angitt i hvert forsøk. Etter at cellene ble utsatt for 50 uM av 5-FU i 4 timer for å se et tidlig transkripsjons-reaksjon, ble de fiksert i 4% paraformaldehyd, permeabilisert ved bruk av 0,2% Triton X-100 i PBS, og farget med DAPI (0,6 uM DAPI, 50 ul RNase, og PBS 5 ml) ved romtemperatur i 12 min. Cellene ble så inkubert med følgende primære antistoffer: anti-NF-kB P65, fosfo-NF-kB P65 (Ser536), og fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan), og p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, USA). Til slutt ble cellene inkubert med enten Alexa Fluor488- eller 568-konjugert sekundært antistoff (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan). En BX43 fluorescerende mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) ble brukt for bildeopptak.
genekspresjonsanalyse
MKN45 Cellene ble høstet etter behandling med eller uten 50 mikrometer av 5-FU i 4 timer . RNA ble deretter hentet fra høstet celler og genekspresjon profilering ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Jada Skriv ut G3 Menneskelig GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japan, Tokyo, Japan). Rådata ble først normalisert ved å dele hver sonde signal ved 75
persentil av hele signalet. Hver mikroarray eksperiment ble utført i duplikat som resulterer i to kontroll og to 5-FU behandling microarray datasett. For å identifisere gener som ble forskjellig uttrykt i respons til 5-FU, ble hver kontroll datasett sammenlignet separat til hver 5-FU behandling satt (4 sammenligninger). Differensielt uttrykte gener var de som hadde en endring i uttrykket 2 ganger i hver sammenligning. Vi identifiserte det siste settet av 10 differensielt uttrykte gener basert på deres frekvens i de 4 sammenligningene [14]. For å bekrefte reproduserbarheten av disse uttrykk endringer, kvantitativ sanntids RT-PCR av 5-FU-behandlede prøver ved 0, 4, 8, 12 og 24 timer ble utført for hvert gen. Primer sekvenser er oppført i tabell S1. For gener som induseres av 5-FU, ble analyse av promotorbindingssteder utført ved anvendelse av Jaspar algoritme (Jaspar, https://jaspar.genereg.net/). En 1000 bp promotor sekvens spesifikk for respektive genene ble hentet fra Transkripsjonell Regulatory Element Database (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Bindingssteder ble spådd ved å skanne promotersekvenser med konsensus sekvenser av NF-kB og p53 med 70% av profilen poengsum terskel.
RELA og TP53 Gene Knockdown
Celler ble dyrket til 70-80 % konfluens i RPMI-1640 supplert med 10% FBS i 6-brønners cellekulturplater og deretter behandlet med NF-kB p65 eller p53 siRNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan) i 48 timer. I korthet knockdown ble utført ved anvendelse Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, USA) ved en konsentrasjon på 3% i 10 minutter ved romtemperatur. Egnede konsentrasjoner av sirnas for hver cellelinje ble blandet med de Trans IT-TKO-løsninger, etterfulgt av en 20 minutters inkubering ved romtemperatur. SiRNA konsentrasjonene som ble anvendt var som følger: 100 nM p65 siRNA for MKN45, og MKN74 celler, og 150 nM for GSS og Kato-III celler; og 100 nM p53 siRNA for MKN45, og GSS-celler, og 50 nM for MKN74 celler. Etter 48 timer ble cellene høstet og proteinnivåer ble undersøkt ved Western blot. To siRNA konstrukter som innehar forskjellige sekvenser til det samme mål-genet ble brukt for hvert gen for å bekrefte knockdown spesifisitet. Cellesyklus distribusjon ble vurdert ved hjelp av Tali Bilde-baserte cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). For å vise den maksimale effekt av siRNA på 5-FU-respons, ble stoffet tilsatt 48 timer etter siRNA ble transfektert, og den respektive cellesyklusen ble målt etter 24 timers inkubering med 5-FU. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
TP53 Status og Codon72 Variant
DNA ble ekstrahert fra mage kreft cellelinjer ved hjelp QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japan, Tokyo, Japan). PCR forsterkning for
p53
exon4 codon72 variant (tabell S1) og
p53
exon5-9 mutasjonen ble utført som tidligere beskrevet [15], [16]. Hver PCR produktet ble sekvensert ved hjelp av ABI PRISM 3030xl genetisk analysator (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Sekvense Resultatene ble analysert ved hjelp av FinchTV (PerkinElmer Japan, Tokyo, Japan) og MEGA 5.1 Beta 3 [17].
