Abstract
Hypoksi er en negativ faktor i livmorhalskreft, og hypoksi-relaterte genuttrykk kan være et kraftig biomarkør for å identifisere de aggressive hypoksiske svulster. Revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) er en verdifull metode for genuttrykkstudier, men egnede referanse gener for data normalisering som er uavhengige av hypoksi status og kliniske parametere av livmorhals tumorer mangler. I dette arbeidet, ønsket vi å identifisere referanse gener for RT-qPCR studier av hypoksi i plateepitel livmorhalskreft. Fra 422 kandidat referanse gener valgt fra litteraturen, brukte vi Illumina arraybaserte uttrykk profiler for å identifisere 182 gener som ikke berøres av hypoksi i livmorhalskreft, dvs. gener som reguleres av hypoksi i åtte livmorhalskreft cellelinjer eller samkjøre med hypoksi-forbundet dynamisk kontrast -enhanced magnetic resonance imaging parameter A
Brix hos 42 pasienter, ble ekskludert. Blant de 182 genene, ni kandidater (
CHCHD1
,
GNB2L1
,
IPO8
,
LASP1
,
RPL27A
,
RPS12
,
SOD1
,
SRSF9
,
TMBIM6
) som ikke var assosiert med tumorvolumet, scene, spredning til lymfeknuter eller sykdomsprogresjon i array-data for 150 pasienter, ble valgt for videre testing av RT-qPCR. geNorm og NormFinder analyser av RT-qPCR data fra 74 pasienter identifisert
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM6
som den optimale sett med referanse gener, med stabil uttrykk både generelle og over undergrupper av pasienter med ulike hypoksi status (A
Brix) og kliniske parametre. Egnetheten av de tre referanse gener ble validert i studier av hypoksi-indusert gener
DDIT3
,
ERO1A
, og
STC2
. Etter normalisering av RT-qPCR data til disse genene viste en signifikant korrelasjon med Illumina uttrykket (P 0,001, n = 74) og A
Brix (P 0,05, n = 32), og
STC2
data var assosiert med klinisk resultat, i samsvar med Illumina data. Dermed
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM6
synes å være egnede referanse gener for å studere hypoksi-relaterte genuttrykk i squamous livmorhalskreft prøver ved RT-qPCR. Videre
STC2
er en lovende prognostisk hypoksi biomarkør i livmorhalskreft
Citation. Fjeldbo CS, Aarnes EK, Malinen E, Kristensen GB, Lyng H (2016) Identifisering og validering av referanse Genes for RT-qPCR studier av Hypoksi i Plateepitel livmorhalskreft pasienter. PLoS ONE 11 (5): e0156259. doi: 10,1371 /journal.pone.0156259
Redaktør: Christian Schönbach, Nazarbayev University, KAZAKHSTAN
mottatt: 23 november 2015; Godkjent: 11 mai 2016; Publisert: 31. mai 2016
Copyright: © 2016 Fjeldbo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i papir og dets tilleggsinformasjon filer. Alle Illumina genuttrykk filer er tilgjengelige fra GEO database (GSE75034)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Norges forskningsråd Norge, Grant nummer 226120 /O30, (https://www.forskningsradet.no /no /HOME_PAGE /1177315753906). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tumor hypoksi er en viktig faktor som fører til strålebehandling motstand, metastaser og dårlig prognose for mange maligne sykdommer, inkludert livmorhalskreft [1-5]. For måling av hypoksi-relaterte genekspresjon variasjoner i pasientprøver, revers transkripsjon kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR) er en verdifull metode på grunn av sin høye følsomhet, fleksibilitet, lav pris og brukervennlighet [6-8]. I RT-qPCR-analyse, er det viktig å velge optimale referansegener for data normalisering for å fjerne ikke-biologisk, eksperimentelt indusert variasjon fra dataene. For nøyaktig og pålitelig normalisering, er flere referanse gener anbefales [6,7,9]. Fastsettelse av referanse gener for kliniske studier er spesielt utfordrende, fordi stabiliteten av genene må verifiseres i vevet under etterforskning og på tvers av kreft fenotyper og kliniske parametre.
