Abstract
VTI1A-TCF7L2
ble rapportert som et tilbakevendende fusjonsgenet i tykk- og endetarmskreft (CRC), funnet å være uttrykt i tre av 97 primære kreft, og en cellelinje, NCI-H508, hvor en genomisk sletting blir de to genene [1]. For å undersøke dette fusjon videre, analyserte vi high-throughput DNA og RNA sekvense data fra sju CRC cellelinjer, og identifisert genet
RP11-57H14.3 plakater (ENSG00000225292) som en roman fusjonspartner for
TCF7L2
. Fusjons ble oppdaget fra begge genom og transkriptom data i HCT116-cellelinjen. Ved triplikat nestet RT-PCR, testet vi både den nye fusjons transkripsjon og
VTI1A-TCF7L2
for ekspresjon i en serie av 106 CRC vev, 21 CRC-cellelinjer, 14 normal tykktarmsslimhinne, og 20 normale vev fra diverse anatomiske områder. Til sammen 42% og 45% av CRC prøvene uttrykt
VTI1A-TCF7L2 Hotell og henholdsvis
TCF7L2-RP11-57H14.3
fusion transkripsjoner,. Fusjons transkripsjoner ble både sett i 29% av de normale colonic slimhinnen prøver, og i 25% og 75% av de testede normalt vev fra andre organer, avslører at
TCF7L2
fusion transkripsjoner er verken spesifikke for kreft eller til kolon og rektum. Syv ulike spleisevarianter ble oppdaget for
VTI1A-TCF7L2
fusjon, hvorav tre er nye. Fire ulike spleisevarianter ble oppdaget for
TCF7L2-RP11-57H14.3
fusjon. Avslutningsvis har vi identifisert nye varianter av
VTI1A-TCF7L2
fusion transkripsjoner, inkludert en ny fusjonspartner genet,
RP11-57H14.
3, og demonstrerte påvisbare nivåer i en stor andel av CRC prøver, så vel som i normal kolon mukosa og andre typer vev. Vi foreslår at fusjons transkripter observert i en høy frekvens av prøver er transkripsjonsinduserte kimærer som er uttrykt ved lave nivåer i de fleste prøver. De tilsvarende fusjons transkripsjoner indusert av genomisk rearrangements observert i enkelte kreftcellelinjer kan likevel ha onkogene potensial som foreslått i den opprinnelige studien av Bass et al
Citation. Nome T, Hoff AM, Bakken AC, Rognum TO, Nesbakken A, Skotheim RI (2014) Høyfrekvent av Fusion transkripsjoner Involvering
TCF7L2
i Colorectal Cancer: Novel Fusion Partner og Splice Varianter. PLoS ONE 9 (3): e91264. doi: 10,1371 /journal.pone.0091264
Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 16 oktober 2013; Godkjent: 10 februar 2014; Publisert: 07.03.2014
Copyright: © 2014 Nome et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert med tilskudd fra den Norske Kreftforening (TN og AMH ble finansiert som PhD-studenter fra PR-2007-0166 stipend til RIS), Norstore (for lagring av datafiler, prosjekt NS9013K), og delvis støttet av Forskningsrådet av Norge gjennom sine sentre for fremragende støtteordning, prosjektnummer 179571. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest vanligste og dødelig kreftsykdom verden [2], og det er høy etterspørsel av gode biomarkører for både tidlig oppdagelse og å stratifisere pasienter i henhold til prognose og spådd behandlingstiltak. Imidlertid er CRC en heterogen sykdom, og noen biomarkører har ennå gjort det til rutine klinisk bruk.
Fusion gener representerer en klasse av kreftgener med lovende biomarkør potensial, og når forårsaket av kromosom rearrangements som trans, strykninger eller duplikasjoner, de er vanligvis svært kreftspesifikke. Så langt er det få svært tilbakevendende fusjonsgener blitt identifisert i CRC. Eksempler fra andre krefttyper inkluderer de velkjente
BCR-ABL1
fusjons (Philadelphia kromosom), til stede i 95% av kronisk myelogen leukemi [3], og
TMPRSS2-ERG
som er til stede i rundt 50% av prostatakreft [4]. I noen tilfeller kan fusjonsgenet være et terapeutisk mål, demonstreres ved Imatinib å binde seg til og blokkerer kinasedomenet av BCR-ABL1 fusjonsprotein.
