Abstract
Innledning
Til tross for forbedringer i behandlingsstrategier for hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC), resultatene har ikke vesentlig forbedret; fremhever betydningen av å identifisere nye terapeutiske tilnærminger for å målrette denne sykdommen. For å møte denne utfordringen, fortsatte vi å vurdere rollen til jern i HNSCC.
Experimental Design
Expression nivåer av jern-relaterte gener ble undersøkt i HNSCC cellelinjer ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Cellulære fenotypiske effekter ble vurdert ved hjelp av levedyktighet (MTS), klonogene overlevelse, BrdU og tumordannelse analyser. Den prognostisk betydning av jern-relaterte proteiner ble bestemt ved anvendelse av immunohistokjemi.
Resultatene
I et panel av HNSCC-cellelinjer, hemokromatose (HFE) var en av de overuttrykte gener som er involvert i regulering av jern.
In vitro
knockdown av HFE i HNSCC cellelinjer betydelig redusert hepcidin (HAMP) uttrykk og intracellulære jern nivå. Dette i sin tur resulterte i en signifikant reduksjon i HNSCC celleviabilitet, clonogenicity, DNA-syntese, og Wnt signalering. Disse celleforandringer ble reversert ved å gjeninnføre jern tilbake i HNSCC celler etter HFE knockdown, noe som indikerer at jern ble medier denne fenotype. Concordantly, behandle HNSCC celler med en jernbindende, ciclopirox olamine (CPX), betydelig redusert levedyktighet og klonogene overlevelse. Til slutt, pasienter med høy HFE uttrykk opplevd en redusert overlevelse sammenlignet med pasienter med lav HFE uttrykk.
Konklusjoner
Våre data identifisere HFE som potensielt roman prognostisk markør i HNSCC som fremmer tumorprogresjon
via
HAMP og forhøyede intracellulære jern nivåer, noe som fører til økt cellulær proliferasjon og tumordannelse. Derfor er disse funnene tyder på at jernbindende kan ha en terapeutisk rolle i HNSCC ledelse
Citation. Lenarduzzi M, Hui ABY, Yue S, Ito E, Shi W, Williams J et al. (2013) Hemochromatosis Forbedrer tumorprogresjon
via
oppregulering av Intracellulær Jern i hode- og halskreft. PLoS ONE åtte (8): e74075. doi: 10,1371 /journal.pone.0074075
Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 18 juni 2013; Godkjent: 22 juli 2013; Publisert: 26 august 2013
Copyright: © 2013 Lenarduzzi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av midler fra Ontario Institute of Cancer Research, den kanadiske Institutes of Health Research, og Dr. Mariano Elia Chair i hode og hals Cancer Research. Forfatterne også takknemlig erkjenne filantropisk støtte fra Wharton Familie, Joe Team, og Gordon Tozer. Michelle Lenarduzzi er en mottaker av stipend fra Terry Fox Foundation Strategisk Training Initiative for Excellence in Radiation Forskning i det 21. århundre (EIRR21) på den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR), Ontario Graduate Scholarship (OGS) og Medisinsk biofysikk Excellence tildele. Det gis også støtte fra Campbell Family Institutt for kreftforskning og Helsedepartementet og langsiktig planlegging. CIHR – https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html, EIRR21 – https://www.eirr21.utoronto.ca/, OGS – https://osap.gov.on.ca /OSAPPortal/en/A-ZListofAid/TCONT003465.html. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er den sjette vanligste kreftformen i verden, med ~ 650.000 nye tilfeller diagnostisert og ~ 350.000 dødsfall årlig [1,2]. De fleste pasientene stede med lokalt avansert sykdom, og til tross for nye behandlingsmetoder, har 5 års sykdomsfri overlevelse stagnert på 30-40% [3]. Disse dårlige resultater markere betydningen av å utvikle nye terapeutiske strategier for å målrette denne sykdommen.
Jern er et essensielt element involvert i flere viktige prosesser, inkludert DNA og heme-syntesen, Wnt signalering, og cellenes stoffskifte [4,5]. Mange kreftceller oppviser en økt etterspørsel etter jern for å opprettholde sin høye celle omsetning og DNA-syntese. Følgelig er gener som er involvert i jern regulering ofte deregulert i kreft. Her rapporterer vi overekspresjon av hemokromatose (HFE) i HNSCC, og demonstrere sin evne til å endre intracellulære jern og øke celleproliferasjon.
