Abstract
Bakgrunn
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i vestlige land. Utvikle mer effektive NSCLC terapeutika krever klarlegging av den genetiske og biokjemiske baser for denne sykdommen. Bronchioalveolar stamceller (BASCs) er en antatt kreftstamcelle befolkningen i musemodeller av onkogene
K-ras
indusert lunge adenokarsinom, en histologisk subtype av NSCLC. Signalene aktiveres av onkogene K-ras som medierer BASC utvidelse er ikke fullstendig definert.
Metodikk /hovedfunnene
Vi brukte genetiske og farmakologiske tilnærminger for å modulere aktiviteten av phosphatidylinositol 3-kinase ( PI3K), en viktig formidler av onkogene
K-ras, etter i to genetiske musemodeller av lunge adenokarsinom. Onkogen
K-ras
-indusert BASC opphopning og tumorvekst ble blokkert ved behandling med et lite molekyl PI3K-inhibitor og forbedret ved inaktivering av
fosfatase og tensin homolog slettet fra kromosom 10
, en negativ regulator av PI3K
Konklusjon /Betydning
Vi konkluderer med at PI3K er en kritisk regulator av BASC ekspansjon, støtte behandlingsstrategier for å målrette PI3K i NSCLC
Citation:.. Yang Y , Iwanaga K, Raso MG, Wislez M, Hanna AE, Wieder ED, et al. (2008) phosphatidylinositol 3-kinase som megler Bronchioalveolar Stem Cell Ekspansjon i mus modeller av onkogene
K-ras
indusert lungekreft. PLoS ONE 3 (5): e2220. doi: 10,1371 /journal.pone.0002220
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, USA
mottatt: 27 desember 2007; Akseptert: 14. april 2008, Publisert: 21. mai, 2008
Copyright: © 2008 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. R01 CA117965 , R01 CA105155, U01 CA105352
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den ledende. årsaken til kreft-dødsfall i vestlige land og dets forekomst er økende i Asia. Når den har metastasert, er det ingen helbredende terapi for NSCLC. En bedre forståelse av patogenesen og risikofaktorer for denne sykdommen vil bidra ikke bare til forbedringer i tidlig oppdagelse og forebygging, men også til utvikling av mer effektive behandlinger for det.
Om lag 10% av NSCLC prøvene bære aktiverende mutasjoner i
K-ras product: [1]. Den histologisk subtype av NSCLC som oftest har
K-ras
mutasjoner er adenokarsinom; 30% av adenocarcinomer har disse mutasjonene.
K-ras
mutasjoner har også blitt identifisert i atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH) lesjoner, som antas å gå foran utviklingen av lunge adenokarsinom [2]. En voksende mengde bevis indikerer at
K-ras
mutasjoner er viktig i initiering av lunge adenokarsinom utvikling. Musemodeller har blitt utviklet som uttrykker mutant
K-ras
betinget, somatisk eller å indusere [3] – [7]. Disse musene utvikler AAH lesjoner raskt og med høy penetrans, og en undergruppe av disse lesjonene utvikle seg til adenokarsinomer.
En kandidat kreft stamfar lungeceller (bronchioalveolar stamcelle eller BASC) har blitt identifisert i murine modeller av
K-ras
indusert lungekreft. BASCs har et bestemt mønster av stamcelle markør uttrykk (Sca-en
pos CD34
pos CD45
neg PECAM
neg), er plassert ved terminalen bronkiene, og har kapasitet til å fornye seg selv og gjennomgå fler linage differensiering [8]. Disse cellene kan være den samme som den variant Clara (eller Clara
V) celler, som er plassert ved siden av klynger av neuroendokrine organer i bronkiene og bronkiolene. I likhet med BASCs, Clara
V-celler er i stand til å gjenopprette den Clara cellepopulasjon etter naftalen skade [9]. Etter intra-nasal installasjon av adenoviral Cre i Kras
LSL mus, som utvikler lunge adenokarsinom på grunn av aktivering av en betinget onkogene
K-ras
allel [5], BASCs raskt spre seg før utviklingen av histologisk abnormaliteter [8]. De BASCs i disse mus inneholde
K-ras mutasjoner
identiske med de som finnes i tumorer [8]. På grunnlag av disse bevisene er BASCs postulert å være forløpere av lunge adenokarsinom i mus. De biokjemiske signaler som initierer den utvidelse av denne cellulære populasjon er ikke fullstendig klarlagt. Denne mangel er viktig gitt at klarlegging av disse signalene kan føre til bedre behandling for NSCLC.