Vekst Suppression analysen
Ti tusen celler per brønn ble sådd i en 96-brønn mikro. Tjuefire timer senere ble cellene behandlet med 5-FU i 24 timer. Etter 5-FU behandling, ble brøkdel av levende celler målt ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) og en TriStar LB 941 mikroplateleser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). Femti prosent veksthemming konsentrasjon (GI
50) ble beregnet ved bruk av Prism programvare (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). GI
50 verdier ble benyttet for å bestemme sammenhenger mellom 5-FU effekt og proteinnivåer basert på Pearsons produkt-moment korrelasjonskoeffisient (
r
).
Resultater
Fluorouracil Induserer NF-kB
for å bekrefte typisk NF-kB atferd i respons til 5-FU behandling, vi spores subcellulære lokalisering av NF-kB i MKN45 (p53 villtype), MKN74 (p53 mutant ), GSS (p53 mutant), og Kato-III (p53 homozygously slettet) cellelinjer. Western blot-analyse med nukleære og cytoplasmiske fraksjoner viste at 5-FU-indusert NF-kB i begge kamrene i MKN45 men ble ikke observert i p53-mutantcellelinjer (Fig. 1A-D). Vi undersøkte også effekten av 5-FU på NF-kB lokalisering i cellene ved immunocytokjemi (fig. 1E-H). NF-kB lokalisert til cytoplasmaet i ubehandlede MKN45, mens 5-FU-behandling førte til en økning i NF-kB nukleær lokalisering (Fig 1E.); Det ble imidlertid ikke observert økning i p53 mutantcellelinjer (Fig. 1 F-H). Vi observerte også en drastisk økning av fosforylert NF-kB (p65 Ser536) i kjernen av MKN45 behandlet med 5-FU, som indikerer NF-kB ble transactivated av 5-FU (fig. 1E). Konstituerende kjernefysiske lokalisering og sporadisk fosforylering av p53 ble observert i MKN74 men synes ikke å bli indusert av 5-FU (Fig. 1G). Nukleær lokalisering av p53 ble indusert ved 5-FU i GSS, men den aktiverte signalet var svak (fig. 1 H).
A-D, Western blot-analyse av induksjon av NF-kB i kjernen og den cytoplasma av 50 uM av 5-FU i 4 timer for å få de angitte cellelinjer. PCNA og α-tubulin ble anvendt som de nukleære og cytoplasmiske lasting kontroller, respektivt. E-H, Immunocytochemistry av p65 og p53 induksjon og lokalisering av 5-FU behandling av de angitte cellelinjer. p65 (rød), fosfor-p65 (Ser536, red), p53 (grønn), fosfo-p53 (Ser15, rød), og DAPI (blå) fargingen av kjernen uten (kontroll) og med 5-FU-behandling. I, Genekspresjon med kvantitativ sanntids RT-PCR i et tidsforløp av 5-FU-behandling. Tigar, PUMA, CDKN1A, og BTG2 ble identifisert som 5-FU induserte gener. De kvantitative verdiene var i forhold til p-aktin uttrykk.
p53 Målene er indusert ved 5-FU behandling
Siden NF-kB er en transkripsjonsfaktor (TF), dens kjernefysiske lokalisering på 5-FU behandling antyder sterkt trans. Vi identifiserte toppen 7 transkripsjoner blant over 60 000 som ble indusert etter 4 timer med 5-FU behandling i MKN45 bruker genuttrykk profilering (tabell 1). Interessant, fem av de 7 vitnemål, nemlig
BBC3 plakater (som koder for p53 oppregulert modulator av apoptose, PUMA),
BTG2, C12orf5 plakater (som koder sannsynlig fruktose-2,6-bisfosfatase Tigar),
CDKN1A, og GPR87
, er kjent p53 mål [18] – [22]. Tilstedeværelsen av promoter-bindingssetene ble forutsagt ved hjelp av skanning promotersekvenser med konsensussekvensene av NF-kB og p53 ved bruk av Jaspar algoritme (tabell 1) [23].