Tidligere arbeid på referanse gener i livmorhalsen har fokusert på ulike stadier av livmorhalskreftutvikling ved å evaluere kandidat gener på tvers av humant papillomavirus (HPV) negative og positive lesjoner [10], og på tvers av normale, forstadier til kreft og kreftprøver [11-13]. Så vidt vi vet, har egnede referanse gener for å studere hypoksi-forbundet genuttrykk i livmorhalskreft biopsier ikke blitt rapportert. Mange kandidater har blitt foreslått for dette formålet fra eksperimentelle studier hvor cellelinjer er dyrket under lave oksygenkonsentrasjoner [9,14-17], men bare en studie på hode og nakke kreft har benyttet hypoksi status for kliniske prøver i valideringen av slike kandidater [18]. Tumor-site konkret vurdering er nødvendig [9,15] og skal inneholde assosiasjoner til kliniske funksjoner og utfall i tillegg til hypoksi status.
De fleste studier som søker etter referanse gener starte med et begrenset panel på ca 8-25 kandidater valgt på grunnlag av gener som vanligvis anvendes i litteraturen, som ikke nødvendigvis er den mest stabilt uttrykte gener. Ved å benytte hele genomet ekspresjons data for en første vurdering av kandidater kan være nyttig for å identifisere de mest lovende panel av gener for å teste i en RT-qPCR-analyse [19-24]. I denne studien ble denne tilnærmingen brukes til å finne egnede referansegener for hypoksistudier i livmorhalskreft biopsier. En grundig gjennomgang av litteraturen identifiserte 422 potensielle referanse gener, hvorav 410 kandidater var til stede i våre datasett og ble utsatt for en første vurdering, ved hjelp av genuttrykk profiler av 150 livmorhalskreftpasienter og åtte livmorhalskreft cellelinjer. Ni gener, ikke er assosiert med hypoksi eller kliniske parametere, ble ytterligere evaluert med RT-qPCR, og tre av dem ble valgt som den optimale sett med referansegener. Egnetheten av referanse genene for data normalisering ble bekreftet i studier av tre kjente hypoksi-indusert gener i forhold til tumor hypoksi status og klinisk utfall.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studien ble godkjent av Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk i Sørøst-Norge (REC S-01129), og skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra alle pasientene.
Pasient kohorter og vevsprøver
Totalt 160 pasienter med lokalt avansert plateepitelkarsinom i livmorhalsen, prospektivt rekruttert til vår kjemoradioterapi protokollen ved det Norske Radiumhospital 2001-2012, ble inkludert (tabell 1). Illumina genuttrykk profiler eksisterte for 150 pasienter (Illumina kohort, tabell 1), og ble brukt til å velge kandidat referanse gener for å teste med RT-qPCR (figur 1). For 42 av disse pasientene, den hypoksi-forbundet dynamisk kontrastforsterket (DCE) -magnetic resonans (MR) avbildning parameter A
Brix [25] var tilgjengelig og brukes som mål på svulsten hypoksi status. Ti uavhengige pasienter (RT-qPCR cohort 1) ble brukt for pre-evaluering av ni kandidat gener. Videre 74 av de 150 pasientene i Illumina kohort (RT-qPCR kohort 2) ble brukt for videre evaluering og validering av kandidater. I tillegg ble 22 biopsier fra åtte uavhengige pasienter (2-4 biopsier fra hver pasient) som brukes til å evaluere intra-tumor heterogenitet (heterogenitet kohort).
Tumor volum og tilstedeværelse av patologisk lymfe noder ble vurdert fra før behandling MR-bilder. Ett til fire tumor biopsi (ca. 5 x 5 x 5 mm) ble tatt ved diagnose, straks hurtigfrosset og lagret ved -80 ° C. Alle pasientene mottok ekstern stråling på 50 Gy til den primære tumor og valgfrie områder, 45 Gy til de gjenværende bekkenet, og ytterligere 14 Gy til patologiske lymfeknuter. Dette ble etterfulgt av brachyterapi på 25 Gy. Samtidig cisplatin (40 mg /m
2) ble gitt ukentlig i maks 6 kurs i henhold til toleranse. Pasientene ble fulgt opp i henhold til standard prosedyre, som beskrevet [25].