Den første fusjonsgenet rapportert å være gjennomgående i CRC fikseringssekvenser av
VTI1A Hotell og
TCF7L2
, ble rapportert i 2011 [1].
VTI1A-TCF7L2
fusjons transkripsjoner ble oppdaget i tre av 97 (3%) CRC, samt tykktarmskreft cellelinje NCI-H508. I NCI-H508 er fusjon forårsaket av en ~540 kb sletting mellom genene
VTI1A Hotell og
TCF7L2
.
TCF7L2
koder TCF4 transkripsjonsfaktor, som dimerizes med β-catenin. β-catenin er involvert i reguleringen av WNT-signalveien, som ofte endres i de fleste, om ikke alle, CRC [5]. Nedbryting av
VTI1A-TCF7L2
fusjon avskrift resulterte i betydelig tap av forankringsuavhengig vekst i fusjonen positiv CRC cellelinje NCI-H508 [1].
Hyppige mutasjoner i en polyadenine veiene i
TCF7L2
genet har tidligere blitt rapportert for CRC, spesielt i mikro ustabil svulster [6]. Mikro stabile svulster har imidlertid også nylig vist til båtplass hyppige mutasjoner i
TCF7L2
genet, som indikerer en mulig viktig funksjon i CRC biologi [7].
I denne studien har vi rettet å undersøke nærmere tilstedeværelse og varianter av
VTI1A Anmeldelser –
TCF7L2
fusjoner i CRC. Vi har analysert dypt sekvense hele-genom og transkriptom data fra CRC for beslektede fusjoner som involverer en av fusjonspartnere, og for nye fusjonsstoppunkter. Gjentakelse av
VTI1A-TCF7L2
fusjon, og en ny fusjon transkripsjon mellom
TCF7L2 Hotell og romanen partner genet
RP11-57H14.3, etter ble analysert i en serie av CRC og normale prøver.
Materialer og metoder
Material
totalt 106 CRC vevsprøver og 14 sammenkoblede normale prøver fra to uavhengige pasient serien, serie 1 og serie 2, ble undersøkt for tilstedeværelse av fusjons transkripsjoner. Alle CRC er fra pasienter behandlet kirurgisk ved sykehusene i Oslo-området, Norge. De to pasientserie omfattet både mikro stabil (n = 85) og ustabil (n = 20) CRC (en prøve ikke mottok), som bestemt ved tidligere undersøkelser [8] – [10]. Seriene ble anriket for kliniske faser II og III CRC (52 trinn II, 53 stadium III, og en stadium IV). Staging var i henhold til den amerikanske Joint Cancer Komiteen /Union for International Cancer Control (AJCC /UICC). De 14 sammenkoblede normale prøver fra Series 1 ble samlet inn fra visuelt sykdomsfrie områder av colonic slimhinnene. De forskningsbiobanker er registrert i henhold til nasjonal lovgivning, og studien er godkjent av Regional komité for medisinsk forskningsetikk (tall 2781 og 236-2005-16141).
Det er totalt 21 kolorektal cellelinjer var inkludert [11]. Cellelinjene HCT116, HCT15, LoVo, NCI-H508, RKO, SW48 og SW620 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellelinjene Co115, Colo320, EB, fre, HT29, IS1, IS2, IS3, LS1034, LS174T, SW480, TC7, TC71, og V9P ble vennlig levert av Dr. Richard Hamelin, Inserm, Frankrike. Identiteten til cellelinjer ble bekreftet av AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems av Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
I tillegg skjermet vi tjue normalt vev fra diverse områder av kroppen for
TCF7L2
involverer fusion transkripsjoner (adipose, blære, hjerne, cervix, tykktarm, spiserør, hjerte, nyre, lever, lunge, eggstokk, placenta, prostata, skjelettmuskulatur, milt, mage, testikler, thymus, skjoldbruskkjertel og luftrør ; Firstchoice Menneskelig normalt vev Total RNA, hver en pool av RNA fra minst tre personer, med unntak av en enkelt prøve fra magen,. Ambion, Applied Biosystems av Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)
Identifisering av Fusions fra Whole-transkriptom og hel-genom sekvensering av data
parvise end RNA-sekvense data fra sju kolorektal kreft cellelinjer (HCT15, HCT116, HT29, LS1034, RKO, SW48 og SW480) og fra 16 normale vev av diverse opprinnelse ble inkludert i studien. Disse ble alle sekvensert ved hjelp av Illumina GAIIx (cellelinjer) eller HiSeq 2000 (normalt vev, både sequencere fra Illumina Inc., San Diego, CA, USA). De tykktarmskreft RNA-seq data inkludert 220 millioner 76 bp sekvens leser (European nukleotid Arkiv studie tiltredelse ID ERP002049) [12] og normale prøver på mellom 73 og 80 millioner 50 bp sekvens leser per prøve (ArrayExpress tiltredelse id [E-mtab -513] og europeisk nukleotid Arkiv studie [EMBL: ERP000546]). I tillegg har vi fått med parvise end hel-genomsekvenser av cellelinjene HCT15, HCT116, HT29 og SW480 til en gjennomsnittlig dekning på ca 30 × [12] (Data kan gjøres tilgjengelig ved forespørsel til forskere).