Vi fant at p53-nivåer ble indusert i kjernen lik de av NF-kB som respons på 5-FU-behandling (fig. 1E). Behandling av 5-FU også økte nivåene av p53 fosforylering ved Ser15, noe som antyder dets transaktivering (fig. 1E, ref. [24]). Faktisk er mesteparten av den totale p53 indusert av 5-FU syntes å være fosforylert. Vi har også observert en tidsavhengig induksjon av gener, inkludert
C12orf5 (Tigar)
,
BBC3 (PUMA)
,
CDKN1A (p21)
, og
BTG2
av 5-FU ved hjelp av RT-PCR (fig. 1I). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at den cellulære responsen til 5-FU behandling kan innebære både NF-kB og p53 for transkripsjonen aktivering i denne sammenheng, i MKN45.
RELA knockdown har en større effekt på p53 Target Proteiner enn TP53 Gene Knockdown
for å evaluere regulerende effekt av NF-kB og p53 i respons til 5-FU behandling, vi analyserte protein nivåer av p65, p53, samt kjente p53 mål, p21, Tigar, og PUMA, ved western blotting følgende
RELA Hotell og
TP53
knockdown i MKN45, MKN74, GSS, og Kato-III.
RELA
knockdown forårsaket en markert nedgang i p53 nivåer i alle cellelinjer. Som forventet, nivåene av p21, Tigar, og PUMA ble også redusert (fig. 2A). Omvendt, mens
TP53
knockdown redusert p53 nivåer, det gjorde ikke påvirke P65 nivåer. Som forventet ble nivåene av p53 target proteiner redusert med
TP53
knockdown; men denne reduksjonen var mindre enn den reduksjon som skyldes
RELA
knockdown (Fig. 2B). I det cellesyklusanalyse, den MKN74, GSS, og Kato-III-cellelinjer viste en svak økning i S eller G2 fasefraksjon, mens MKN45 utviste en økning i G1 fraksjonen etter 24 timers eksponering overfor 5-FU i p65 og p53 knockdown lik de tilsvarende krypterer (fig. 2C). Disse resultatene kan tyde på robustheten i mobilnettet stressresponsen maskiner som opprettholder cellesyklus distribusjon til tross for knockdown av p65 og p53.
A, Western blot analyse av
RELA
knockdown i fire magekreft cellelinjer. I tillegg til p53 og p65 proteiner, p53-mål, inkludert p21, tigar, og Puma, ble evaluert. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Resultater fra celler inkubert med RELA siRNA (siRNA) og uten mål siRNA (kontroll) er vist. B, Western blot analyse av
TP53
knockdown i tre mage kreft cellelinjer. p53 allel av Kato-III homozygously slettet så TP53 knockdown ikke ble utført. C, Legemiddelutløst cellesyklusanalyse. Den horisontale aksen, styrken av propidium jod (PI), og den vertikale aksen indikerer celle tall i hver cellelinje.
TP53 Codon72 Pro Variant viser lav 5-FU Sensitivity og High NF-kB nivåer
Gene knockdown eksperimentelle resultater indikerte at interaksjonen mellom NF-kB og p53-proteiner kan være viktig i forbindelse med 5-FU-behandling. For å undersøke muligheten for at
TP53
codon72 variant kan påvirke cellulære responser til 5-FU behandling, vi sekvensert
TP53
codon72 samt mutasjoner i DNA-bindende domene kodende regioner (dvs. eksoner 5-8) av 9 gastrisk cancer-cellelinjer (tabell 2). Statusen for codon72 variasjon og
TP53
mutasjon ikke demonstrere klare assosiasjoner.