Cell kultur
Åtte menneskelivmorhalskreft cellelinjer fra American Type Culture Collection ble brukt for å vurdere hypoksi-responsive gener ; HeLa, SW756, C-33 A, C-4I, ME-180, HT-3, Siha, og CaSki. Cellelinjene ble godkjent av STR /DNA profilering ved hjelp PowerPlex 21 (Promega, Madison, WI) ved Eurofins Genomics (Ebersberg, Tyskland). Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med Glutamax (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) supplert med 100 U /ml penicillin /streptomycin (Sigma , St. Louis, MO) og 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco). Celler ble rutinemessig testet for
Mycoplasma
infeksjon. Celler ble dyrket i 24 timer i 10 cm plastskåler (1 til 1,8 x 10
6-celler for å oppnå ~ 4 x 10
6-celler etter 48 timers inkubering) før eksponering for hypoksisk (0,2% O
2, 5% CO
2) eller normoksiske (95% luft, 5% CO
2) betingelser i 24 timer ved 37 ° C. En Invivo2200 kammer (Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, UK) ble brukt for hypoksi behandling.
genekspresjonsanalyser
RNA isolering.
Total RNA ble isolert fra celle linjer ved hjelp RNeasy MINIKIT (Qiagen, Germantown, MD) og fra frosne prøver ved hjelp Trizol reagens (Life Technologies) (Illumina kohort, RT-qPCR kohort 2) eller miRNeasy MINIKIT (Qiagen) (RT-qPCR kohort 1, heterogenitet kohort). Alle kliniske prøver hadde mer enn 50% tumorceller i hematoksylin og eosin-fargede seksjoner, avledet fra den sentrale delen av biopsi. Bortsett fra den heterogene kullet RNA fra forskjellige biopsier av den samme tumoren ble slått sammen, og RNA-konsentrasjonen ble målt ved anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). RNA integritet ble bekreftet av Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, California). Alle prøvene hadde et RNA integritet nummer (RIN) i området 3,6 til 9,0 med en median RIN på 7,1.
Gene uttrykk ved Illumina perle arrays.
For hele genomet genekspresjon profilering, Illumina 48k perle matriser med ca 48000 transkripsjoner ble brukt; HumanWG-6 v3 (pasienter, cellelinjer) og HumanHT-12 v4 (cellelinjer) (Illumina Inc., San Diego, California). Pasientdataene er en del av datasettene som brukes i tidligere arbeid [25]. cRNA ble syntetisert, merket og hybridisert til oppstillingene. Signal utvinning og quantile normalisering ble utført ved hjelp av programvaren som leveres av produsenten (Illumina Inc.), og log2-transformerte data ble brukt i analysene. Dataene ble avsatt i genuttrykk omnibus (GEO) database (GSE75034).
Gene uttrykk ved RT-qPCR.
For RT-qPCR analyser, den 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble påført, og forsterkningskurver ble analysert ved anvendelse av programvaren v2.3 SDS (Applied Biosystems). DNA-free
™ Kit (# AM1906, Ambion, Austin, TX) ble brukt til å fjerne genomisk DNA, i henhold til produsentens beskrivelse. Revers transkripsjon ble utført av High-Capacity cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems), som omfatter tilfeldige primere, ved hjelp av 2000 ng DNase-behandlet RNA i en 20 mL reaksjon. 1 ul cDNA ble forsterket ved bruk av TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x) og Custom TaqMan Array 96-Well Fast plater med tørkede ned TaqMan genekspresjon Analyser (Applied Biosystems), eller single-tube TAQMAN analyser og 96-brønn Fast plater . Termocykling parametre var som beskrevet i det tilpassede Array-protokollen, eller for enkelt rør assays: 20 s ved 95 ° C (enzymaktivering), 40 termiske sykluser med 1 s ved 95 ° C (denaturering) og 20 s ved 60 ° C ( annealing og forlengelse). TAQMAN analyser for kandidat referanse gener og tre hypoksi-indusert gener vurdert i denne studien er gitt i Tabell 2. Bare pre-utviklet inventoried TAQMAN analysene ble valgt. For evaluering av TaqMan analysene, ble størrelsen på PCR produktene bestemmes ved gel elektroforese, ved hjelp av en D1000 ScreenTape
® Station (Agilent Technologies). For de tre utvalgte referansegener (se nedenfor) og de tre hypoksi-indusert gener, ble PCR-effektiviteten bestemt fra cDNA utvannings kurver og viste lineære reaksjonseffektiviteten (S1 Fig).
