Abstract
Rho GTPases er viktige regulatorer av tumorcelle invasjon og derfor utgjør attraktive mål for utformingen av anticancermidler. Flere strategier har blitt utviklet for å modulere deres økte aktiviteter i løpet kreft progresjon. Interessant nok, ingen av disse metodene tok hensyn til eksistensen av den kjente antagonistiske forholdet mellom RhoA og Rac1. I denne studien, må vi først sammenlignet invasivitet av en samling av kolorektal kreft cellelinjer med sine RhoA, Rac1 og Cdc42 aktiviteter. En markert reduksjon av aktiv og Cdc42 Rac1 korrelert med høye invasiv potensialet av cellelinjene etablert fra metastatiske steder av kolorektal adenokarsinom (LoVo, SKCo1, SW620 og CoLo205). Omvendt, ble ingen sammenheng mellom RhoA aktivitet og invasivitet detektert, mens aktiviteten av dens kinase effektor ROCK var høyere i kreftcellelinjer med en mer invasive fenotype. I tillegg ble invasivitet i disse tykktarmskreftcellelinjer korrelert med en typisk rund og blebbing morfologi. Vi testet om behandling med PDGF å gjenopprette Cdc42 og Rac1 aktiviteter og /eller med Y27632, en kjemisk hemmer av ROCK, kan redusere invasivitet av SW620 celler. Foreningen av begge behandlingene vesentlig redusert invasiv potensialet av SW620-celler, og denne effekten ble fulgt av tap av membran blebbing, restaurering av en mer langstrakt cellemorfologi og reetablering av E-cadherin-avhengige adherens veikryss. Denne studien åpner veien til utvikling av terapeutiske strategier der ulike Rho GTPase modulatorer kombineres for å modulere krysstale mellom Rho GTPases og deres konkrete innspill i metastatisk progresjon
Citation. De Toledo M, Anguille C Roger L, Roux P, Gadea G (2012) Cooperative Anti-invasiv Effekt av Cdc42 /Rac1 Aktivering og ROCK Hemming i SW620 Colorectal Cancer Celler med Forhøyet blebbing aktivitet. PLoS ONE 7 (11): e48344. doi: 10,1371 /journal.pone.0048344
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: May 23, 2012; Godkjent: 24 september 2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 de Toledo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Ligue Nationale contre le Cancer (équipe labellisée), Association pour la recherche contre le Cancer (contrat 17029), Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE, og Le Centre national de la recherche scientifique. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Rho GTPases er viktig for mange cellefunksjoner, inkludert membrantrafikk, transkripsjonen aktivering, apoptose, cellesyklusprogresjon, celle polaritet, adhesjon og migrasjon [1], [2], [3], [4]. Faktisk deres deregulering har viktige konsekvenser i mange physio-patologiske prosesser [5]. Spesielt Rho GTPases er avgjørende regulatorer av kreft progresjon gjennom modulering av celleproliferasjon, apoptose, invasjon og metastasedannelse [6].
Rollen tre Rho GTPases i bi-dimensjonale migrasjon har blitt godt karakterisert. Rac1 driver motilitet ved å fremme lamellipodium dannelse og celle utstikkere [7]. RhoA signale aktiverer ROCK familien av kinaser, fremme dannelsen av aktin spennings fibre og generering av actomyosin sammentrekningskraften som er nødvendig for tilbaketrekning av cellen bak i mesenchymale-type bevegelse [8], [9]. Cdc42 blir aktivert ved den fremre kant av lamellipodia og er nødvendig for Arp2 /3-avhengige aktin sammenstillingen [10]. Videre, eksistensen av en antagonistisk forhold mellom Rac1 og RhoA forklarer polarisert bevegelse under rettet celle migrasjon. Interessant nok har disse to proteinene undertrykke hverandre aktiviteter og fenotyper [11], [12], [13]. Spesielt er RhoA og Rac1 aktiviteter romlig og tidsmessig kontrollert for å fremme dynamiske cytoskeletal endringer under migrasjon. Rac1 aktivitet er begrenset til den fremre kant for å strekke seg fremspring på forsiden, mens RhoA driver sammentrekning på baksiden av den migrerende cellen. RhoA og Rac1 lokaliserte effekter er antagelig drevet av spesifikke reguleringsmekanismer. Faktisk Wilden og kolleger vist at Rac1-avhengig nedregulering av RhoA aktivitet blir kontrollert av adherens knutepunkt integritet [14].