Vi neste undersøkt sammenhengen mellom 5-FU følsomhet og
TP53
status ( fig. 3A), så vel som de endogene nivåene av NF-kB og p53 (fig. 3B). GSS, GCIY, og MKN45 linjer, som besitter Pro homozygot variant, viste lav følsomhet for 5-FU, mens KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, og IWT1 linjer innehar Arg allel viste relativt høy følsomhet. Kato-III, som har en stor
TP53
sletting [25], var det mest følsomme for 5-FU. NF-kB protein nivåer ble spesielt korrelert med 5-FU følsomhet (
r
= 0,68;
p
= 0.04 Fig. 3C); Det var imidlertid ingen klar sammenheng mellom p53 nivåer og 5-FU-følsomhet (
r
= -0,04;
p
= 0,95, Fig. 3D). Disse resultatene tyder på at Pro homozygositet er forbundet med 5-FU motstand, mens hverken p53-mutasjon eller endogent p53-nivåer påvirker 5-FU følsomhet direkte.
A, Growth undertrykkelse assay in 5-FU behandling i magekreft celle linjer. Horisontal akse viser GI
50 Verdien av 5-FU. B, endogent protein nivåer av NF-kB, p53, og aktin ved Western blot i mage kreft cellelinjer. Aktin anvendes som en lastekontroll. C, Scattergram av fordelingen av proteinnivåer av NF-kB i forhold til aktin og GI
50 av 5-FU i hver cellelinje. D, Scattergram av fordelingen av p53-proteinnivåer og GI
50 av 5-FU i hver cellelinje. Pearsons produkt-moment korrelasjonskoeffisient (
r
) samt
p
verdien vises i hver scattergram.
Diskusjoner
har tidligere identifisert NF-kB som en potensiell prediksjon markør for postoperativ 5-FU-baserte kjemosensitivitet for avansert magekreft [9]. NF-kB er en induserbar transkripsjonsfaktor består av p65 (RELA), c-Rel, Rel-B, P50 /NF-κB1, og P52 /NF-κB2 [26], og spiller en sentral rolle i immunresponser og inflammatoriske cytokin regulering [27] – [29]. Chang et al tidligere vist at NF-kB indusert opp eller ned regulering av differensielt uttrykte gener i 5-FU-indusert intestinal mukositt ved induserende proinflammatoriske cytokiner, slik som IL-6, TNF-α, og IL-1β [10]. Disse 5-FU-indusert inflammatorisk respons har vært ansett for å være en del av stress å unngå prosesser som kan føre til desensibilisering av 5-FU effekt på mageslimhinnen [30]. Selv om det har blitt foreslått at aktiveringen av NF-kB ikke er direkte forbundet med tumorutvikling og progresjon [31], og NF-kB vært ansett for å være en stor biomarkør og terapeutisk mål [32]. Den direkte bevis for redusert chemoresistance til 5-FU ved siRNA for
RELA
sammen med den høye diskriminerende effekt av NF-kB nukleær farging i terapeutiske resultater av kirurgisk fjernet vev bedt oss om å utføre ytterligere validering av NF-kB fra et biologisk synspunkt.
Våre transkripsjons profilering resultatene viste at flere p53 nedstrømsgener var oppregulert i respons til 5-FU, hvor trans av NF-kB også forekommet. Disse to store transkripsjonsfaktorer har tidligere blitt vist å være co-reguleres i respons til genotoksiske midler [33] – [35] og TNF-α [36], [37]. I tillegg har det blitt foreslått at samtidig aktivering av p53 og NF-kB i tumorer behandlet med genotoksiske midler kan føre til terapeutisk svikt på grunn av NF-kB-mediert signalisering overlevelse [38].