premaligne lesjoner vanligvis gjennomgå en forbigående utvidelse etterfulgt av programmert senescence, og bare et mindretall av tidlige lesjoner utvikler seg til et fullt forvandlet tilstand. I tilfelle av Ras-avhengige cancer musemodeller, er programmert senescens av premaligne lesjoner aktivert av mitogen-aktivert protein kinase kinase /ekstracellulære signalregulerte kinase signalering, som inhiberer Ras via feed-back baner som involverer økt ekspresjon av SPROUTY proteiner, Ras GTPase-aktiverende proteiner, og mitogen-aktivert proteinkinase-fosfatase-3 [10]. Den begynnende alderdom programmet i premaligne lesjoner kan bli blokkert av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) aktivering [10], noe som indikerer at PI3K er en avgjørende faktor for den ondartede progresjon av disse lesjoner. Faktisk er PI3K signale konstitutivt aktivert i NSCLC cellene gjennom inactivating somatiske mutasjoner i, eller epigenetisk stanse av,
fosfatase og tensin homolog slettet fra kromosom 10 plakater (
PTEN
), et lipid fosfatase som negativt regulerer PI3K signalkaskade [11] – [15]
i denne studien evaluerte vi viktigheten av PI3K i å regulere utvidelse av BASCs i to genetiske musemodeller av onkogene
K-ras-.
indusert lungekreft. De onkogene
K-ras
alleler i disse modellene er aktivert somatisk i en (Kras
LA1) og betinget i den andre (Kras
LSL) (5, 7). Vi har funnet økt antall BASCs i disse mus i forhold til de av villtype-kullsøsken. BASC ekspansjon og ondartet progresjon i lungen ble svekket av farmakologisk hemming av PI3K og forsterkes av genetisk inaktivering av
PTEN
. Vi spekulerer på grunnlag av disse funnene som farmakologiske strategier for å hemme PI3K vil være nyttig i forebygging og behandling av NSCLC.
Resultater
PX-866 hemmer lunge tumorigenesis i Kras
LA1 mus
Vi postulert at PI3K er nødvendig for ondartet progresjon i lungekreft og testet denne hypotesen ved hjelp Kras
LA1 mus som modell for lunge tumorigenesis. Flere uker etter fødselen, Kras
LA1 mus utviser multifokale AAH lesjoner som ved 2-3 måneders alder, vokser sammen til faste eller papillær adenomer, som forstørre og gjennomgår histologisk transformasjon til adenokarsinomer etter 6-8 måneder [7]. Vi først evaluert uttrykk for PI3K (p110α og beta isoformer) i lunge vev på ulike stadier av tumordannelse (AAH, adenom, eller adenokarsinom). Disse PI3K isoformene ble oppdaget og deres overflod økt med ondartet progresjon (AAH lesjoner
versus
adenokarsinomer:
P
= 0,006 for p110α;
P
0,001 for p110β) ( Figur 1A).
(A) PI3K uttrykk øker med ondartet progresjon. Representant immunhistokjemisk farging av lesjoner i vevet microarray og deres kvantifisering i tilstøtende søylediagrammer. Kalibrering bar i panelet nederst til høyre representerer 100 mikrometer. Resultater av blandede (fast /papillær) adenomer er inkludert i søylediagrammer, men ikke i PI3K fargebilder. (B) PI3K er nødvendig for tumorvekst. Gjennomsnittlige endringer i tumor mangfoldighet og volumet bestemmes ved mikrodatamaskinstyrt tomografi utført før og etter behandling. (*
P
0,05 sammenlignet med kjøretøy). (C) PX-866 hemmer PI3K i lungevev. Western blotting av Ser473-fosforylert AKT (P-AKT) og Ser21 /9-fosforylert gsk3 (P-GSK3α /β) i hele lunge lysatene fra mus (n = 7 i hver behandlings kohort). Plassering av molekylære markører vises på venstre side. (D) PX-866 reduserer tumorcelle-proliferasjon. Representant immunhistokjemisk farging av Ser28-fosforylert histon H3 (P-H3) i adenomer i vevet microarray (x 20 forstørrelse, områder med positive celler omkranset) og kvantifisering av flekker i 16 lesjoner fra kjøretøy-behandlede mus og 4 lesjoner fra PX-866 behandlede mus (søylediagram, *
P
0,05 sammenlignet med kjøretøy). Inset illustrerer omkranset celler ved × 40 forstørrelse. Kalibrerings barer representerer 200 mikrometer.