En liste over mulige fusjons transkripsjoner ble produsert av uskadelig versjon 0.6.0 [13] på de syv tidligere nevnte RNA-sekvensert cellelinjer i tillegg til barnekonvensjonen cellelinje NCI-H508 (analyse id 0c7a79cc-bbaf-4c6d-93e1-866f5f5f3d0d ) ned fra Cancer Genomics Hub (arrangert av University of California Santa Cruz, CA, USA), data fra Kreftcellelinje Encyclopedia [14] og 16 vev fra Illumina human Body Map v2. For cellelinjer med paret hel-genomsekvens (HCT116, HCT15, HT29 og SW480), RNA fusion utskrifter og DNA-stoppunkter ble identifisert ved nFuse versjon 0.2.0 [15]. En fusjon nominasjon kreves tre spenner lese par og to split leser fra RNA-seq data.
Påvisning av Fusion transkripsjoner av Reverse-transkriptase PCR
For
VTI1A-TCF7L2
fusion, de samme RT-PCR-primere og nestede primere ble anvendt som i den originale publikasjon [1]. For
TCF7L2-RP11-57H14.3
fusjon, ble primere og nestede primere designet for å fusjon transkripsjon stoppunkt sekvens, som er identifisert av uskadeliggjøre, ved å utnytte Primer3 web software [16]. De optimale primer sekvenser (tabell S1) ble ytterligere bestilt fra BioNordika Norge AS (Oslo, Norge) og syntetisert av Eurogentec (Liège, Belgia). Vi utførte følsom nestet RT-PCR med 20 + 30 sykluser for begge analyser ved anvendelse av 50 ng av cDNA fra hver prøve som tilførsel i første runde PCR. Produktene fra den første PCR ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 1/200 i den nestede PCR. Den følgende sykling protokoll ble benyttet for alle PCR-reaksjonene: 15 minutter av HotStarTaq DNA-polymerase aktivering ved 95 ° C, en tre-trinns syklus av denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primersammensmeltning i ett minutt og 15 sekunder ved optimal primer smelte temperaturer (Tabell S1), og forlengelse i ett minutt ved 72 ° C. Etter den siste syklus, ble en avsluttende forlengelsestrinn utført ved 72 ° C i 6 minutter. De nestede-PCR-produktene ble separert ved elektroforese ved 200 V i 30 minutter på en 2% agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromid og UV-lys. Triplikat RT-PCR-forsøk ble utført for begge analysene, å bruke identiske parametre, for alle prøver. Ingen mal negative kontroller ble inkludert fra hver cDNA syntese, første runde PCR og nestet-PCR reaksjoner.
Sanger Sekvensering av Fusion transkripsjon stoppunkter
Prøver som var positive for andre replikere RT-PCR analyser, og viste et enkelt nukleotid bånd på agarosegel, ble sekvensert direkte fra begge sider ved hjelp av både forover og bakover nestede primere. Før sekvensering, de nestede PCR produktene ble renset ved hjelp Illustra Exostar en vise opprydding (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Syklus-sekvenseringsreaksjoner ble utført ved hjelp av BigDye Terminator v.3.1 sykle sekvense kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) etter leverandørens anbefaling. Videre ble sekvenseringsproduktene renset og renset ved anvendelse av BigDye xTerminator (Applied Biosystems), før de ble analysert med kapillær elektroforese ved bruk av ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Sekvensene ble analysert ved hjelp av sekvense Analysis v.5.3.1 programvare.