Hemochromatosis er trans-membran glykoprotein, lik den store histocompatibility klasse 1 type molekyl ( MHC) som knytter B
2-mikroglobulin for intracellulær transport til plasmamembranen [6]. På membranen, kan HFE binde seg til enten transferrin reseptor 1 (TRF1) eller transferrin reseptor 2 (TFR2). Bindingssetene av HFE og jern bundet til transferrin overlapping på TFR1 [7], og dermed regulerer jern opptak i cellene. Men nyere tyder også på at en sentral rolle HFE er å stimulere uttrykk for jern regulatoriske hormon, hepcidin (HAMP), enten gjennom binding med TFR2 [8], eller uavhengig [9]. Funksjonen til HAMP er å internalisere og degradere ferroportin (FPN), den eneste mobil eksportør av jern [10]; fører til en økning i intracellulære nivåer jern ved å hemme jern meldingen [10]. Som et eksempel, overekspresjon av HFE i makrofager og tykktarm adenokarsinomceller cellelinjer hemmet utstrømningen av cellulær jern [11,12].
På den annen side, genetiske mutasjoner i
HFE
føre til jern overbelastning, arvelig hemokromatose (HH). Den vanligste formen for HH er forårsaket av et enkelt basepar-mutasjon i HFE som resulterer i en substitusjons c282y [6], som forstyrrer interaksjonen mellom HFE med B
2-mikroglobulin, og derfor veiledning av HFE til cellen membran. Pasienter med HH har feilaktig lave nivåer av HAMP [8], fremhever viktigheten av HFE for HAMP. Lav HAMP resulterer i frigjøring av jern fra retikuloendoteliale makrofager, og gjør det mulig for kontinuerlig absorpsjon av jern fra tarmen, noe som fører til overskudd av jern i omløp [13]. Følgelig blir sirkulerende transferrin mettet, noe som resulterer i akkumulering av jern i parenkymceller av forskjellige indre organer, noe som resulterer i cirrhose, diabetes, kardiomyopati, og kreft [13,14].
I denne studien, vi rapporterer over uttrykk for HFE i HSNCC, som igjen øker cellulære nivåer av HAMP og intracellulære jern. Ved perturbing intracellulære jern nivåer, kan HFE fremme celleproliferasjon, DNA-syntese, Wnt signalering, og tumordannelse
.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene fra Animal Care Utvalget ved University Health Network (Toronto, Canada). Protokollen ble godkjent av Animal Care Utvalget ved University Health Network (Protocol Antall: 342,19).
Pasientprøver ble samlet inn fra 26 HNSCC pasienter, med godkjenning fra University Health Network Institutional forskningsetikk Board, (REB godkjenning # 07-0521-CE). Disse prøvene inkludert matchet gruppe på 12 residiverende og 14 ikke-tilbakefall pasienter, med en median oppfølgingstid på 3 år. De kliniske detaljer om disse 26 pasientene er vist i tabell S1. Skriftlig eller muntlig samtykke kan ikke hentes fra pasienter på grunn av den perioden av vår kohort (2003-2007). Derfor fravikes vår University Health Network Institutional forskningsetikk Board kravet om skriftlig informert samtykke fra deltakerne i denne studien.
cellelinjer og reagenser
Den menneskelige hypopharyngeal HNSCC Fadu cellelinjen ble hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), og dyrket i henhold til produsentens spesifikasjoner. De menneskelige strupehodet plateepitelkreft linjer, UTSCC-8 og UTSCC-42a (kind gaver fra R Grénman, Turku universitetssykehus, Turku, Finland) [15,16] ble opprettholdt med DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (Wisent, Inc) og 100 mg /l penicillin /streptomycin. De normale orale epitelceller (Noes) ble kjøpt kommersielt og dyrket i den anbefalte medium (Celprogen). Alle celler ble holdt i en 37 ° C inkubator med fuktig 5% CO
2, autentisert ved Senter for anvendt Genomics (Hospital for Sick Children, Toronto, Canada) bruker AmpF /STR Identifier PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) og rutinemessig testet for mycoplasma forurensning bruker Mycoalert deteksjon kit (Lonza Group Ltd).