Basert på den økte overflod i fullt transformerte celler, vi neste søkt å fastslå om PI3K var nødvendig for tumorvekst. Behandling av K-ras
lesjonsvolumet LA1 mus med PX-866, en PI3K inhibitor [16], nedsatt lunge og mangfold (figur 1B). Dette ble fulgt ved reduksjon i PI3K-aktivitet, som vist ved Western blotting av hel-lunge lysatene for fosforylert AKT og glykogensyntasekinase-3 (figur 1C). Tumorceller gikk en reduksjon i proliferasjon forårsaket av PX-866 basert på intra-angrepne fosforylert histon H3 (figur 1D), men viste ingen biokjemiske tegn på apoptose som vist ved western blotting for spaltede caspase-3 og Poly (ADP-ribose) polymerase ( data ikke vist). Dermed behandling med en PI3K antagonist dypt hemmet veksten av disse tidlige lesjoner.
BASCs er svært følsomme for PX-866
in vivo Hotell og
in vitro
Vi neste fastslått om den anti-tumor effekt av PX-866 i Kras
LA1 mus var delvis på grunn av hemming av BASC ekspansjon. Ved terminalen bronkiene, en undergruppe av epitelceller uttrykt både clara cellespesifikke protein (ccsp) og overflateaktivt middel protein-C (SPC) (figur 2), som er et kjennetegn på BASCs [8]. Kvantifisering av dual-positive celler i villtype mus (med 83 bronkiene) og K-ras
LA1 mus (med 66 bronkiene) avslørte at ingen villtype mus hadde mer enn 3 BASCs per terminal bronkie, mens en undergruppe av terminal bronkiene i K-ras
LA1 mus hadde 4-7 (
P
= 0,042, vill-type
versus
Kras
LA1) (figur 2). Dermed en undergruppe av terminal bronkiene i Kras
LA1 mus hadde BASC ekspansjon. Videre trippel immunfluorescens studier viste at BASCs uttrykt p110α og hadde påvisbare fosforylering av AKT (figur 3), en nedstrøms formidler av PI3K, og gir bevis for PI3K-aktivering i disse cellene. Ved hjelp av vevssnitt fra Kras
LA1 mus behandlet med PX-866 (med 88 terminal bronkiene) eller kjøretøy (med 81 terminal bronkiene), bestemt vi antall BASCs per terminal bronkie i behandlingsgruppene. Bilen behandlede mus hadde en undergruppe av terminal bronkiene med 4 til 7 BASCs per terminal bronkie, mens ingen av PX-866-behandlede mus hadde mer enn tre BASCs per terminal bronkie (
P
= 0,025, kjøretøy
versus
PX-866-behandlet) (figur 4).
Immunofluorescent farging for å påvise celler ved terminal bronkiene som co-express CCSP og SPC. Omkranset BASCs i toppfeltene (x10 forstørrelse) illustrert i nedre paneler ved høyere forstørrelse (x40). Søylediagram indikerer prosenter av terminal bronkiene med de angitte antall BASCs. Kalibrerings barer i bilder av H E farget vev representerer 50 mikrometer
Immunofluorescent farging av vevssnitt til å oppdage triply farget (CCSP /SPC /p110α eller Pakt) celler ved terminal bronkiene.. BASCs omkranset (x40 forstørrelse). Kalibrering bar i panelet nederst til høyre representerer 50 mikrometer.