Vurdering av Identifiserte Genomisk Breakpoint
TCF7L2-RP11-57H14.3
av PCR
genomisk stoppunkt identifisert fra hel-genom sekvense data, kobler
TCF7L2
til
RP11-57H14.3
i tykktarmskreft cellelinje HCT116, ble validert ved hjelp av PCR.
Grunning for genomisk PCR (tabell S1) ble utformet til den genomiske sekvens stoppunkt, som er identifisert ved nFuse, ved hjelp av samme metode som beskrevet ovenfor for RT-PCR-analyser. Tjueen CRC-cellelinjer, blant annet HCT116, ble testet for den identifiserte genomisk knekkpunkt ved anvendelse av 100 ng av DNA som inngang for hver reaksjon. Den følgende sykling protokoll ble anvendt for genomisk PCR: 15 minutter av HotStarTaq DNA-polymerase aktivering ved 95 ° C, en tre-trinns syklus (gjentatt 35 ganger) av denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primersammensmeltning i ett minutt og femten sekunder ved 60 ° C og forlengelse i ett minutt ved 72 ° C. Etter den siste syklus, ble en avsluttende forlengelsestrinn utført ved 72 ° C i 6 minutter. PCR-produktene ble separert ved elektroforese ved 200 V i 30 minutter på en 2% agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromid og UV-lys.
Resultatene
RP11-57H14.3
er en roman Fusion Partner i
TCF7L2
Inneholder Fusion transkripsjoner
for å søke etter
VTI1A-TCF7L2
fusion og romanen fusjonspartnere, analyserte vi parvise end RNA -sequencing data fra åtte tykktarmskreft cellelinjer og seksten normale vevsprøver fra diverse anatomiske områder. Ved å bruke programvaren uskadeliggjøre identifiserte vi mellom 16 og 1050 potensielle fusjons transkripsjoner per prøve. Fra hele genomsekvense data på fire tykktarmskreft cellelinjer, nFuse programvare identifisert mellom 70 og 126 potensielle genomiske stoppunkter. Av alle fusjoner identifisert, bare NCI-H508 næret
VTI1A-TCF7L2
fusjon avskrift, med en eneste stoppunkt som spenner fra ekson to i
VTI1A anbefale til ekson seks i
TCF7L2
som allerede rapportert for denne cellelinje ved Bass et al. [1]. Men vi identifisert et genomisk stoppunkt (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) i CRC cellelinje HCT116 som strakte fra intronic regionen
TCF7L2
til oppstrøms av
RP11-57H14.3
(ENSG00000225292) med en tilsvarende RNA-fusjons (tabell 1).
RP11-57H14.3
ligger i intergeniske regionen mellom
VTI1A Hotell og
TCF7L2
ca 44 kb oppstrøms for
TCF7L2
. De predikerte genomiske brytningspunkt i forhold til økt genomisk dekning i området mellom dem, noe som tyder på en genomisk duplisering forårsaker fusjon (figur 1). Både genomisk stoppunkt og fusjon transkripsjon mellom
TCF7L2 Hotell og
RP11-57H14.3
ble verifisert ved PCR og RT-PCR. Den identifiserte genomiske knekkpunkt ble verifisert i HCT116-cellelinjen, men ikke påvist i noen av de 20 andre cellelinjene som ble testet, for derved å redusere sannsynligheten for at det genomiske stoppunkt reflekterer et felles DNA-kopi-antall polymorfisme.