Kvantifisering av mRNA
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp av Total RNA rensing kit (Norgen), deretter revers transkribert ved hjelp av Super II revers transkriptase (Invitrogen Canada) i henhold til spesifikasjonene. Transkripsjonsnivåer av jernregulerende gener: ferroportin (FPN), hepcidin (HAMP), hemokromatose (HFE), transferrin reseptor 1 (TFR1), ferritin tung kjede (FTH1), ferritin lett kjede (FTL) og mitokondrier ferritin (FTMT) ble vurdert ved QRT-PCR, ved bruk av SYBR grønn Master Mix (Applied Biosystems), og den ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), som tidligere beskrevet [17]. Primersekvensene brukt i denne studien er alle oppført i tabell S2.
Transfeksjon Eksperimenter
De biologiske effektene av HFE ble undersøkt ved hjelp av siRNAs rettet mot HFE. siHFE1 (Hs_HFE_5 FlexiTube siRNA) og siHFE2 (Hs_HFE_2 FlexiTube siRNA) ble kjøpt fra Qiagen. En egge siRNA (Hs_Control_ss Flexitube siRNA) tjente som en negativ kontroll. Alle transfeksjoner ble utført i komplett medium uten antibiotika ved hjelp av Lipofectamine 2000 og 20 nM siRNA, som tidligere beskrevet [18].
Reagenser
ciclopirox olamin (CPX), Deferoxamine mesylatsalt (DFO), Ferric Ammonium Citrate (FAC) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich.
levedyktighet og klonogene Analyser
levedyktighet HNSCC celler transfektert med siHFE + stråling (RT), eller celler behandlet med CPX, ble bestemmes ved hjelp CellTiter 96 ikke-radioaktive Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega biovitenskap), i henhold til produsentens anbefalinger. Den kolonidannende evne HNSCC-celler transfektert med siHFE + RT, eller celler behandlet med CPX + RT ble bestemt ved anvendelse av klonogene assay som tidligere beskrevet [19]. I korthet, 48 timer etter transfeksjon med siHFE eller 72 timer etter behandling med CPX, Fadu Cellene ble gjen sådd i 6-brønns plater og inkubert ved
0 ° C 37 under 5% CO
2 i 10-12 dager. Platene ble deretter vasket og farget med 0,1% krystallfiolett i 50% metanol, og antallet kolonier ble deretter tellet. Den fraksjonen av overlevende celler ble beregnet ved sammenligning av siHFE vs. siCTRL eller CPX vs. CTRL.
Flow Cytometry
Strømningscytometri analyser ble utført på et FACSCalibur Flowcytometer (BD Biosciences), analyser ble utført ved hjelp av FlowJo 7.5 programvare (Tre Star, San Carlos, CA, USA), som tidligere beskrevet [17].
labil Iron
mobil~~POS=TRUNC labile jern bassenget ble målt ved hjelp av calcein-acetoxymethylester (calcein-AM) som spesifisert av produsenten (Invitrogen). Transfekterte celler ble inkubert med 1 uM av kalsein-AM i 15 minutter ved 37 ° C. Cellene ble vasket med PBS, deretter målt ved strømningscytometri, som tidligere beskrevet [18].
BrdU inkorporering
BrdU-inkorporering ble målt ved anvendelse av Exalpha Biological BrdU kolorimetrisk ELISA Kit. Kort fortalt ble transfektert celler inkubert med BrdU reagens for 24 timer, fast, farget og analysert i henhold til produsentens spesifikasjoner, som tidligere beskrevet [18].
ROS Eksperimenter
Intracellulær reaktive oksygenforbindelser (ROS) nivåer ble målt ved hjelp av ikke-spesifikke 5- (og 6-) klormetyl-2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (CM-H2DCFDA; eksitasjon 488 nm, emisjon 525 nm) som beskrevet av produsenten (Invitrogen). Transfekterte celler ble inkubert med 5 uM av CM-H2DCFDA i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble vasket med PBS, deretter målt ved strømningscytometri [18].