Immunofluorescent farging for å påvise celler ved terminal bronkiene som co-express CCSP og SPC. Omkranset BASCs i toppfeltene (× 10 forstørrelse) illustrert i nedre paneler ved høyere forstørrelse (× 40). Søylediagram indikerer prosenter av terminal bronkiene med de angitte antall BASCS. Kalibrerings barer i bilder av H E farget vev representerer 50 mikrometer
For å finne ut om PX-866 hadde direkte effekter på Kras
LA1-derived BASCs, vi brukte primære basc kulturer, som var. isolert fra lungene til Kras
LA1 mus ved å sortere for celler som var Sca-en
pos, CD34
pos, CD45
neg, og CD31
neg. Disse sorterte cellene ko-uttrykt ccsp og SPC (figur 5A), som dannes kolonier når sådd ut på mate kulturer (figur 5B), og viste multi-potensial differensiering kapasitet når sådd ut i matrigel (figur 5C), som er kjennetegnene til BASCs [8] . PX-866 behandling førte til en fremtredende nedgang i BASC kolonidannende aktivitet (figur 5D), noe som indikerer at PX-866 hadde en direkte effekt på BASCs.
(A) Sortert celler co-express SPC og CCSP. Kras
LA1 hele lunge vev ble dissosiert og sortert for å isolere Sca-en
pos CD45
neg CD31
neg CD34
pos celler (P4 og P5 i venstre og midtre paneler, henholdsvis), som ble underkastet immunofluorescerende farging (x40 forstørrelse, høyre panel). Kalibrering bar i panelet til høyre representerer 10 mikrometer. (B) BASCs danne kolonier når belagt på mater kulturer. Fotografi av kolonien (x10 forstørrelse) dannet ved første plating (P1) og passasje 2 (P2). Kalibrering bar i panelet på høyre representerer 50 mikrometer. (C) BASCs skille når belagt i matrigel. Cellene ble farget etter 7 dager i matrigel (x10 forstørrelse) og antall celler med funksjoner i alveolar type II celler (CCSP
neg SPC
pos), clara celler (CCSP
pos SPC
neg ), ble eller BASCs (CCSP
pos SPC
pos) telles og uttrykt som prosentandelen av de totale 158 telte celler i et kakediagram. Eksempler på celler med funksjoner i ATII celler (ATII) og Clara celler (CC) er indikert. Kalibrering bar i panelet til høyre representerer 50 mikrometer. (D) PX-866 hemmer BASC kolonidannelse. Fotografier (x10 forstørrelse) og kvantifisering av kolonier pr brønn (5 brønner pr tilstand) dannet etter 6 d i nærvær eller fravær av PX-866. Kalibrering bar i panelet på høyre representerer 50 mikrometer.
PTEN
mangel forbedrer onkogene
K-ras
indusert BASC opphopning
Som en annen tilnærming til å vurdere hvilken rolle PI3K i BASC ekspansjon, vi inaktivert
PTEN
, en negativ regulator av PI3K, i CCSP-uttrykke celler.
PTEN
ble genetisk inaktivert ved hjelp av
PTEN
FLOX /+ mus, som har en
PTEN
allel som inneholder
loxP
områder rundt PTEN fosfatase domene kodet for av exon 5 [17].
PTEN
ble saman spesielt i lungene ved kryssing disse musene med CCSP
Cre /+ mus som uttrykker Cre under kontroll av
CCSP
genet [18]. I tillegg vurderte vi om
PTEN
inaktive samarbeidet med onkogene
K-ras
å fremme BASC ekspansjon.
PTEN
-deficient mus ble blandet seg med K-ras
LSL mus, der uttrykk for onkogene
K-ras
G12D
styres av en flyttbar transkripsjonsterminerings STOP element [5]. Ved hjelp av denne tilnærmingen, ble musene generert med bronkiene som
PTEN
-deficient (PTEN
Δ5 /Δ5; CCSP
Cre /+), uttrykker onkogene
K-ras product: ( Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+), har
PTEN
mangel og onkogene
K-ras
uttrykk (PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+), eller har verken (PTEN
FLOX /FLOX; CCSP
+ /+). Mus ble ofret på 4 uker eller 12 uker, og deres tette vev ble utsatt for immunofluorescence studier for å kvantifisere BASCs.