Tre chimerisk RNA sekvens-leser spredte fusjon transkripsjon stoppunkt, og går fra ekson 4 av
TCF7L2 plakater (ENST00000369395) til ekson 3 av
RP11-57H14.3 plakater (ENST00000428766), på kromosom 10. Mørke farger indikerer eksoner ikke er en del av fusjons transkripsjon. RNA-seq ekspresjon og DNA-seq dekning nivåer er basert på sekvensdata for HCT116-cellelinjen. De to gen loci er merket med blå og røde bokser. Den genomisk stoppunkt sekvens som er identifisert av nFUSE i CRC cellelinje HCT116 er gitt; spenner fra intronic regionen
TCF7L2
til oppstrøms av
RP11-57H14.3
. Koordinatene til stoppunkt (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) er merket på kromosomet posisjon aksen. Plasseringen av stoppunkt korrelerer godt med den økte genomisk dekning sett fra genom sekvense data.
høy forekomst av
TCF7L2
-involving Fusion transkripsjoner, Begge involverer
VTI1A Hotell og
RP11-57H14.3
Gener
ved hjelp av de samme primere som beskrevet av Bass et al. [1] (figur 2), vi har oppdaget
VTI1A-TCF7L2
fusion utskrifter med ulike exon-ekson kombinasjoner i 45 av 106 CRC prøver (42%) (tabell 2). Fusion transkripsjoner ble også påvist fra 4 av 14 normale colonic slimhinnen prøver. Ut av de 14 parvise tumor normale prøver, åtte par var positive kun i tumor, tre par var positive både tumor og normal, og ett par positiv utelukkende i normal (tabell 3). Utbredelse av fusion transkripsjoner var lik i mikro stabile og ustabile svulster. Ti av 21 cellelinjer, inkludert NCI-H508, næret fusion utskrifter av forskjellige størrelser. Til slutt, fem normale vevsprøver fra ulike anatomiske områder av kroppen uttrykte fusjons transkripsjoner (Tabell S2). Fordi RT-PCR resultater viste inkonsistente resultater (Figur S1 og Figur S2), utførte vi alle RT-PCR i tre eksemplarer, med identiske parametre, for å undersøke tilbakefall av fusion transkripsjoner (Tabell S3). Fusion transkripsjoner ble bare påvist konsekvent i alle tre kjører i fire prøver; tre tumorprøver og NCI-H508 cellelinje (3,1% av alle CRC-prøver og cellelinjer). Denne frekvens er lik den som opprinnelig ble identifisert frekvensen av
VTI1A-TCF7L2
transkripter (3%) av Bass et al. [1].
Alle tre gener er plassert innenfor 720
VTI1A, etter ENST00000428766 i
RP11-57H14.3 Hotell og ENST00000369395 i
TCF7L2
. Dessuten er de nestede PCR-analyser som brukes for påvisning av både fusion transkripsjoner vist. De røde og svarte pilene representerer første runde og andre runde primere benyttet, henholdsvis.
Kjøp
Vi oppdaget
TCF7L2-RP11-57H14.3
fusion utskrifter med forskjellige exon-ekson-kombinasjoner i 48 ut av 106 CRC prøver (45%, tabell 2). Ut av de 14 parvise tumor normale prøver, fem par var positive kun i tumor, og fire par var positive både tumor og normal (tabell 3). 19 av 21 cellelinjer, næret fusion utskrifter av forskjellige størrelser. Også 15 av 20 normale vevsprøver var positive for fusjons transkripsjoner (Tabell S2). Som med
VTI1A-TCF7L2
fusion, utførte vi alle RT-PCR i tre eksemplarer for å undersøke tilbakefall av fusion transkripsjoner (Tabell S3). Totalt var det 20 prøver som gjentatte ganger testet positivt for fusjons transkripsjoner; seks tumorprøver, fem prøver fra normalt vev og ni cellelinjer (inkludert HCT116 cellelinje). Interessant, NCI-H508-cellelinjen var negativ for
TCF7L2-RP11-57H14.3
fusion transkripsjoner i alle tre gjentak.
Vi fant ingen sammenheng mellom CRC positive for
TCF7L2
inneholder fusion transkripsjoner involverer
VTI1A Hotell og
RP11-57H14.3 product: (p = 0,33; Fishers Exact test). Videre frekvensene av fusjons transkripsjoner var ikke signifikant forskjellig mellom mikro ustabil
vs.
Stabile svulster, og heller ikke mellom kliniske stadier (data ikke vist).