Western Blot
Fadu-celler ble transfektert med siHFE eller kontroll, 48 timer etter transfeksjon, ble cellene lysert i 1 M Tris -HCI (pH 8), 5 M NaCl og 1% NP40 pluss protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt som tidligere beskrevet [17]. Membranene ble probet med anti-B-catenin kanin-monoklonalt antistoff (Cell Signal, 8814) eller anti-HFE monoklonalt antistoff (Abnova) etterfulgt av sekundære antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase (Abcam). GAPDH og α-tubulin protein uttrykk ble brukt som laste kontroller. Western blot ble kvantifisert med Adobe Photoshop Pixel Kvantifisering Plug-In (Richard Rosenman Reklame Design).
Iron Rednings Eksperimenter
Fadu celler ble transfektert med siHFE eller kontroll; 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med enten 5 uM av DFO, 5 uM av FACS eller negativ kontroll (DMSO). Førti-åtte timer etter transfeksjon ble Fadu celler behandlet med eller uten 2 Gy av RT. Fem dager etter transfeksjon, ble cellenes levedyktighet målt som beskrevet ovenfor.
Tumor Formation Assay
Fadu-celler ble transfektert med siCTRL eller siHFE. Førti-åtte timer senere, ble levedyktige celler høstet og 2.5×10
5 celler ble suspendert i 100 mL av media, og injiseres intramuskulært i venstre gastrocnemius muskelen på 8-10 uker gammel kvinne alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) BALB /c mus. Tumorveksten ble overvåket ved å måle tumor pluss ben diameter (TLD) to til tre ganger per uke; Musene ble avlivet når den TLD nådde 13 mm som en human sluttpunkt.
Tumor Formation Assay med CPX
For CPX studien, to uker etter Fadu tumorcelle implantasjon, som beskrevet ovenfor, mus ble behandlet daglig fra mandag til fredag ved oralt inntak med CPX (25 mg /kg) i vann eller kjøretøy kontroll for totalt to uker. Tumorveksten ble overvåket ved å måle tumor pluss ben diameter (TLD) tre ganger i uken; Musene ble avlivet når TLD nådd 13 mm som en human endepunktet.
Immunohistochemistry av Iron Proteiner
Uttrykk for TFR1 og HFE ble evaluert i 26 primære diagnostiske HNSCC biopsiseksjoner bruker mikrobølgeovn antigen gjenfinning i kombinasjon med nivå-2 Ultra Streptavidin System, og anti-HFE (Sigma HPA017276, 1/300 fortynning), eller anti-TFR1 (Sigma HPA028598, 1/500 fortynning), som tidligere beskrevet [17]. I korthet, 4-um deler var deparaffin, behandlet med et antigen gjenfinning reagens, blokkert med 3% -ig hydrogenperoksyd og inkubert med enten anti-HFE eller anti-TFR1 ved 4 ° C over natten. Den følgende dag, snittene ble inkubert med et biotinylert sekundært antistoff og streptavidin for å fullføre farging. Cytoplasmisk farging av anti-HFE eller anti-TFR1 ble skåret fra 0 til 3, basert på fargeintensitet som ble definert i henhold til: 0 (ingen farging); 1 (mild økt flekker i forhold til tilsvarende normal epitel); 2 (moderat økt farging) og 3 (intens øket farging).
Statistical Analysis
Alle eksperimenter er blitt utført minst tre uavhengige ganger, og dataene er presentert som gjennomsnittet + standardfeil av gjennomsnittet (SEM). Sammenligningen mellom to behandlingsgruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
test. Tosidige tester ble brukt. Resultatene ble betraktet som signifikant hvis p-verdier var mindre enn eller lik 0,05. Analyse og grafer ble gjennomført ved hjelp av Graphpad Prism programvare (Graphpad Software, Inc).
Resultater
HFE er overuttrykt i HNSCC cellelinjer i forhold til NOE cellelinje
For å identifisere differensielt uttrykt jernregulerende gener i HNSCC, basale mRNA uttrykk nivåer i tre HNSCC cellelinjer ble sammenlignet med de i en NOE hjelp QRT-PCR. HFE var kjent for å ha den høyeste ekspresjonsnivået av 80-gangers overekspresjon i HNSCCs vs. NOE-cellelinjen (figur 1A). Ferritin (FTH1) hadde den nest høyeste nivået av overekspresjon i Fadu og UTSCC 42a-celler, sammenlignet med NOE. Av notatet, TFR1 også ut til å være litt overuttrykt i HNSCC forhold til NOE cellelinje.