imidlertid mekanismer som formidler tumorcelle motilitet er forskjellige i mer komplekse tredimensjonale matriser . I denne sammenheng noen tumorceller innta en amoeboid form for bevegelse [15], [16] som er karakterisert ved en avrundet, blebbing cellemorfologi, uavhengighet fra ekstracellulære proteaser og kravet om høye nivåer av actomyosin kontraktilitet nedstrøms av RhoA-ROCK pathway for å deformere den ekstracellulære matriks og drivcelle bevegelse [17], [18], [19], [20]. Studier ved hjelp av intravital mikroskopi har vist at amoeboid bevegelse av tumorceller kan være meget hurtig in vivo (~ 5 um /min [21]). Omvendt er mesenchymale-type bevegelse, karakterisert ved en langstrakt morfologi, som følge av Rac1 avhengig Actin montering ved den fremre kant. Disse to former for bevegelse er inter-konvertible og tumorceller kan gjennomgå amoeboid-mesenchymale og mesenkymale-amoeboid overganger [15], [18], [20] som synes å være styrt av en antagonisme mellom Rac1 og RhoA signalveier. Oppdagelsen av ROCK-regulert Rac1 GTPase-aktiverende proteiner (hull) hjalp forstå hvordan RhoA /ROCK sti kan undertrykke Rac1-mediert Actin polymerisasjon [14], [22], [23]. I alle fall kan dette plastisitet tillate cellene å tilpasse sin modus for migrasjon til de forskjellige miljøer, og derfor kan det være fordelaktig å tumorceller.
I tillegg til tett rom-tid-regulering av de forskjellige Rho GTPases, også den aktivitet av sine oppstrøms og nedstrøms partnere er strengt kontrollert. Faktisk kan Rho GTPase effekter på celle atferd moduleres også via spesifikke interaksjoner med regulatorer (f.eks, guanin nukleotid utvekslings faktorer, GEFs) for å regulere tilsynelatende uforenlige prosesser. For eksempel, DOCK10, en Cdc42 GEF, er en sentral aktør i amoeboid migrasjon gjennom en DOCK10-Cdc42-Pak2 signalveien. Følgelig ekspresjon av aktivert Cdc42 induserer en mesenchymale-amoeboid overgang. Imidlertid hemming av Cdc42 resulterer i tap av mesenchymale morfologi, noe som tyder på at Cdc42 spiller en rolle også i mesenchymale-type morfologi via forskjellige reaksjonsveier som kan implisere andre GEFs [24]. I tillegg, i to-dimensjonale kulturmodeller er RhoA aktivert, ikke bare på den kontraktile halen, men også ved den fremre kant. Faktisk er fortsatt RhoA aktiviteten høy på membran volanger i gryende lamellipodia [25]. Disse observasjonene tyder på at RhoA er innblandet i reguleringen av Rac1 avhengige membran ruffling. Faktisk, samarbeider RhoA med Rac1 å indusere membran ruffles via rekruttering av dens spesifikke effektor mDia. Samlet utgjør disse data klart indikerer at krysstale mellom disse Rho GTPases utelukker hypotesen om at hver av dem er ansvarlig for bare en modus for migrasjon.
Rho GTPases regulere også Actin cytoskeletal organisasjon og celle adhesjon. E-cadherin, en enkelt-span trans-membranglykoprotein, etablerer homofilist interaksjoner med tilstøtende E-cadherin molekyler som er uttrykt av nabocellene, for derved å danne kjernen av de epiteliale adherens knutepunktene [26], [27]. Gjennom sine cytoplasmaområde, E-cadherin kollegaer med en rekke proteiner, inkludert tre Catenins (alfa, beta, og P120), som kan kobles E-cadherin til aktin cytoskjelettet. E-cadherin-catenin kompleks og den underliggende Actin cytoskjelettet gjennomgå en rekke omorganiseringer som er kontrollert av Rho GTPases Rac1 og RhoA og at resultatet i ekspansjon og gjennomføring av celle-celle adhesjon. I lys av sin rolle i å opprettholde adherens veikryss og den smale kobling med Rho GTPases, kan E-cadherin tap fremme metastase ved at det første trinnet av metastatisk cascade: tap av celle-celle kontakter. Faktisk, redusert E-cadherin uttrykk har vært forbundet med svulst invasivitet, metastatisk spredning og dårlig klinisk prognose [28], [29], [30].