All nestet-PCR gjentak for begge analysene inne negative templat-kontroller. Disse negative kontrollreaksjoner aldri produsert påvisbare PCR-produkter (Figur S1 og S2).
kimære Sekvenser Vanligvis Dekket Intakte Exonic Splice nettsteder fra partner Gener
Fra en av RT-PCR kjører, alle prøver som var positive for fusjoner og hadde et enkelt PCR produkt ble valgt for Sanger-sekvensering av de kimære RNA-sekvenser for å identifisere den eksakte stoppunkter. For
VTI1A-TCF7L2 plakater (n = 25), har vi oppnådd sekvenser fra alle 25 slike isolerte fusjonstranskripsjons RT-PCR-produkter, hvor 24 ut av 25 hadde sekvenser som forbinder oppstrømssekvensene av eksonene 1, 2, 3, 5 eller 7 av
VTI1A anbefale til nedstrøms sekvensene av eksoner 4 eller 6
TCF7L2
, med bevaring av de samme ekson-ekson grenser som i de allerede kommenterte genet strukturer (ENST00000393077 i
VTI1A Hotell og ENST00000369395 i
TCF7L2
). En sekvensert produktet ikke inneholder klare exon-ekson grenser, men koblet de to transkripsjoner i midten av ekson 7 i
VTI1A Hotell og seks i
TCF7L2
. I alt ble syv ulike fusion stoppunkter identifisert (tabell S3) inkludert det opprinnelige stoppunkt mellom exon 2 av
VTI1A Hotell og ekson 6 av
TCF7L2
i NCI-H508 (figur 3) [1] . Dette eksakte stoppunkt ble ikke funnet i noen av de andre prøvene, men de fleste av de intakte fusjons transkripsjoner besto av den samme delen av
TCF7L2 product: (n = 17) med noen som har exon 4 av
TCF7L2
skjøtes til ekson 6 (n = 7).
VTI1A
oppstrøms bidrag variert mer, har fem forskjellige kombinasjoner som kobler seg til nedstrøms
TCF7L2
deler.
Sanger-sekvensering bekreftet den opprinnelige fusjons transkripsjon oppdaget i NCI-H508, som viser stoppunkt sekvens spenner exon-ekson overganger mellom exon 2 i
VTI1A Hotell og exon 6 i
TCF7L2
. Bass et al. også oppdaget tre andre fusion transkripsjoner av nested-PCR. Men som avskrift merknad ikke var tilstrekkelig beskrevet, er vi ikke i stand til å si om disse fusjoner er identiske med noen av transkripsjoner vi har identifisert.
For
TCF7L2-RP11-57H14.3 product: (n = 27), fikk vi sekvenser fra alle 27 isolerte fusjon transkripsjon RT-PCR-produkter, hvor 26 av 27 hadde sekvenser sammenhengende sekvenser av exon 4 av
TCF7L2
til sekvenser av eksoner 1, 2 eller 3 av
RP11-57H14.3
, også med bevaring av de samme ekson-ekson-grenser som i de allerede merkede genet strukturer (ekson nummereringen er den samme som ovenfor for
TCF7L2
og ifølge ENST00000428766 for
RP11-57H14.3
). En nysgjerrig tilfelle av kimære sekvens, identifisert i CRC cellelinje fre, var en fusjon transkripsjon spenner over tre gener i en ikke-kanoniske genomisk orden, bli med
TCF7L2
exon 4 med
VTI1A
eksoner 5 , 6, og 7, og videre strekker seg inn i
RP11-57H14.3
eksoner 1, 2 og 3. også i dette tilfellet unike de samme exon-ekson-grenser ble anvendt som i de allerede merkede genet strukturer som beskrives over. I alt ble fire ulike fusion transkripsjoner identifisert som involverer
TCF7L2-RP11-57H14.3, etter alt som forekommer i flere prøver hver.
Diskusjoner
Vi har i denne rapporten identifisert genet
RP11-57H14.