(A) QRT-PCR analyse av FPN, HAMP, HFE, TFR1, FTH1, FTL og FTMT uttrykk i Fadu, UTSCC 42a og UTSCC8 HNSCC kreft cellelinjer, normalisert til disse genene i Noe celler. (B) Fadu celler ble transfektert med 20 Nm siCTRL eller siHFE1. Cellelevedyktigheten ble vurdert i Fadu celler ved MTS-assay 24-72 timer etter transfeksjon. (C) Fadu-celler ble transfektert med 20 nM av siCTRL eller siHFE1, deretter bestrålt 48 timer etter transfeksjon (4 Gy). Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analysen 5 dager etter transfeksjon. (D) klonogene overlevelses av Fadu celler ble målt 10 til 12 dager etter såing re-celler behandlet med siCTRL (20 nM) eller siHFE1 (20 nM) i 72 timer. (E) Cellenes levedyktighet av NOE-celler, ble vurdert ved MTS-analyse 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon med 20 nM av siCTRL eller siHFE1. (F) NOE celler ble transfektert med 20 Nm siCTRL eller siHFE1 eller to ?, deretter bestrålt 48 timer etter transfeksjon (4 Gy). Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analysen 5 dager etter transfeksjon. * P 0,05, ** P. 0,005, p = ns (ikke signifikant)
In vitro effekter av HFE nedregule
For å vurdere den biologiske betydningen av HFE overekspresjon, knockdown forsøkene ble utført i HNSCC celler ved hjelp av en siRNA tilnærming. Vedvarende knockdown ble oppnådd i Fadu celler i opptil 72 timer ved bruk av to uavhengige sirnas målretting HFE på både transkripsjon og proteinnivåer (Tall S1A og S1B). HNSCC-celler viste en signifikant reduksjon i cellelevedyktighet med eller uten stråling etter transfeksjon med siHFE sammenlignet med siCTRL (figur 1B-C, S1C-E). Videre er evnen til HNSCC-celler til å danne kolonier ble signifikant redusert med eller uten stråling etter transfeksjon med siHFE i forhold til siCTRL (figur 1D, S1F-G). I motsetning til dette, levedyktigheten av NOE-celler med eller uten stråling forble uendret etter transfeksjon med siHFE i forhold til siCTRL (figur 1E-F, S1H). Samlet er disse observasjonene viste at mink HFE fortrinnsvis redusert levedyktighet og clonogenicity i HNSCC forhold til NOE celler. For bedre å forstå mekanismen (e) ansvarlig for formidling denne fenotype, undersøkte vi muligheten for HFE å regulere mobilnettet jern.
HFE regulert HAMP og labile jern bassenget i HNSCC celler
For å finne ut hvis HFE var involvert i regulering hepcidin (HAMP), vi målte mRNA nivåer av HAMP ved QRT-PCR etter transfeksjon med siHFE. Fadu celler viste en signifikant reduksjon i HAMP mRNA-transkript nivå ( 0,5 ganger) i opptil 72 timer etter transfeksjon med siHFE i forhold til siCTRL (figur 2A). I tillegg ble det labile jern basseng (LIP) også betydelig redusert (med ~ 20%) etter HFE knockdown i HNSCC-celler sammenlignet med siCTRL (figur 2B). I kontrast, var det ingen signifikant endring i LIP i Noe celler med siHFE transfeksjon (figur 2C). Samlet disse eksperimentene demonstrerte evne HFE å endre mobilnettet jern nivåer fortrinnsvis i HNSCC forhold til NOE celler. For å avgjøre om intracellulære jern nivåer ble involvert i medie disse siHFE fenotyper, utførte vi en rekke jern redningsforsøk.