Alle prøvene ble kjørt i to eksemplarer, og gjennomsnittet kvantifisering syklusen (C
q) for hver prøve ble anvendt i analysene. Prøver med gjennomsnittlig C
q 37 eller standardavvik 0.4 ble ekskludert. Minus revers transkriptase kontroller ble testet for resterende genomisk DNA for alle TaqMan analyser, og forurensning ble bedømt ved ikke-templat-kontroller uten RNA til cDNA-syntese. Alle negative kontroller hadde ubestemt C
q. Ekspresjonsnivået av en mål-genet ble analysert ved hjelp av sammenlignende C
q-metoden [26], normal C
q-verdier av målgenet for en normaliseringsfaktor beregnet som gjennomsnittet C
q- verdiene av referansegener; A C
q, gen = C
q, generer (C
q,
CHCHD1
+ C
q,
SRSF9
+ C
q
TMBIM6
) /3 for referanse gener identifisert i denne studien (se nedenfor).
statistikker
geNorm [6] og NormFinder [7] algoritmer ble brukt for å vurdere stabiliteten til kandidat referanse gener. Den geNorm algoritme er basert på det prinsipp at uttrykket forholdet mellom to ideelle referanse gener er identisk i alle prøver. For hver kandidat, er et stabilitetsmåle M beregnet som gjennomsnittet parvise variasjon av genet med alle andre kandidater; dvs. det midlere standardavvik for log2-transformerte uttrykk forhold mellom genene. Genene med lavest M-verdier anses å være mest stabile. Genene er rangert etter trinnvis utelukkelse av de minst stabile kandidat og rekalkulering av M-verdier for de resterende gener blir utført inntil de to mest stabile gener er igjen. For å bestemme antall referanse gener å inkludere for pålitelig normalisering, parvis variasjon mellom to sekvensielle normaliseringsfaktorene (V
n /n + 1) ble beregnet for alle prøver, og cut-off verdi for inkludering av en ekstra gen var satt til 0,15 [6]. NormFinder er en modellbasert tilnærming ANOVA, og ble brukt for estimering av den totale variasjonen i hver kandidat genet og dens variasjon på tvers av undergrupper av pasienter ved å ta hensyn til både intra- og inter-gruppevariasjoner. De estimerte variasjoner er kombinert i en stabilitetsverdi for hvert gen, hvor en lav verdi indikerer mer stabil ekspresjon [7].
Spearmans rang korrelasjon ble anvendt for å beregne sammenhengen mellom kontinuerlige variabler, Mann-Whitney U-test ble brukt å sammenligne forskjeller i genuttrykk nivåer mellom gruppene, og COX proporsjonal hazard (PH) univariat analyse ble brukt for å vurdere forholdet mellom kandidat referanse gener til klinisk utfall. Den kliniske endepunktet var progresjonsfri overlevelse (PFS) for oppfølging inntil 5 år. PFS ble definert som tiden fra diagnose til sykdomsrelatert død eller første tilfelle av tilbakefall. Dødsfall innenfor 2 år etter inklusjon ble ansett som sykdomsrelatert mindre en annen sak ble dokumentert. Pasientene ble sensurert i sin siste time eller 5 år, og status ble vurdert på 3 oktober 2014. En konkurrerende risikomodell ble brukt til å beregne kumulative forekomsten av sykdomsprogresjon, med død av andre årsaker enn livmorhalskreft som konkurrerende arrangement. Elleve av de 160 pasientene inkludert døde av andre årsaker uten å oppleve tilbakefall under oppfølging. Siden rundt 1/3 av pasientene opplevde tilbakefall, ble kumulative insidensen kurver forhold mellom 1/3 av kohorten med høyest genekspresjon og 2/3 med lavest uttrykk. Gray test ble brukt for å vurdere forskjellene mellom kurvene. Signifikansnivå på 5% med mindre annet er angitt, og alle P-verdier var tosidig.