Som forventet, triple immunfluorescens farging (CCSP /SPC /PTEN) viste tap av PTEN uttrykk i BASCs fra mus som var både
PTEN
-deficient og
K-ras
transformerte (PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+) men ikke i mus som bare var
K-ras
transformerte (Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+) (figur 6). Kvantifisering av BASCs per terminal bronkie på 4 uker viste at
PTEN
-deficiency alene (PTEN
Δ5 /Δ5; CCSP
Cre /+) var ikke tilstrekkelig til å endre BASC tall i forhold til at av kontroll mus (PTEN
FLOX /FLOX; CCSP
+ /+) (figur 7). Men sammenligningen av basc tall i PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+ mus til det i Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+ mus viste at
PTEN
mangel påfallende forbedret BASC utvidelse av onkogene
K-ras product: (
P
= 0,006, PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+
versus
Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+) (figur 7). I tillegg til disse funnene på terminalen bronkiene, klynger av CCSP
pos SPC
pos celler ble observert i bronkiolene og små bronkiene av PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+ mus; disse cellegruppene var tydelig så tidlig som 4 ukers alder, og var ikke til stede i bronkiene eller bronkiolene av Kras
Lox /+; CCSP
Cre /+ mus (Figur 8). Vi konkluderer med at
PTEN
inaktive samarbeidet med onkogene
K-ras
å forbedre BASC opphopning.
Immunofluorescent farging av vevssnitt å oppdage triply farget (CCSP /SPC /PTEN) celler ved terminal bronkiene. BASCs (omkranset) illustrert med 10x forstørrelse. Kalibrering bar i panelet nederst til høyre representerer 100 mikrometer.
Immunofluorescent farging for å påvise celler på terminal bronkiene som co-express CCSP og SPC. BASCs (omkranset) illustrert ved × 40 forstørrelse. Søylediagram indikerer prosenter av terminal bronkiene med de angitte antall BASCS. Kalibrering bar i panelet nederst til høyre representerer 100 mikrometer.
Immunofluorescent farging for å påvise celler som co-express CCSP og SPC. BASCs (omkranset) illustrert med 10x forstørrelse. Søylediagram illustrerer prosenter av bronkiene med de angitte antall BASCS. Kalibrering bar i panelet nederst til høyre representerer 100 mikrometer.
Diskusjoner
Her er vi rapportere at PI3K var nødvendig for BASC utvidelse initiert av onkogene
K-ras
og, når konstitutivt aktiveres av
PTEN
inaktivering, samarbeidet PI3K med onkogene
K-ras
i denne prosessen. Denne konklusjonen var basert på funn fra eksperimenter som innlemmet farmakologiske og genetiske metoder for å målrette PI3K i to ulike genetiske musemodeller og en
in vitro
modell. Vi har tidligere rapportert at
PTEN
inaktive samarbeider med onkogene
K-ras
å akselerere lunge tumorigenesis, forårsaker lungesvulster som er mer histologisk avansert og raskere hindrer bronkial lumina og erstatte alveolarområdene enn de av mus med onkogene
K-ras
alene [18]. Sammen utgjør disse funnene øke muligheten for at PI3K fremmet lunge tumorigenesis gjennom sine effekter på BASCs. Imidlertid vil avgjørende bevis i denne forbindelse kreve bevis for at adenokarsinomer oppstår fra BASCs. Transplantasjonsstudier for å fastslå hvorvidt basc injeksjoner er tilstrekkelig til å rekapitulere lunge adenokarsinom utvikling i mus har hittil ikke blitt rapportert. En stamcelle befolkningen har blitt identifisert i lungene til mus og i svulster fra NSCLC pasienter som uttrykker CD133, utstillinger stamcelleegenskaper
in vitro-plakater (former kuler og kan bli overtalt til å gjennomgå terminal differensiering), og er tumorigent i nakne mus [19]. Selv om visse trekk som stamcelle befolkningen er lik de av BASCs (dvs. respons på naftalen-indusert lungeskade), forblir deres forhold skal belyses.