(A) QRT-PCR av HAMP nivåer på 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon med 20 nM hver av siHFE1, eller siHFE2, i forhold til fold-endring i siCTRL-behandlede celler. (B) Cellular labile jern basseng (LIP) i Fadu og UTSCC8 celler transfektert med 20 nM hver av siCTRL eller siHFE, detektert ved strømningscytometri med kalsein-AM til 24-72 timer etter transfeksjon. (C) Cellular LIP av NOE celler transfektert med 20 nm siCTRL eller siHFE, oppdaget av flowcytometri med calcein-AM på 24-72 timer etter transfeksjon. * P 0,05, ** P. 0,005, p = ns (ikke signifikant)
Iron formidler celle spredning av HFE
Celleviabilitet ble målt i HNSCC celler behandlet med siHFE alene, siHFE med en jernbindende deferoksamin (DFO), eller siHFE kombinert med oppløselige jern (FAC), både med og uten RT (figur 3A RT hadde ingen signifikant effekt på differensial denne prosessen. Disse funnene bekreftet at jern var en kritisk formidler av disse effektene. Vi fortsatte deretter å evaluere effekten av siHFE på nedstrømsjernavhengige prosesser.
(A) Fadu celler ble transfektert med 20 nM hver av siCTRL eller siHFE1, deretter behandlet med 5 uM av DFO, eller 5um av FAC , 24 timer post-transfeksjon, etterfulgt av ± RT (4 Gy), 48 timer etter transfeksjon. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analysen 5 dager etter transfeksjon. (B) BrdU inkorporering ble vurdert i Fadu celler 5 dager etter transfeksjon med 20 nM hver av siCTRL eller siHFE1, ± RT (4 Gy, 48 timer etter transfeksjon). (C) Fadu-celler ble transfektert med 20 nM hver av siCTRL eller siHFE, ± RT (4 Gy, 48 timer etter transfeksjon). Totalt cellulært ROS-nivået ble detektert ved strømningscytometri med CM-H2DCFDA 24-72 timer post-RT. (D) Western blotting av B-catenin ble målt i Fadu celler 24-72hr post transfeksjon med siCTRL (20 nM) eller siHFE1 (20 nM); bilder (over), kvantifisering (nedenfor). * P 0,05, ** P 0.005, *** P 0,0005, P = ns (ikke signifikant)
BrdU inkorporering analysen ble ansatt for å måle endringer i DNA-syntese. HNSCC-celler transfektert med siHFE viser en signifikant reduksjon (60%) i BrdU-inkorporering i forhold til siCTRL-behandlede celler (figur 3B, S2C). I motsetning til dette ble ingen signifikant endring i BrdU-inkorporering observert for NOE-celler transfektert med siHFE sammenlignet med siCTRL-behandling (fig S2D). Strømningscytometri ble anvendt for å måle endringer i ROS-nivåer etter siHFE. Som forventet, Fadu celler viste en signifikant reduksjon i ROS-nivåer etter transfeksjon med siHFE i forhold til siCTRL, både med og uten RT (figurene 3C og S2E). Til slutt ble Wnt veien undersøkt ved å analysere endringer i B-catenin. Fadu celler transfektert med siHFE viser en signifikant reduksjon (~ 40%) i B-catenin nivåer for opptil 72 timer sammenlignet siCTRL-behandlede celler (Figur 3D).
siHFE reduserer marginalt tumordannelse in vivo
Deretter vurderes vi effekten av HFE knock-down i en
in vivo
tumor modell. Tumorigenitet ble målt
in vivo
bruker SCID mus injisert intramuskulært med Fadu celler transfektert med siHFE eller siCTRL. Undertrykkelse av siHFE marginalt redusert svulstdannelse i forhold til den negative kontrollen, merkbar ved senere tidspunkter ( 27days). (Figur S2F)
Iron kelator CPX redusert celleproliferasjon i HNSCC cellelinjer
gitt utfordringene i den terapeutiske anvendelsen av en siRNA strategi, HNSCC celler behandlet med en klinisk-godkjent jernbindende, ciclopirox olamine (CPX), for å avgjøre om siHFE fenotype kan rekapitulert. Behandling av HNSCC-cellelinjer med 5 uM av CPX resulterte i en signifikant reduksjon i kolonidannelsen, med eller uten RT, sammenlignet med bærer-behandlede celler (figur 4A, S3A-B). I motsetning til dette, CPX hadde en mye mindre effekt på levedyktigheten til NOE forhold til Fadu celler (figur 4B). Dessverre, administrering av CPX i 2 uker ved 25 mg /kg ikke klart å redusere tumorvekst i Fadu xenograft modell (fig S3C).