Alle analyser ble utført ved anvendelse av R [27] versjon 3.1.1. For geNorm analyser, den read.qPCR () og selectHKs () funksjoner i ReadqPCR og NormqPCR pakker [28] ble brukt. For NormFinder analyserer Normfinder () -funksjonen levert av Molecular Diagnostic Laboratory, Institutt for molekylær medisin, Aarhus universitetssykehus Skejby, ble Danmark benyttes, og de konkurrerende risikoanalyser ble utført med cuminc () -funksjonen i cmprsk pakken [29].
Resultater og diskusjon
valg av kandidat referanse gener fra arraybaserte uttrykk profiler
for å identifisere stabilt uttrykte gener i livmorhalskreft prøver, valg av kandidater ble begrenset til gener som tidligere har blitt rapportert som referanse gener i litteraturen [10,11,13,18,30-35], som nye referanse kandidater basert på meta-analyse av store microarray eller RNA sekvense datasett [19-23], eller er tilstede på TaqMan uttrykker human endogenous kontrollplate (Applied Biosystems). Dette resulterte i en liste over 422 forskjellige gener, hvor 410 var til stede på den Illumina matrisen anvendt i denne studien (figur 1, tabell S1), representert ved 631 forskjellige prober.
De mest sannsynlige kandidater blant 410 gener ble identifisert ved hjelp av Illumina arraybaserte uttrykk profiler av 150 livmorhalskreftpasienter og åtte livmorhalskreft cellelinjer dyrket under normoxia og hypoksi. Først kandidater ble ekskludert på grunnlag av deres tilknytning til en hypoksi respons i livmorhalskreft eller med kliniske parametre i pasient kohort. Genene for hvilke ekspresjon av minst en sonde i den kliniske datasett korrelert med den hypoksi-forbundet DCE-MRI-parameteren A
Brix (n = 42) ble fjernet, så vel som gener som var mer enn 1,5 ganger opp- eller nedregulert under hypoxi i det minste en av cellelinjene (S1 Table). I tillegg ble det kandidater som viser en sammenheng mellom deres uttrykk nivåer og tumorvolumet, scene, lymfeknute status, eller klinisk utfall i 150 pasienter (S1 Table) ekskludert. De fjernede gener inkludert
GAPDH
,
HMBS
,
EEF1A1
,
ACTB
,
PGK1
,
RPLP0
og
TBP
, som har blitt identifisert som aktuelle referanse gener i tidligere studier av livmorhalskreft [10-13,36,37], og
B2M
,
HPRT1
,
RPL11
,
RPL37A
,
ACTR3
, og
NDFIP1
, som har blitt funnet å være egnet for hypoksistudier i hode og nakke kreft [18,30]. Helt, 99 forskjellige gener representert ved 117 sonder forble som referanse kandidater på dette stadiet. For å sikre deteksjon av referanse gener i RT-qPCR analyser, en ytterligere uttrekk av gener basert på et meget lavt ekspresjonsnivå (bety log2 ekspresjon av 150 pasienter 7) ble utført, reduserer dette antallet til 89 kandidater som representeres av 101 prober.