3 som en roman fusjonspartner for
TCF7L2
i CRC. Ved følsom nestet RT-PCR, har vi avdekket at begge de tidligere rapporterte
VTI1A-TCF7L2
fusion transkripsjoner, og heri identifisert
TCF7L2-RP11-57H14.3
, er svært utbredt blant CRC selv om uttrykt på lave nivåer. Vi har også oppdaget at ekspresjon av fusjons transkripsjoner i normale kolon mukosa, så vel som i normale vev fra andre anatomiske steder. Triplikate nestet-PCR for å undersøke tilstedeværelse av
TCF7L2
involverer fusion transkripsjoner viste varierende resultater, med noen prøver i utgangspunktet å ha testet positivt for en fusjon avskrift, men negativ når du utfører et sammenhengende løp, eller
vice-versa
. Men Sanger-sekvensering førte til bekreftelse av ren ekson til ekson stoppunkt veikryss, redusere sannsynligheten for at PCR gjenstander, slik som polymerase mal veksling [17], som en årsak til inkonsekvens. Negative kontroller ble også utført ved alle RT-PCR skritt, inkludert cDNA syntese, første runde PCR og nestet-PCR. Ingen av de negative kontrollene resulterte i påviselige produkter, som støtter at den høye frekvensen av fusjons transkripter observeres er ikke et resultat av PCR-kontaminering (figur S1 og S2 figur). Selv om fusjons transkripsjoner ble funnet ved høy frekvens i løpet av de testede biobankmateriale, identifisering av
TCF7L2
holdige fusjoner fra hel-transkriptomet sekvense data var bare lykkes fra de to cellelinjer med matchende genomiske stoppunkter. Disse to cellelinjer ble også ha gjennomgående sterk ekspresjon av fusjons transkripter, da de produserte konsistente og klare RT-PCR-resultater i alle replikater. Basert på disse resultatene, foreslår vi at fusjons transkripsjoner produsert mellom
TCF7L2 Hotell og enten
VTI1A
eller
RP11-57H14.3
er uttrykt i lave nivåer i tumorprøver, og noen normale prøver. Tilstedeværelsen av fusjons transkripsjoner uttrykt ved lave nivåer er forenlig med tre fusion transkripsjoner vi nylig identifisert i CRC, der
AKAP13-PDE8A, COMMD10-AP3S1, etter og
CTB-35F21.1-PSD2
ble identifisert i 17-58% av 106 primære kreft vev [12].
Alle de tre partner genene er lokalisert på den lange arm av kromosom 10, innen 721 kbp, og er alle lese fra samme tråd i for
VTI1A, RP11-57H14.3, TCF7L2 plakater (figur 2). Dette tyder på RNA-polymerase gjennomlesning som en potensiell mekanisme for generering
VTI1A-TCF7L2
transkripter i fravær av en tilsvarende genomisk stoppunkt. Flere rapporter har vist at gener i umiddelbar nærhet i det humane genomet er uttrykt som sammenhengende gener, også kalt tandem kimærer, transkripsjoner som er kombinert med minst en del av en exon fra to eller flere distinkte gener som ligger på samme kromosom [18] – [20]. Det har blitt foreslått at ekspresjon av gener sammenhengende øke kompleksiteten av det humane genomet ved å oversette til forskjellige proteiner, eller at disse transkriptene spille en rolle i regulering av kanoniske transkripsjonsnivåer. Én foreslått mekanisme for deres produksjon er at transkripsjon maskineri unngår termineringssignalet av oppstrøms genet og fortsetter å transkribere den nedstrøms genet før terminering ved nedstrømstermineringssignalet [19], [21]. De fleste av de sammenhengende genene er antatt å bli uttrykt ved lave nivåer, fordi de ofte er understøttet av bare en enkelt uttrykte sekvens-tag eller mRNA sekvens i genomet databaser, noe som er i samsvar med våre observasjoner av svakt uttrykt
TCF7L2
holdige fusion transkripsjoner i CRC.
den generasjonen av
VTI1A-TCF7L2
transkripsjoner kan godt forklares som et produkt av polymerase lese gjennom, men dette kan ikke være mekanismen av drift for
TCF7L2-RP11-57H14.3
fusion transkripsjoner. I dette tilfellet, eksoner av
TCF7L2 Hotell og
RP11-57H14.3
skjøtes sammen i en ikke-kanoniske genomisk for å bruke konsensusspleise-sider. Denne transkripsjonen mekanisme er tidligere blitt beskrevet av Nigro et al. som exon scrambling; en prosess hvor eksoner er forbundet nøyaktig ved konsensus-spleiseseter, men i en annen rekkefølge enn den som er tilstede i det primære transkript [22]. De oppdaget dette fenomenet når etterforsker en kandidat tumor suppressor genet (
DCC
), og funnet ut at de resulterende egge transkripsjoner er uttrykt og funnet på relativt lave nivåer i både normale og neoplastiske celler. Nylig, basert på dyp sekvensering av RNA ble slike egge transkripsjoner fra hundrevis av gener identifisert [23]. Denne gruppen også antydet at en betydelig del av de omkastede transkriptene er sirkulære RNA, som forklarer sammenføyning av eksoner i et ikke-kanonisk lineær rekkefølge. De fant også at mange av de sirkulære isoformene var til stede på et nivå tilsvarende til sine kanoniske lineære kolleger.