Derfor Rho GTPases synes å være attraktivt mål for kreftbehandling . Flere strategier er blitt utviklet for å motvirke Rho GTPase aliserte deregulering under tumorgenese, slik som direkte målrettingen av Rho GTPase-aktivitet [31], [32], eller inhibering av nedstrøms effektorer, som ROCK, med lovende resultater i forebygging av invasivitet
in vivo product: [33]. En alternativ strategi består i målretting regulatorer av Rho GTPase aktiv tilstand, for eksempel GEFs, hull og guanin nukleotid dissosiasjon hemmere (GDIs) [32] [34]. Selv Rho GTPase hemmere har ennå ikke vært i omfattende bruk for klinisk bruk, deres potensielle verdi som kreft narkotika fortsatt driver betydelig farmasøytisk forskning og utvikling [35]. Men krysstale mellom Rho GTPases og funksjonell dualitet, som er en viktig funksjon i sin regulering, har aldri vært behandlet av disse målrettingsstrategiene.
I denne studien, må vi først sammenlignet invasivitet av en samling av kolorektal kreft cellelinjer med sine RhoA, Rac1 og Cdc42 aktiviteter. Vi rapporterer at den høye invasiv potensialet for kolorektal kreft celler med forhøyet blebbing aktivitet korrelerer med både økt ROCK aktivering og redusert Cdc42 og Rac1 aktiviteter. Kombinert behandling med PDGF å gjenopprette Cdc42 og Rac1 funksjon og med Y27632 å hemme ROCK synergistisk redusert invasiv potensialet i slike kolorektal kreftceller. Dette gir ny innsikt for utvikling av kreftlegemidler som kan kombinere samtidig hemmer utskillelsen av ROCK og re-aktivering av Cdc42 og Rac1 til å handle på både spesifikke og vanlige veier.
Resultater
Nivået aktiv Cdc42 og Rac1, men ikke fra RhoA, er redusert i svært invasive kolorektal cellelinjer
Overgang til en svært bevegelige fenotype er karakteristisk for invasive kreftceller og en indikasjon på at en svulst kan metastasere. For å klassifisere invasive potensiale, sammenlignet vi muligheten for en samling av kolorektale cancercellelinjer for å invadere Matrigel, et tri-dimensjonal matrise som ligner på basalmembran og etterligner den komplekse ekstracellulære miljø som finnes i mange vev. Vi vurderte dermed invasivitet av to normale kolon cellelinjer (FHC og con), i HCT-116 tykktarmskreft cellelinje, av CaCO2, LS174T, SW480, HT29 og WiDr cellelinjer som ble avledet fra kolorektal adenokarsinomer og fire celle linjer (LoVo, SKCo1, SW620 og CoLo205) etablert fra metastaser av tykk- adenokarsinom. De fire cellelinjer som er utstedt fra metastaser utstilt høyeste evne til å invadere Matrigel, noe som indikerer at disse cellene har beholdt sin evne til å invadere selv etter at de nådde sine sekundære området (Figur 1a).