i tillegg til stabil ekspresjon, bør referanse genet ideelt ha transkripsjon overflod lik de genene som undersøkes for å øke sensitiviteten til å detektere små genekspresjon endringer [24]. Vi fant at kandidater med lavest variasjonskoeffisienten (CV) ble generelt uttrykt ved høye nivåer, en observasjon også synlig for andre, [24], mens de fleste hypoksi-regulerte gener fra vårt tidligere arbeid [25] har hatt et forholdsvis lavt ekspresjonsnivå ( data ikke vist). En endelig panel av gener som skal evalueres ved RT-qPCR ble derfor valgt for å representere forskjellige uttrykk nivåer i tillegg til å holde CV så lav som mulig. Kandidater ble også valgt på en slik måte at de representerte forskjellige veier eller funksjonelle klasser for å minimalisere risikoen for å velge co-regulerte gener [6]. Til slutt ble tilgjengeligheten av en passende forhåndsutformede og validert TaqMan-test som benyttes som et utvalgskriterium. Panelet av ni kandidater til å bli testet i RT-qPCR-analyser er angitt i tabell 1, og hadde CV i området fra 0,01 til 0,09 og bety log2 ekspresjonsnivåer i området fra 7,4 til 14,0 i de kliniske datasettet. Blant disse genene,
GNB2L1
har tidligere blitt brukt som referanse genet i hypoksistudier av hode og nakke kreft [18].
Pre-evaluering av 9 kandidatreferanse gener ved RT-qPCR
for å sikre at kandidatene kan være riktig registrert i en TaqMan analysen og muligens ytterligere begrense panel, en pre-evaluering av de ni gener ble utført i 10 pasienter (RT-qPCR kohort 1, tabell 1, figur 1) . De TaqMan Analysene ble først undersøkt ved gel elektroforese av PCR-produkter fra en pasient (figur 2A). For alle analyser, ble et sterkt bånd av forventet størrelse sett. Men for
SOD1
ytterligere svakere bånd av mindre størrelse som kan medføre primer dimer også dukket opp, noe som indikerer at analysen ikke fungerte optimalt.
SOD1
ble derfor ekskludert i de videre analysene.
(A) Gel elektroforese av PCR produktene for ni kandidatreferanse gener i en pasient. Lavere (25 bp) og øvre (1500 bp) markører vises på hver bane. Gene symboler vises. Figuren er et sammensatt bilde der
CHCHD1
er fra et eget bilde og stigen fra hvert bilde vises. Vertikale linjer indikerer beskjæring av bildet eller forskjellige bilder. (B) Boksplott av det aritmetiske betyr dupliserte C
q-verdier for åtte kandidat referanse gener i 10 pasienter. Bokser indikere indre kvartilområdet (IQR) med median som sort midtlinjen. Utvidet vertikale linjene representerer 1,5 x IQR under den første kvartil og 1,5 x IQR over tredje kvartil, og sirkler markere mistenkte uteliggere. (C) geNorm analyse av åtte kandidat referanse gener. Gjennomsnitt uttrykk stabilitet (M) av de gjenværende kandidatene etter trinnvis fjerning av det minst stabile genet er vist. Den minst stabile genet i hvert trinn er angitt nedenfor. (D) Stabilitet verdien av hver av de åtte kandidat referanse gener fra NormFinder analyse, hvor en lav verdi indikerer mer stabil uttrykk.
De åtte gjenværende kandidater ble oppdaget med C
q-verdier spenner 19,1 til 31,1, der
GNB2L1 Hotell og
TMBIM6
var den mest tallrike og
RPL27A
minst rikelig transkripsjon (figur 2B). geNorm og NormFinder analyser ble utført for å rangere genene i henhold til den generelle stabilitet på tvers av ti pasienter (figur 2C og 2D). Den gjennomsnittlige Uttrykket stabilitet M fra geNorm analysen varierte fra 0,72 ved hjelp av alle åtte gener til 0,4 for de to mest stabile kandidater (figur 2C). Rangeringen av genene i NormFinder analysen var nesten identisk med geNorm rangering (figur 2D). For en mer grundig stabilitetsanalyse, herunder vurdering av stabiliteten over undergrupper, og bestemmelse av den optimale antall referanse gener å inkludere for normalisering, de fem mest stabilt uttrykte gener som bestemmes av de to metodene, dvs.
CHCHD1
,
GNB2L1
,
IPO8
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM6
, ble undersøkt videre.