Når startes under embryogenese, betinget
PTEN
inaktivering i lungen fører til hypoksi og perinatal død, noe som indikerer at
PTEN
ekspresjon er nødvendig for normal utvikling lunge [20]. I denne studien Cre uttrykk i CCSP
Cre mus begynte på postnatal dag fire, slik at vi kan vurdere
PTEN
rolle i å opprettholde lungefunksjon etter fødselen. Selv om vi ikke kan utelukke at subtile endringer i lungefunksjon skjedde,
PTEN
-deficient mus i denne studien hadde ingen åpenbare endringer i sin lunge struktur og viste ingen sykelighet på opp til 12 måneders alder, noe som tyder at etter fødselen, kan lunge vev fungere normalt uten
PTEN
. Denne åpen elastisitet av lunge vev til
PTEN
mangel står i kontrast til voksne blodkreft stamceller, som er utarmet innen 40 dager etter at inaktivering av
PTEN product: [21], noe som indikerer at selvfornyelse egenskapene til blodkreft stamceller kan ikke opprettholdes i fravær av PTEN negative vekst regulatoriske signaler. Selv om årsakene til denne forskjellen er ikke klare, kan det være relatert delvis til den relative infrequency med hvilken lunge stamceller som normalt deler [9].
PI3K er blitt rapportert å spille en viktig rolle i tumorgenese initiert etter onkogene
K-ras
. Kras
LA2 mus som har en knock-in
PIK3CA
mutasjon som blokkerer samspillet av PI3K med K-ras utvikle langt færre lungesvulster enn gjør Kras
LA2 mus med vill-type
PIK3CA product: [22], noe som indikerer en nøkkelrolle for PI3K som en nedstrøms formidler av K-ras. Bekreftende dette punktet, fant vi at PX-866 behandling hemmet tumorvekst lunge i Kras
LA1 mus. Men basert på andre funn rapporteres her, viktigheten av PI3K i
K-ras
indusert lunge tumorigenesis kan ikke være begrenset til sin rolle som en nedstrøms formidler av K-ras. Først økte PI3K uttrykk som Kras
LA1 lunge vev gikk ondartet progresjon fra AAH til adenokarsinom, noe som tyder på at PI3K ble aktivert i disse histologisk avanserte lesjoner delvis gjennom K-ras-uavhengige mekanismer. For det andre funn rapporteres her og andre steder [18] indikerer at
PTEN
inaktive forbedret onkogene
K-ras
indusert lunge tumorigenesis hos mus. Ekstrapolering fra disse funnene, somatiske mutasjoner i NSCLC celler involverer gener som regulerer PI3K avhengig signale (dvs.
PTEN, EGFR
, og
PIK3CA
, blant annet [ref. 23]) kan forvandle disse celler i en del av samarbeidet med onkogene
K-ras
. Den potensielle betydning av sekundære somatiske mutasjoner i å fremme onkogene
K-ras
-indusert lunge tumorigenesis er illustrert ved de lange ventetider for adenokarsinomer som oppstår i mus konstruert for å uttrykke mutant
K-ras
, hvilken utvikle lungelesjoner raskt og med høy penetrans, men bare en brøkdel av lesjoner videre til adenokarsinomer og krever flere måneder å gjøre det [3] – [7]
Funnene presenteres her avvek fra det som er rapportert tidligere i en. annen stamme av mus som gjennomgår betinget
PTEN
sletting indusert av SPC-drevet Cre uttrykk [20]. I denne rapporten
PTEN
inaktive var tilstrekkelig til å øke basc tall og indusere lungesvulster, noe som står i kontrast til funnene som presenteres her og andre steder [18] at
PTEN
mangel er ikke tilstrekkelig til å øke basc tall eller indusere lungesvulster. Det forrige rapport også skilte med hensyn til genetiske hendelser som samarbeidet med
PTEN
mangel. I den studien
PTEN
inaktivering akselereres lungetumordannelse indusert av uretan, et karsinogen som ofte induserer
K-ras mutasjoner
, men bare to av 6 tumorer undersøkt hadde
K-ras
mutasjoner, som etterlater åpne muligheten for at uretan samarbeider med
PTEN
tap ved å fremkalle somatiske mutasjoner av andre enn gener
K-ras
. Dette står i kontrast til vår modell der de betingede
K-ras
og
PTEN
alleler saman i de samme (CCSP-uttrykke) celler. Derfor kan de ulike resultatene av disse studiene være relatert til sekundære genetiske hendelser i uretan-behandlede mus eller forskjeller i eksperimentell design, slik som genetiske bakgrunn av mus eller de spesifikke promotorelementer kjøre Cre uttrykk.