(a) Resultatene av Matrigel invasjon assay for de forskjellige tarmkreftcellelinjer. Celler som hadde invadert gjennom Matrigel ble detektert på den nedre side av filteret ved fluorescens og telles som beskrevet i Materialer og Metoder. Verdiene er gjennomsnitt +/- SD (feilfelt) av minst tre uavhengige eksperimenter. (B) Celler ble lysert og nivået av GTP-bundet Cdc42 ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Cdc42-GTP utfelt med GST-PAK1 og total Cdc42 i lysatene ble påvist ved immunblotting med et anti-Cdc42-antistoff. Verdier er de midlere +/- SD (feilfelt) av minst tre uavhengige eksperimenter. (C) Cellene ble lysert, og nivået av GTP-bundet Rac1 ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Rac1-GTP utfelt med GST-PAK1 og total Rac1 i lysatene ble påvist ved immunblotting med et anti-Rac1 antistoff. Verdier er de midlere +/- SD (feilfelt) av minst tre uavhengige eksperimenter. (D) Cellene ble lysert, og nivået av GTP-bundet RhoA ble målt som beskrevet i materialer og metoder. RhoA-GTP utfelt med GST-RBD og total RhoA i lysatene ble bestemt ved immunblotting med et anti-RhoA antistoff. Verdier er gjennomsnitt +/- SD (feilfelt) på minst tre uavhengige eksperimenter.
Vi deretter vurdert om invasivitet og nivået av aktive Rho GTPases, som er viktige komponenter i invasiv maskiner, ble korrelert ved å sammenligne nivået av GTP-bundet Cdc42, Rac1 og RhoA i de ulike kolorektal kreft cellelinjer. En markert nedgang i aktiv Cdc42 og Rac1 ble observert i de mest invasive kolorektal kreft cellelinjer (Figur 1b og 1c). Omvendt, nivået av GTP-bundet RhoA ble ikke korrelert med celle invasivitet. Spesielt ble en sterk RhoA aktivitet observert i HCT-116-celler, som ble karakterisert med lav evne til å invadere Matrigel (figur 1d). Variasjonene i nivået av aktive GTPases i de forskjellige cellelinjer var ikke på grunn av en forskjell i deres proteinekspresjon så dette var nesten tilsvarende i alle cellelinjer (ikke vist). Vi konkluderer med at i de testede kolorektal kreft cellelinjer, nivået av aktiv Cdc42 og Rac1, men ikke fra RhoA, er omvendt korrelert med invasivitet av slike celler (respektive
p-verdiene
: 0,0008, 0,0003 og 0,134 ).
Cofilin fosforylering øker med invasivitet av de ulike kolorektal kreft cellelinjer
Oppdagelsen av at RhoA aktiviteten ikke var i slekt med invasivitet av de ulike tykktarmskreft cellelinjer ikke er i overensstemmelse med den hyppige involvering av RhoA reaksjonsveien i tumor celle invasjon, særlig gjennom aktivering av dets effektor kinase ROCK. Vi testet derfor hypotesen om at, i disse cellelinjene, kan nivået av ROCK aktivering ikke speile nivået av GTP-bundet RhoA. For å oppnå dette målet, evaluerte vi ROCK-aktivering i den undersøkte kolorektal kreft-cellelinjer ved å kvantifisere fosforyleringen status for ROCK substratet Cofilin, som kontrollerer dannelsen av orienterte actomyosin II bunter i cellekroppen [36]. Fosforylert Cofilin ble påvist ved immunblotting med spesifikke anti-fosforylerte Cofilin antistoffer og dens ekspresjon ble normalisert til den av total Cofilin (figur 2a). Cofilin var svakt fosforylert i normal colon-cellelinjen CoN, så vel som i de dårlig invasive HCT-116 og SW480-cellelinjer i forhold til de høyest invasive cellelinjer LoVo, SW620, CoLo205 og SKCo-1, fosforylert Cofilin var meget rikelig. Disse resultatene tyder på at nivået av aktiv ROCK, men ikke av aktiv RhoA, er assosiert med kreft i tykktarmen celle invasivitet.
Cellene ble lysert, og mengden av fosforylert Cofilin og av total Cofilin tilstede i lysatene ble analysert ved hjelp immunoblotting. (A) representant immunoblot. (B) Kvantifisering av Cofilin fosforylering. Histogrammer representerer prosenter av fosfor-Cofilin signal over den totale Cofilin signal. Verdier er gjennomsnitt +/- SD (feilfelt) av tre uavhengige forsøk.