Til sammen disse lagt nivåer av transkripsjonen og genomisk kompleksitet er i tråd med den siste rapporten fra KODE prosjektet, rapporterer betydelig reduksjon i lengdene av intergeniske regioner, og i økende grad overlapp av gener tidligere antatt å være distinkt genetisk loci, helt spørre en omdefinering av begrepet et gen [24].
Identifiseringen av genomisk stoppunkter i enkelte cellelinjer for
TCF7L2
fusjoner både involverer
VTI1A Hotell og
RP11-57H14.3
, er spennende. De genomiske stoppunkter identifisert sammenfaller godt med hyppig observerte fusion transkripsjoner oppdaget i andre prøver som ikke har slike genomiske rearrangements. For cellelinjer med identifiserte genomiske brytningspunkt, ble fusjons transkripsjoner oppdaget på sterke nivåer i alt RT-PCR gjentak, noe som tyder på at disse cellene uttrykker fusjons transkripsjoner på høyere nivåer. Videre cellelinjen med
VTI1A-TCF7L2
genomisk fusion (NCI-H508) ble negativt for
TCF7L2-RP11-57H14.3
fusion transkripsjoner i alle replikater, støtter ~540 kb genomisk sletting av intergeniske regionen mellom
VTI1A Hotell og
TCF7L2
opprinnelig identifisert av Bass et al.
tilstedeværelsen av fusjons transkripsjoner i både normale celler og CRC prøvene sammen med identifisering av genomisk stoppunkter fra enkelte kreftcellelinjer, bli de samme to gener på genomet nivå, er i tråd med rapporten fra fusjon transkripsjon
JAZF1-JJAZ1
identifisert i både normale endometrial stromale celler og endometrial stromal tumor [25].
JAZF1-JJAZ1
er synlig på karakterutskriften nivå i normal livmor stromale celler, men genomiske rearrangements finnes bare i de neoplastiske cellene. Li et al. hypotese at trans-spleising generering av disse fusjons transkripter, så vel som andre fusjons transkripter, kan det forekomme ofte i normale celler og vev. Videre foreslår de at det kan være en sammenheng mellom trans-spleising genererer disse fusion utskrifter og generering av genomisk rearrangements [26]. De genomiske rearrangements eller andre mekanismer kan føre til overekspresjon av disse fusion utskrifter som kan ha onkogene potensiale.
Betydningen av genet
TCF7L2
i CRC utvikling er foretrukket av sin funksjon.
TCF7L2
koder TCF4 transkripsjonsfaktor, som er en viktig nedstrøms transkripsjonsfaktor i Wnt /β-catenin-signalveien, endret i de fleste CRC [5]. Den opprinnelige rapport
VTI1A-TCF7L2
funnet at nedbrytning av fusjonstranskriptet resulterte i signifikant tap av forankringsuavhengig vekst i fusjons positiv CRC-cellelinje NCI-H508 [1]. Hyppige mutasjoner i en polyadenine veiene i
TCF7L2
genet har tidligere blitt rapportert for CRC, spesielt i mikro ustabil svulster [6]. Videre har mikro stabile svulster nylig vist til båtplass hyppige mutasjoner i
TCF7L2 product: [7]. Observasjonen at
TCF7L2
involverer fusion transkripsjoner kan påvises i en så stor andel av CRC prøver, men også normal tarmslimhinnen og andre typer normale vev, avslører at
TCF7L2
fusion transkripsjoner er verken spesifikke til kreft eller til kolon og rektum. Derfor trenger de ikke har potensial som kreft gjenkjenning biomarkører som opprinnelig forventet.