metoder
Reagenser
Antistoffer kjøpt for disse studiene inkluderer kanin anti-p110α (sc-7174), p110β (sc-7175), SPC (sc-13979), geit anti-CC10 (sc -9772) og PTEN (sc-6818) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin anti-total AKT (9272), Ser473-fosforylert AKT (9271), Ser21 /9-fosforylert GSK3α /β (9331), total gsk3 (9332), kløyvde caspase-3 (9661), Poly (ADP-ribose) polymerase (9542), fosforylert-histon H3 (9701), Ser28-fosforylert histon H3 (9713P) (cellesignalisering Technologies, Danvers, MA) , kanin anti-SPC (WRAB-SPC, Seven Hills BioReagents, Cincinnati, OH), kanin anti-CCSP (07-623, Upstate Bioteknologi, Lake Placid, New York), FITC-konjugert anti-Sca-1 (557 405), biotin -konjugert anti-CD45 (553771) biotin-konjugert-CD31 (558 737), PE-konjugert anti-CD34 (12-0341-33, eBioscience), anti-kanin IgG Alexa Mel 488 (A11008), og anti-geit IgG Alexa mel 594 (A11058) (Invitrogen, Carlsbad, California). Andre kjøpte reagenser inkluderer streptavidin-APC (554 067, BD Pharmigen), TSA kits 22 (T20932), 25 (T20935), og 27 (T20937), Avidin /Biotin blokkere kit (00-4303) (Invitrogen), Dispase (354235, BD Biosciences), collagenase /dispase (10269638001, Roche biovitenskap), og 7-Aminoactinomycin D (A1310, Invitrogen).
Mus studier
For å teste om PI3K fremmer tumorutvikling, 9 K- ras
LA1 mus ble behandlet i 4 uker med 2 mg /kg /d intra-gastrisk PX-866, et lite molekyl inhibitor av PI3K [12], og 12 ble gitt kjøretøy som begynner ved 4 måneder, en alder hvor lunge lesjoner (AAH og adenomer) er målbare ved mikro computertomografi skanninger. Musene ble utsatt for samme formål i begynnelsen og gjennomføring av behandling for å telle lesjon tall og vurdere endringer i lesjon volum over tid som tidligere rapportert [24].
Før sin innvielse, alle musestudier ble forelagt og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Texas-M. D. Anderson Cancer Center. Mus fikk standarder for omsorg og ble avlivet i henhold til standarder fastsatt av IACUC. Mus og celler og ble oppnådd gjennom samarbeid med Dr. Tyler Jacks, MIT (Kras
LA1 mus, og Kras
LSL mus), Dr. Hong Wu, UCLA (PTEN
FLOX mus), og Dr. Francesco Demayo, Baylor College of Medicine (CCSP
Cre mus).
tissue mikromatriser og immunhistokjemiske analyser
Vi utførte immunhistokjemisk analyse av PI3K på en vev microarray som inneholder AAH (n = 17) faste adenomer (n = 31), blandede faststoff /papillære adenomer (n = 36), papillær adenomer (n = 45), og adenokarsinomer (n = 14) for å bestemme hvorvidt nivåene av PI3K endret seg i løpet av ondartet progresjon. Vi analyserte ekspresjonen av PI3K-isoformer (p110α og p).