Kombinert restaurering av Cdc42 og Rac1 aktiviteter og hemming av ROCK nedgang celle blebbing og indusere celle tøyelighet
ROCK avhengig actomyosin kontraktilitet er avgjørende for celle morfologi. Høy ROCK aktivitet kan også fremkalle dynamisk membran blebbing. For å sjekke om ROCK aktivering i de ulike kolorektal cellelinjer ble korrelert med celle morfologi, overvåket vi celler ved hjelp av differensial interferens kontrast time-lapse mikroskopi. Mens HCT-116 og SW480 celler beholdt noen epitelceller funksjoner (langstrakt form, celle-celle kontakter), SW620 celler var sfærisk og utstilt intens perifer blebbing aktivitet (figur 3a, øvre paneler: stillbilder fra videoer S1, S2, S3, S4, S5 og S6), i overensstemmelse med forhøyet actomyosin sammentrekningsevne på grunn av deres mye høyere ROCK aktivitet i forhold til de andre to cellelinjer (se figur 2b). For å teste om den observerte nedgangen i Cdc42 og Rac1 og økning i ROCK aktivitet ble begge involvert i tumorprogresjon til mer avanserte stadier, behandlet vi disse tre tykktarmskreft cellelinjer med PDGF å re-aktivere Cdc42 og Rac1 og /eller med Y27632 til blokk STEIN. Kombinert PDGF og Y27632 behandling resulterte i kjøp av en mer epitelial fenotype med langstrakte celler, særlig i SW620 cellelinjen (figur 3a, lavere paneler). Faktisk disse cellene, som var rund og med forhøyet membran blebbing ved begynnelsen av den kombinerte behandling, stoppet blebbing og flatet ut (figur 3b og video S7). Kvantifisering av antall langstrakte celler etter de forskjellige behandlinger tydelig vist at den kombinerte restaurering av Cdc42 og Rac1 aktivitet og inhibering av ROCK hadde en additiv effekt (figur 3c). For å overvåke PDGF-avhengig aktivering av Cdc42 og Rac1 i de tre cellelinjene, målte vi nivået av GTP-bundet Cdc42 og Rac1 (figur 3d og e). PDGF ikke sterkt påvirke mengden av GTP-bundet Cdc42 og Rac1 i HCT-116 og SW480 celler, mens det klart økt den i SW620 celler. I tillegg har vi også sjekket Y27632 effekt på myosinlettkjedefosfatase 2 (MLC2) fosforylering, som en avlesning av ROCK-avhengige kontraktilitet og fant at fosforylert MLC2 ble redusert i Y27632 behandlet SW620 celler (Figur 3f). Tatt sammen disse dataene tyder på at kombinert behandling med PDGF og Y27632 å gjenopprette Cdc42 og Rac1 aktivitet og hemme ROCK kan konvertere invasive, blebbing SW620 celler til en mer epitelial fenotype.
(a) Still DIC tid-lapse bilder av celler behandlet eller ikke (kontroll) med PDGF og Y27632 (fra videoer S1, S2, S3, S4, S5, og S6). Rammer vise endring i morfologi (fra rund til en mer langstrakt form) av cellene på begynnelsen av filmene. Skala barer, 10 mikrometer. (B) DIC tid-lapse bilder av SW620 celler før og etter behandling med PDGF + Y27632 (fra video S7). Rammer vise endring i cellemorfologi ved de angitte tider. Skala barer, 10 mikrometer. (B) Kvantifisering av celleforlengelse. En celle ble ansett langstrakt når sin lengste dimensjon var to ganger den korteste, og da det viste i det minste ett fremspring [23]. Histogrammer representerer prosentandelen av langstrakte SW620 celler etter behandling eller ikke (kontroll) med PDGF og /eller Y27632 i 24 timer. Verdier er gjennomsnitt +/- SD (feilfelt) av tre uavhengige eksperimenter og den statistiske signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. (D) Cdc42-aktivitet ble bestemt etter behandling eller ikke (kontroll) med PDGF i 24 timer som beskrevet i Materialer og Metoder. Verdier er gjennomsnitt +/- SD (feilfelt) av fire uavhengige eksperimenter og den statistiske signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. * P 0,05. (E) Rac1 aktivitet ble bestemt etter behandling eller ikke (kontroll) med PDGF i 24 timer som beskrevet i Materialer og Metoder. Verdier er gjennomsnitt +/- SD (feilfelt) av fire uavhengige eksperimenter og den statistiske signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. * P 0,05. (F) SW620 celler ble lysert, og mengden av fosforylert myosinlettkjedefosfatase 2 (MLC2) og av den totale MLC2 tilstede i lysatene ble bestemt ved immunoblotting ved forskjellige tidspunkter (0 til 30 minutter) etter behandling med 10 uM Y27632. Vist er en representant immunoblot.