Individuell knockdown av disse transkripsjonsfaktorene åpenbart gener nedstrøms av p53 ble påvirket av p65 knockdown, mens effekten var begrenset av p53 knockdown. Tidligere rapporter har antydet et samarbeidsforhold mellom p53 og NF-kB i sammenheng med autofagi, apoptose, og S-fase sjekkpunkt aktivering [34], [39] – [41]. Våre resultater viste også at NF-kB kan kompensere for den transkripsjonelle aktivitet av p53 når det intakte funksjonen går tapt som respons på 5-FU-behandling. Faktisk, et flertall av mage kreft bærer mutasjoner i p53-DNA-bindende domene, og gjør således det transkripsjonelt inaktiv [42]. En fersk undersøkelse utført av Frank
et al
. rapporterte at codon72 polymorfi av
TP53
vesentlig påvirker evnen av p53 til å samvirke med NF-kB-genet for transaktivering, særlig i induksjon av apoptose via caspase 4/11 [40]. Sammen med den foreliggende funn at noen transkripsjonen aktivitet av p53 krever NF-kB som respons på 5-FU, p53 kodon 72 polymorfisme for sin NF-kB binding kan være større innflytelse enn mutasjonsstatus av
TP53
eller proteinekspresjon status av p53
virkningen av codon72 polymorfisme på spontan kreftrisiko har tidligere blitt undersøkt, men ikke endelig etablert på grunn av begrensede menneskelige befolkning og dyremodeller [40], [43] -. [45]. Imidlertid kan codon72 polymorfisme spille en rolle i å opprettholde etablerte kreftceller enn å utløse celle malign transformasjon. Faktisk har tidligere studier har rapportert at den Pro /Pro allelet er forbundet med resistens mot kjemoterapi og dårlig prognose i munnhulen [46] samt kolorektal [47], bryst [48] og gastrisk [49] kreft og neuroblastomer [ ,,,0],43]. En serie
in vitro
studier støtter hypotesen om også dette viser at det Arg allelet er en mer potent induser apoptose enn Pro-allelet [40], [50], [51]. Apoptose er en av de viktigste mekanismer som induseres av 5-FU, og det er således rimelig å hypoteser om at effekten av 5-FU-kjemoterapi er assosiert med spesifikke polymorfismer p53 [49]. Vår
in vitro
funn støtter disse epidemiologiske og eksperimentelle data og foreslå en mulig mekanisme for 5-FU-mediert p53-NF-kB samhandling på p53-codon72 bindingssetet.
Som forventet , vår studie viste at cellelinjer med Pro-allelet var mer resistente mot 5-FU enn de med Arg-allelen. Veksten undertrykkelse profilen til 9 mage kreft cellelinjer viste god korrelasjon til NF-kB protein nivåer. Disse resultater antyder at Arg /Arg genotype har en sterkere induksjon av apoptose enn Pro /Pro genotype i nærvær av 5-FU. Blant de cellelinjer (alle avledet fra japansk magekreftpasienter), forholdet mellom Arg /Arg Arg /Pro: Pro /Pro var 04:01:03, mens det hos friske japanske pasienter var 4.5:4.4:1 [52] . Dette kan reflektere en utvelgelsesprosess som finner sted i løpet av tumorutvikling og etablering som en cellelinje. Forrige meta-analyser i kreftrisiko og p53-codon72 polymorfismer tyder på at Pro /Pro genotypen har en høyere kreftrisiko (lavere for Arg /Arg genotype) i asiatiske populasjoner [45], [53]. Det gjenstår imidlertid betydningen av «kreftrisiko» for kreft eller behandlingsrespons ikke klarlagt, fordi det er generelt vanskelig å gjennomføre en klinisk studie dominert av genetisk polymorfisme og vurdere den sanne genetiske effekter av behandlingen. Hittil har de fleste rapporter som beskriver en sammenheng mellom p53 codon72 polymorfisme og kjemo-terapeutiske respons viste at Arg /Arg genotype har en positiv respons i et bredt spekter av cancere som ble behandlet med konvensjonell genotoksiske legemidler [49], [54], [55] . Vi foreslår en antatt mekanisme for respons på 5-FU via NF-kB og p53-protein-binding forbundet med p53-polymorfisme, og således en combi diagnose av NF-kB proteinekspresjon og codon72 kan være en nyttig indikator for postoperativ adjuvant kjemoterapi. Bortsett fra noen få store datasett [52], [56], omfanget av demografiske og etniske fordelinger av polymorfisme er fortsatt uklart. Akkumulere data på etniske forskjeller for polymorfisme kan forklare forskjellene i kreftrisiko eller kjemoterapeutiske svarprosenten i pasientpopulasjonen.
I sammendraget, våre funn tyder på at NF-kB regulerer p53 transkripsjonen aktivitet i respons til 5-FU, som kan være forbundet med et polymorft område av p53 ved codon72. Ytterligere kliniske og epidemiologiske studier bør vurdere nytten av samtidig patologisk /genetisk evaluering av NF-kB /p53-codon72 i kirurgisk fjernet magekreft prøver for å forutsi effekten av postoperativ 5-FU-baserte adjuvant kjemoterapi.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Primer Sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090155.s001 plakater (docx)