For immunhistokjemisk farging, ble 4 um parafininnstøpte seksjoner bakt ved 60 ° C i 30 min og deretter avkjølt til omgivelsestemperatur. Snittene ble sekvensielt inkubert i xylen (5 min to ganger), 100% etylalkohol (5 min to ganger), 95% etylalkohol (5 min to ganger), og 80% etylalkohol (5 min). Etter vasking med vann, ble seksjonene antigen-hentes ved hjelp av citrat-buffer (pH 6,0, DAKO) i en dampkoker i 20 minutter og avkjølt til omgivelsestemperatur. Snittene ble deretter vasket med TBS-T og behandlet med 3% hydrogenperoksyd i TBS i 10 minutter, sperret for avidin /biotin-aktivitet, og inkubert med primært antistoff som følger: For p110α og p110β farging ble snittene blokkert med 5% geiteserum i 1 time, inkubert med primære antistoffer i 1 time ved omgivelsestemperatur, og deretter vasket med TBS-T; for Ser28-fosforylert histon H3-farging, Seksjonene ble blokkert med 10% geiteserum ved 4 ° C over natten, ble inkubert med primært antistoff i 30 minutter ved romtemperatur, og vasket med TBS-T. Fargingen ble utviklet ved hjelp av DAB underlaget system. Negative kontrollprøver inkluderte utelatelse av det primære antistoff og pre-inkubering av primære antistoff med blokkerende peptid. Farging ble kvantifisert ved en etterforsker (M.G.R.) forblindet at behandlingsgruppen. Intra-angrepne uttrykk ble scoret basert på fargeintensitet og utvidelse som beskrevet tidligere [24].
Påvisning av BASCs i lunge vev
antigener ble hentet fra mus lunge vev med 0,01 mol /L citrate buffer (pH 6; DakoCytomation, Glostrup, Danmark) for 25 min i en dampbåt. Glassene ble bråkjølt i 1,5% hydrogenperoksid i Tris-bufret saltvann i 10 minutter, og blokkert i DAKO serumfritt proteinblokk (Dako) i 1 time ved omgivelsestemperatur. Platene ble deretter inkubert med anti-SPC (sc-7705, Santa Cruz Biotechnology, WRAB-SPC, Seven Hills BioReagents) og anti-ccsp (07-623, Upstate Biochemicals) antistoff ved 4 ° C over natten. Den immunfluorescens ble utviklet ved hjelp av TSA kits 25 og 22 (Invitrogen) på grunnlag av produsentens instruksjoner. Vi brukte blokkerende peptider og enser det primære antistoffer som negative kontroller for å bestemme spesifisiteten av de immunfarging resultater. Immunfluorescens ble visualisert ved hjelp av et mikroskop med et reflektert fluorescens system (Olympus Model IX71SIF-2). Color oppkjøp og bakgrunn fluorescens ble optimalisert ved hjelp av DPController og DPManager programvare (Olympus).
BASC isolasjon og kultur
Musene ble drept etter 12 uker, og lungene ble dynket med 10 ml Hanks balanserte saltoppløsning gjennom den høyre ventrikkel inntil de ble fjernet fra blod. De luftrør ble injisert med Dispase (ufortynnet væske, BD Biosciences) etterfulgt av 0,5-1 ml 1% LMP-agarose i vann. Lungene ble plassert på is, hakket i stykker, inkubert med 0,001% DNAse (Sigma D-4527) og 2 mg /ml collagenase /dispase (100 mg /ml, Roche) i fosfat-bufret saltvann ved 37 ° C i 45 min, filtrert (100 mikrometer, etterfulgt av 40 um pore størrelse filter), og sentrifugert. De resulterende pelleter ble resuspendert i 2 ml PF10 (10% føtalt bovint serum i fosfatbufret saltvann), som typisk gir 1-2 millioner totale celler per mus. De røde cellene ble lysert. BASCs ble isolert ved sortering av Sca-en
pos CD45
neg PECAM
neg CD34
pos cellepopulasjon på en tre-laser 13-farge FACS Aria fluorescens-aktivert cellesorterer (BD Biosciences) som er i stand til å sortere fire underpopulasjoner ved et lavt trykk med en maksimal hastighet på 20 millioner celler /time. BASCs utgjorde omtrent 0,1% av den totale sortert cellepopulasjon.
ensartethet eller renheten av de sorterte celler ble ikke rutinemessig sjekket fordi cellene av interesse ville ha blitt forbrukt i prosessen. Når det er sagt, ble cellene sort-renset til høyest mulig renhet ved gating på størrelse (ved forover og side scatter), med unntak av dubletter (med fremover scatter bredde
versus areal og side scatter bredde
versus areal), og isolere celler med markører av interesse. I tillegg ble ensartetheten av de sorterte cellepopulasjoner som brukes i disse assays reflektert av reproduserbarheten av våre funn;