Kombinert restaurering av Cdc42 og Rac1 aktivitet og hemming av ROCK re-lokalisere E-cadherin til celle veikryss
Ved kombinert behandling med PDGF og Y27632, SW620 celler syntes å ha gjenopprettet adherens veikryss (figur 3a). For å klargjøre dette punkt, vurderte vi ekspresjon av E-cadherin ved immunofarging i kontroll og behandlede celler (figur 4A). Mens nesten ingen endringer i E-cadherin uttrykk ble observert i HCT-116 og SW480 celler, den sterke E-cadherin farging i SW620 celler klart indikerte at celle-celle kontakter ble reetablert etter behandling med PDGF og Y27632. Kvantifisering av adherens knutepunkter i SW620 celler bekreftet den synergistiske virkning av PDGF og Y27632.
(a) Representative E-cadherin farging i tykktarmskreftceller behandlet eller ikke (kontroll) med PDGF og Y27632 i 24 timer. Skala barer, 10 mikrometer. (B) Kvantifisering av E-cadherin veikryss. Vi merket som positivt hver celle som viser minst en E-cadherin krysset med en eller flere naboceller. Histogrammer representerer prosentandelen av SW620 kolon kreftceller med E-cadherin Forbindelsesstykke etter behandling eller ikke med PDGF og /eller Y27632 i 24 timer. Verdier er gjennomsnitt +/- SD (feilfelt) av tre uavhengige eksperimenter og den statistiske signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
Kombinert restaurering av Cdc42 og Rac1 aktivitet og hemming av ROCK forringe SW620 invasive egenskaper
Som kombinert PDGF og Y27632 behandling førte til re-etablering av adherens knutepunkter i den invasive SW620 cellelinje, vi deretter testet direkte effekten av PDGF og Y27632 behandling på invasivitet av disse celler i matrigel invasjons analyser. Igjen, foreningen av PDGF og Y27632 var mer effektiv enn de enkelte behandlinger i hemme invasive egenskapene til SW620 celler (figur 5). PDGF og Y27632 hadde nesten ingen effekt på HCT-116 og SW480 invasivitet (data ikke vist). Til sammen våre data tyder på at invasiv oppførselen til metastatisk tykktarmskreft cellelinje SW620 kan bli dramatisk svekket av den kombinerte bruk av PDGF og Y27632 som fører til amoeboid til epitel overgang og re-etablering av E-cadherin avhengig adherens veikryss.
invasivitet av SW620 kolon kreftceller etter behandling eller ikke (kontroll) med PDGF og /eller Y27632 ble kvantifisert ved hjelp av Matrigel invasjons assays som beskrevet i Materialer og Metoder. Verdier er de midlere +/- SD (feilfelt) av minst tre uavhengige eksperimenter og den statistiske signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001, ns ikke-signifikant
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi den mulige sammenhengen mellom invasivitet og aktivitetsnivå av de viktigste Rho GTPases i en samling av kolorektal kreft cellelinjer. Vi viser at evnen til å invadere av disse kolorektale cancercellelinjer er korrelert med en markert nedgang i Cdc42 og Rac1 aktivitet og en økning i ROCK, men ikke RhoA, aktivitet. Ettersom dette molekylære fenotype var forbundet med en runde, blebbing cellemorfologi da spurte vi om normal epitel morfologi kan gjenopprettes ved å hemme ROCK med Y27632 og reaktive Cdc42 og Rac1 med PDGF. Faktisk, i invasiv SW620 cellelinje, den kombinerte behandlingen med PDGF og Y27632 arrestert blebbing og celler kjøpt en flat og mer spredt morfologi. Under disse betingelsene adherens knutepunkter ble også gjenopprettet som angitt ved re-utseendet av E-cadherin ekspresjon ved celle-celle-kontakter. Dette morfologiske konvertering var assosiert med en sterk reduksjon i deres evne til å invadere gjennom Matrigel. Det er høyst tenkelig at disse funksjonene (celle-celle kontakter /morfologi og invasjons) er direkte knyttet.