(A) klonogene overlevelses av Fadu-celler ble målt 10 til 12 dager etter re-såing av cellene som ble behandlet med etanol (5 uM) eller CPX (5 uM) i 72 timer, etterfulgt av RT (0, 2, 4 eller 6 Gy). (B) Cellenes levedyktighet av Fadu og NOE-celler ble bestemt ved MTS-analyse 72 timer etter behandling med CPX (2,5 um, 5 uM eller 10 uM). * P 0,05, ** P 0.005, *** P 0,0005, P = ns (ikke signifikant)
Iron proteiner er de-regulert i primær HNSCC vevsprøver
Immunohistokjemi (IHC) ble benyttet for å visuelt bekrefte uttrykk for HFE og TFR1 i HNSCC vev. Intense immuno-ekspresjon av både HFE og TFR1 ble observert i cytoplasma av tumorceller, men ikke i den tilstøtende stroma eller den infiltrerende lymfocytter (figur 5A og 5B). I kontrast, ble minimal immuno-uttrykk for HFE og TFR1 observert i en normal strupehodet (figur 5C-D), bekrefter høyere uttrykk av HFE og TFR1 i HNSCC vs. normalt vev. Når ekspresjonen av HFE eller TFR1 ble dikotomisert mellom høy (IHC ≥2)
vs
lav. (IHC 2) plan, de tidligere gruppene opplevde en kortere samlet overlevelse sammenlignet med den sistnevnte (figur 5E-F ; p = 0,08); selv om statistisk signifikans ikke ble oppnådd på grunn av liten utvalgsstørrelsen. Tilsvarende median IHC score for både HFE og TFR1 var høyere i de tilbakefall vs. ikke-tilbakefall pasientprøver (figur S4A-B), men var statistisk signifikant bare for HFE uttrykk (p = 0,04).
(A) en representant bilde av HFE immunhistokjemisk uttrykk fra en primær HNSCC biopsi; piler som viser tumorceller stiller cytoplasma signal. (B) En representant bilde av TFR1 immunhistokjemisk uttrykk fra en primær HNSCC biopsi; piler som viser tumorceller stiller cytoplasmamembranen signal. (C) Et representativt bilde av HFE immunhistokjemisk ekspresjon fra en vanlig strupehodet. (D) En representant bilde av TFR1 immunhistokjemisk uttrykk fra en vanlig strupehodet. (E) Kaplan-Meier plot av total overlevelse for HNSCC pasienter dikotomert basert på høy (≥2)
vs
. lav ( 2) HFE immunhistokjemi score. (F) Kaplan-Meier plot av total overlevelse for HNSCC pasienter dikotomert basert på høy (≥2)
vs
. lav ( 2). TFR1 immunhistokjemi score
Diskusjoner
Heri, rapporterer vi for første gang at HFE overekspresjon synes å være en ny mekanisme ansvarlig for HNSCC sykdomsprogresjon. Overekspresjon av HFE i HNSCC fører til økt hepcidin, som i sin tur fremmer intracellulær jernakkumulering, noe som resulterer i økt DNA-syntese, forhøyede ROS nivåer, Wnt signalering, all kjøring tumorcelle-proliferasjon og clonogenicity, med jern som en viktig mediator i denne prosessen (figur 6). En mulig terapeutisk strategi i denne sammenheng er bruken av en jernbindende ciclopirox olamin (CPX), som fortrinnsvis redusert klonogene overlevelses og levedyktighet i HNSCC-celler, med minimale effekter på NOES. Videre HFE og TFR1 overekspresjon viste en tendens mot lavere resultat, som samlet dokumenterer den kritiske rollen av jern deregulering i HNSCC progresjon.
Skjema som viser at HFE overexpresion fører B2M bindende for cellemembranen menneskehandel. HFE øker HAMP enten direkte eller via TFR2. HAMP går deretter ut av cellen, gjennom en ukjent mekanisme, og i sin tur forringer FPN, noe som fører til jern opphopning. Kollektivt, dette resulterer i økt DNA syntese, forhøyet ROS, og Wnt signalering, all kjøring tumor celleproliferasjon og clonogenicity. Bokser i rødt betegne data vist i denne studien.