Fastsettelse av en RT-qPCR normaliseringsfaktor
De fem gjenværende kandidater ble vurdert ved RT-qPCR analyse i 74 pasienter (RT-qPCR kohort 2, tabell 1, figur 1), noe som resulterer i C
q-verdier mellom 17,9 og 25,4 ( figur 3A). geNorm og NormFinder analyser viste lignende rangering av genene i henhold til stabiliteten på tvers av pasientene (figur 3B og 3C). Fra geNorm analyse er gjennomsnittlig uttrykk stabilitet M varierte fra 0,57 ved hjelp av alle fem genene til 0,45 ved hjelp av de to mest stabile kandidater.
(A) Box plott av aritmetiske betyr dupliserte C
q-verdier for fem kandidat referanse gener i 74 pasienter. Bokser indikere indre kvartilområdet (IQR) med median som sort midtlinjen. Utvidet vertikale linjene representerer 1,5 x IQR under den første kvartil og 1,5 x IQR over tredje kvartil, og sirkler markere mistenkte uteliggere. (B) geNorm analyse av fem kandidat referanse gener. Gjennomsnitt uttrykk stabilitet (M) av de gjenværende kandidatene etter trinnvis fjerning av det minst stabile genet er vist. Den minst stabile genet i hvert trinn er angitt nedenfor. (C) Stabilitet verdi av hver av de fem kandidat referanse gener fra NormFinder analyse, hvor en lav verdi indikerer mer stabil ekspresjon. (D) geNorm parvis variasjon (V) analyse for å fastslå tilstrekkelig antall referanse gener i normaliseringsfaktor. Parvise variant for to sekvensielle normaliseringsfaktorene (V
n /n + 1) fra de to mest stabile gener til alle fem gener. Den horisontale linjen viser grenseverdien (V = 0,15), som inkludering av flere gener har ingen signifikant effekt på normaliseringsfaktor.
For å evaluere tilstrekkelig antall gener som kreves for pålitelig normalisering , en trinnvis prosedyre ble benyttet ved å inkludere gener sekvensielt inn i normaliseringsfaktor i henhold til deres økende M-verdi inntil ikke noe vesentlig bidrag ble oppnådd. Den parvise variasjon mellom normaliseringsfaktorene med tre og fire gener var under cut-off-verdien (V
3/4 0,15), noe som indikerer at de tre kandidatene med lavest M-verdi,
CHCHD1
SRSF9 Hotell og
TMBIM6
, er tilstrekkelig for å normalisere (fig 3D). Disse kandidater ble også funnet å være de tre mest stabile gener i NormFinder analyse (figur 3C). Videre deres gjennomsnittlige M-verdi var 0,49 (figur 3B), og under det området 0,5-1 det skal være nødvendig ved vurdering av referanse gener i kreft biopsier [38].
Vi evaluerte stabiliteten av ytterligere fem kandidater på tvers av undergrupper av pasienter som bruker NormFinder algoritmen (fig 4). I denne analysen
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM6
også dukket opp som den optimale referanse gener. De var de mest stabile kandidater på tvers pasienter med lav og høy tumorstadium eller volum og med og uten tilbakefall, og for pasienter med og uten spredning til lymfeknuter på diagnose de tre kandidatene var blant de fire mest stabile gener. Videre i analysen av svulsten hypoksi status,
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM6
var de mest stabile kandidater på tvers pasienter med høy og lav A
Brix ( fig 4). For ytterligere å validere stabiliteten av disse tre genene, geNorm analyse på RT-qPCR data fra normoksisk og hypoksiske prøver fra åtte livmorhalskreft cellelinjer ble utført. Den gjennomsnittlige M-verdien for de tre genene var 0,79, noe som indikerer stabil uttrykk på tvers normoksiske og hypoksiske dyrkningsforhold [38]. Dermed
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM6
syntes å være godt egnet for å beregne en normaliseringsfaktor og ble valgt for validering i studier av hypoksi-indusert genekspresjon (Fig 1).