Våre data tyder på at en sterk nedgang i Cdc42 og Rac1 aktivitet er klart assosiert med økt tykktarmskreft invasivitet. Disse funn underbygge de som ble oppnådd i andre epiteliale cellelinjer. I Madin Darby kaninnyre (MDCK) epitelceller, og aktivering av Cdc42 og Rac1 vært implisert i dannelsen av adherens knutepunkter [37]. Videre kan konstitutivt aktiverte former av Cdc42 og Rac1 forhindre hepatocytt vekstfaktor (HGF) -indusert celle spredning ved å øke E-cadherin-mediert celle-celle adhesjon [37]. Våre resultater utvide disse observasjonene til menneskelige kolon carcinoma celler. Spesielt ved restaurering av nivåene av GTP-bundet Cdc42 og Rac1 av PDGF behandling, SW620 celle blebbing aktivitet ble sterkt avskaffet og celler spredt med dannelse av filopodia og lameller. I tillegg kunne vi bekrefte at uttrykket av konstitutivt aktiv Cdc42 eller Rac1 hemmer SW620 invasive egenskaper (data ikke vist). Videre PDGF også favoriserte E-cadherin- avhengig reetablering av adherens veikryss. Andre studier har vist at aktivering av Rac1 resulterer i E-cadherin-mediert celle-celle-adhesjon og, senere, inhibering av migrering og invasjon av epitelceller [38] [39] [40] [41]. Tvert imot, i leversvulster, er PDGF involvert i opprettholdelsen av EMT [42]. Videre kan Cdc42 og Rac1 også spille en viktig rolle i celle migrasjon og invasjon gjennom dannelsen av filopodia og lamellipodia. Derved kontroll av celle-celle-kontakt for å opprettholde celler som en sammenhengende epitel og regulering av cellemigrering til favoriserer invasjon kan anses som to antagonistiske effekter av Cdc42 og Rac1 på tumorprogresjon. I vår studie, PDGF behandling gjen E-cadherin-avhengige celle-celle-kontakter, men det var ikke tilstrekkelig til å forhindre invasjon når de brukes alene. Faktisk, PDGF er nødvendig for å kombineres med ROCK inhibering for å vise en sterk, additiv effekt på invasivitet. Våre resultater indikerer således at hver bane viser uavhengige funksjoner og at hemming av invasjonen kan tenkes gjennom effektiv manipulering av både veier. Imidlertid er disse funnene forbundet med amoeboid modus for vandring av SW620 cellelinje anvendt i denne studien. Som kreftceller kan invadere ved hjelp av ulike former for migrasjon, vet vi ikke om dette modulerende strategi kan brukes på andre typer kreft celle invasjon.
ROCK spiller også en sentral rolle i RhoA avhengig hemming av Rac1 [22], [23], [43], [44], [45]. Nylige fremskritt har identifisert FilGAP, en filamin-bindende protein utstyrt med en Rac1-specfic Rho GTPase aktiverende funksjon, som en viktig formidler av ROCK-indusert hemming av Rac1. Etter fosforylering av ROCK, er RacGAP aktiviteten av FilGAP stimulert og, som en konsekvens, FilGAP induserer bleb dannelse og undertrykker cellespredning og ledende formasjon, som er kjennetegn ved Rac1 aktivitet inhibering [22]. Videre ROCK signale aktiverer også ARHGAP22 (en annen RacGAP) som i sin tur hemmer Rac1 aktivisering for å unngå undertrykkelse av blebbing avhengige (amoeboid?) Bevegelse [23]. Imidlertid kan RhoA også mediere Rac1 aktivering og påfølgende lamellipodia formasjonen gjennom rekruttering av mDia, som er forbundet med membran folder [43], [46]. Tatt i betraktning denne dobbeltrolle, fravær av korrelasjon mellom RhoA aktivering og celle invasjon vi rapporterer her er ikke overraskende. ROCK-aktivitet er mer sannsynlig å være forbundet med invasivitet, mens påvirkning av RhoA svinger mellom mDia og ROCK-aktivering, avhengig av celletypen. Følgelig er effekten av C3 exoenzyme, en Rho-inhibitor, og i Y27632, en ROCK-inhibitor, er svært forskjellige. I LPA-stimulerte Swiss 3T3 celler, Y27632, men ikke C3, økt behandling Rac1 aktivitet og indusert membran krusning formasjon [43].