Ytterligere bevis på relevansen av disse jernregulerende gener er gitt ved undersøkelse av offentlig tilgjengelige HNSCC databaser (www.oncomine.org) [20 ], som bekrefter betydelige overekspresjon av både HFE [21], og TFR1 [21-23] i HNSCC pasientprøver, noe som viser at dette er faktisk en vanlig dysregulerte vei i denne sykdommen. Videre HFE ble også overuttrykt i andre krefttyper, inkludert hjernen [24], og nyrecellekarsinomer [25]. For å identifisere mulig mekanisme (r) som fører til deres overekspresjon ble TCGA HNSCC databasen ved hjelp av cBIO Cancer Genomisk Portal programvare [26] avhørt ved å sammenligne krefttranskripsjonsnivåer til DNA kopiantall i 295 diskrete pasient datasett. De fleste av disse HNSCCs var diploid for
HFE
; dermed kromosom endring ikke synes å være ansvarlig for sin overuttrykk. Men forsterkning av
TFR1
genet ble observert hos 18% av HNSCC prøver, som tilsvarte forhøyede TFR1 mRNA uttrykk nivåer, indikerer genomisk endring som en mekanisme for TFR1 overekspresjon i HNSCC. Gitt den komplekst nettverk av proteiner involvert i regulering av jern [27], er det klart at flere mekanismer er ansvarlige for jern deregulering i humane kreftformer. For eksempel mTOR, som ofte aktivert i HNSCC [28] har nylig blitt knyttet til TFR1 stabilitet og jern regulering [29], noe som gir enda en annen mekanisme for jern deregulering i HNSCC. Derfor er det sannsynlig flere forskjellige mekanismer som står for HFE overekspresjon i HNSCC, som resulterer i jern forstyrrelse
Hemochromatosis (HFE) er et trans glykoprotein, grovt uttrykt i hele kroppen [30].; en av de viktigste oppgaver er å regulere hepcidin (HAMP) [8], som i sin tur, internalizes og nedbrutt ferroportin (FPN) (se figur 6) [10]. HAMP en eller annen måte kommer ut av cellen, og deretter bindes til FPN på plasmamembranen og forårsaker tyrosinfosforylering som fører til internalisering av FPN. Når internalisert, FPN er de-fosforylert, så ubiquitylated og degradert gjennom lysosomale vei [31]. Til syvende og sist, nedbrytning av FPN ved HAMP fører til intracellulær retensjon av jern.
Under fysiologiske betingelser, er HAMP antagelig utskilles av leveren i respons på endringer i plasmajernnivåer. Imidlertid tyder nyere bevis på at HAMP kan spille en patologisk rolle i menneskelige kreftformer; for eksempel har lav FPN og høy HAMP vært assosiert med dårlig prognose ved brystkreft [32]. Forhøyet HAMP mRNA nivåer korrelerte med lav FPN uttrykk i kolorektal kreft [33]. Den eksakte mekanismen (e) der forhøyet HAMP bidrar til kreftutvikling er ikke klarlagt; men det er tenkelig at HAMP kan bli utskilt av cancerceller til å nedbryte FPN, for derved å øke intracellulære nivåer av jern, som foreslått av våre data. Faktisk har forhøyet serum HAMP nivåer er assosiert med nyrecellekreft metastaser [34]; i tillegg har de høye urin HAMP nivåer er observert hos pasienter med myelomatose [35], både som tyder patologisk sekresjon av HAMP av kreftceller. Videre HeLa-celler transient transfektert med et plasmid inneholdende FPN og utsatt for HAMP, resulterte i internalisering av FPN [10], noe som viser at svulster svare på HAMP på en lignende måte som hepatocytter eller makrofager.
jern regulatoriske nettverk inneholder over 151 kjemiske arter og 107 reaksjoner trinn [27], og således er strengt regulert. Fenomenet av kreftceller som krever mer jern for å opprettholde sin høye celle omsetning og DNA-syntese er observert i mange forskjellige maligniteter.