NormFinder analyser av stabiliteten i fem kandidat referansegener på tvers av undergrupper av pasienter. Undergruppene vurderte var: lav (n = 49) og høy (n = 25) tumorstadium (FIGO 1B-2B vs. 3A-4A), med (n = 32) og uten (n = 42) lymfeknute (LN) engasjement ved diagnose, under (n = 36) og ovenfor (n = 36) en median tumor volum på 44,6 cm
3, med (n = 32) eller uten (n = 42) behandling tilbakefall på fem år, og annerledes hypoksi status representert ved nedenfor (n = 16) og ovenfor (n = 16) en median A
Brix.
Validering av
CHCHD1
,
SRSF9
og
TMBIM6
som referanse gener i hypoksistudier
RT-qPCR analyser ble utført i tre gener som vi tidligere har rapportert å bli indusert av hypoksi i livmorhalskreft cellelinjer og i forbindelse med A
Brix i livmorhalskreft [25], dvs.
DDIT3
,
ERO1A Hotell og
STC2
. RT-qPCR kohort 2 av 74 pasienter, som vi hadde Illumina uttrykk data, ble benyttet. Gel-elektroforese av PCR-produktene viste at TaqMan analysene arbeidet riktig, generering av et enkelt spesifikt produkt av den forventede størrelse for hver av de tre gener (figur 5A). Uttrykket nivåer av
DDIT3
,
ERO1A Hotell og
STC2
ble beregnet ved å normalisere C
q-verdier for den gjennomsnittlige C
q-verdi på
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM
6. Den -ΔC
q-verdien ble vist å være sterkt korrelert med Illumina data for alle tre gener (P 0,001; ρ 0,78 til 0,83). Videre betydelige negative korrelasjoner mellom -ΔC
q og A
Brix ble funnet, i samråd med korrelasjoner oppnådd med Illumina data (Tabell 3). De identifiserte referanse gener derfor synes egnet for måling av hypoksi-indusert forandringer i livmorhalskreft.
(A) Gel elektroforese av PCR produktene for de tre hypoksi-indusert gener
DDIT3
,
ERO1A
, og
STC2
. Lavere (25 bp) og øvre (1500 bp) markører vises på hver bane. Figuren er avledet fra ett bilde, og vertikale linjer angir beskjæring av bildet. Akkumulert forekomsten av sykdomsprogresjon for 74 pasienter fordelt på lav ( 67% persentil) og høy (≥ 67% persentil)
STC2
uttrykk basert på (B) Illumina uttrykk data og (C) RT-qPCR data normalisert med
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM
6 (-ΔC
q). 60 måneder tilbakefall sannsynlighet, er P-verdier fra Gray test og antall pasienter med risiko indikert. Død av andre årsaker enn livmorhalskreft ble inkludert som en konkurrerende hendelse (n = 5). (D) Intra-tumor variasjon i
STC2
uttrykk nivåer målt ved RT-qPCR over åtte uavhengige svulster med 2-4 biopsier per svulst, dvs. totalt 22 biopsier. Måling av
STC2
var mislykket for en av de biopsier for svulst 4.
STC2
data ble normalisert med
CHCHD1
,
SRSF9 Hotell og
TMBIM
6. Prøvene ble klassifisert i en høy og lav uttrykk gruppe med den samme cut-off som i figur 5C (dvs. -ΔC
q = -4,46). Ulike biopsier fra samme svulst har blitt plottet med samme farge for å lette tolkningen av figuren.
Siden hypoksi er kjent for å være assosiert med aggressivitet i livmorhalskreft [3-5] vi vurderte den prognostiske verdien av
DDIT3
,
ERO1A Hotell og
STC2
uttrykk i Illumina og RT-qPCR datasett. Basert på Illumina data fra 150 pasienter, ble en statistisk signifikant økt risiko for sykdomsprogresjon funnet for pasienter med det høyeste uttrykk for
DDIT3
eller
STC2
i forhold til de andre (P = 0,047 og P = 0,015, henholdsvis Gray test, data ikke vist), mens
ERO1A
uttrykk var ikke assosiert med utfall (data ikke vist). I RT-qPCR kohort 2 av 74 pasienter, den sterkeste krets for å resultat ble funnet for
STC2
i begge datasettene, og for RT-qPCR data forholdet var statistisk signifikant (figur 5B og 5C).