Til slutt, er en av de viktigste funnene i vår studie at ROCK, men ikke RhoA , aktivitet er knyttet til invasivitet i vår samling av tykktarmskreft cellelinjer. Dette reiser spørsmålet om signalveien (e) som selektivt aktiverer ROCK i de mer invasive cellelinjer. Vi kan spekulere i at andre ROCK aktivatorer kan avlaste RhoA aktivitet i sitt fravær. For eksempel, RhoC, som i hovedsak fremmer invasivitet [47], [48], [49], [50], [51], stimulerer og samhandler med ROCK sterkere enn RhoA [52]. Etter avtale med dette, RhoC uttrykk og aktivering sammenfaller med EMT av kolorektal kreftceller som er forbundet med økt aggressivitet under tumorigenesis [53]. Tatt sammen disse dataene tyder på at Rho GTPases kan fungere i en kompenserende, men likevel distinkt, måte [54]. Men vår kunnskap om involvering av Rho GTPases i kreft invasjon er sterkt avhengig av over-uttrykk for konstitutivt aktiverte former. Dette kan forstyrre den naturlige balansen i Rho GTPase regulatorer og effektorer. For eksempel bør eksponering av celler til høye nivåer av aktiv RhoA favorisere signalisering gjennom ROCK, mens lave nivåer av RhoA fremme signalisering gjennom mDia [52]. Derfor vil det over uttrykk for et konstitutivt aktivert form av RhoA fremme ROCK avhengig invasivitet og kan tilsløre mDia antagonistiske veien. Videre oppsamling av bevis indikerer at GTPase aliserte resultatet avhenger ikke bare av effektorene, men også på de GEFs som vil drive de GTPases og effektorene i nærheten, noe som skaper mikro-områder med høye lokale konsentrasjoner av effektorer [55] [56] . Som en konsekvens, kan RhoA aktivitet ikke helt står for ROCK aktivering. Dessuten kan den rå RhoA aktivitet også ikke fullt en indikasjon på hvilken signalveien (dvs. GEFs og tilhørende effektbokser) er engasjert.
I konklusjonen, vårt arbeid gir viktig innsikt om hvordan Rho GTPases aktiverings konsekvenser for colorectal svulst progresjon og mer presist på invasivitet av blebbing kolorektal celler. Vår sentrale funn er samspillet mellom ROCK og Cdc42 og Rac1 aktiviteter. Disse signalveier ha motsatt effekt på invasjon og deres svingninger er delvis innbyrdes beslektet, men våre data også foreslå eksistensen av uavhengige iboende bidrag. Dette ville ha viktige konsekvenser for strategier for utvikling av nye kreftmedisiner. Med fokus bare på de overordnede forhøyede uttrykk nivåer av Rho GTPases i kreft kan føre til terapeutiske ulemper hvis deres motstridende effekter ikke er tatt hensyn til. Faktisk designe svært selektiv Rho GTPase signale modulatorer og kombinere deres effekter kan tilby større terapeutiske muligheter.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
Den normale kolon cellelinjer FHC , lure og kolorektal kreft cellelinjer HCT116, CaCO2, LS174T, SW480, HT29, WiDr, LoVo, SKCo1, SW620 og CoLo205 ble kjøpt fra ATCC og dyrket som anbefalt. Cellene ble behandlet med 40 ng /ml PDGF-BB (Upstate) og 10 mikrometer Y27632 (Calbiochem). Protein lysater ble oppnådd ved kort sonikering av behandlede celler på 2 x Laemmli-buffer.
