Abstract
Nye midler for å behandle kreft i bukspyttkjertelen, en av de mest dødelige menneskelige maligne . Vi syntetiserte fosfo-valproinsyre, en ny valproinsyre-derivat, (P-V; MDC-1112) og evaluert dens effektivitet i kontrollen av kreft i bukspyttkjertelen. P-V hemmet veksten av humane kreft i bukspyttkjertelen transplantater i mus med 60% -97%, og 100% ved kombinasjon med cimetidin. Den dominerende molekylære mål av P-V var STAT3. P-V inhiberte fosforylering av JAK2 og Src, og den HSP90-STAT3 krets, å undertrykke den aktiverende fosforylering av STAT3, som i sin tur redusert ekspresjon av STAT3-avhengige proteiner Bcl-x
L, Mcl-1 og Survivin. P-V reduseres også STAT3 nivåer i mitokondriene ved å forhindre dets translokasjon fra cytosol, og forbedret mitokondrie nivåer av reaktive oksygenforbindelser, som utløste apoptose. Inhibering av mitokondrie STAT3 av P-V var nødvendig for sin anticancer virkning; mitokondrielle STAT3 overekspresjon reddet dyr fra tumorvekst inhibering av P-V. Våre resultater tyder på at PV er en lovende kandidat medikament mot kreft i bukspyttkjertelen og etablere mitokondrie STAT3 som sin viktigste molekylære mål
Citation. Mackenzie GG, Huang L, Alston N, Ouyang N, Vrankova K, Mattheolabakis G, et al. (2013) Targeting Mitokondrie STAT3 med Novel Phospho-valproinsyre (MDC-1112) Hemmer Bukspyttkjertelkreft Vekst i Mus. PLoS ONE 8 (5): e61532. doi: 10,1371 /journal.pone.0061532
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 14 desember 2012; Godkjent: 11 mars 2013; Publisert: 01.05.2013
Copyright: © 2013 Mackenzie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH 2R01 CA92423 og R01 CA10101902 til BR og Stony Brook University-Department of Medicine frø-stipend for å GGM. Dette arbeidet ble også støttet delvis av tilskudd R01 CA154172 (BR), tildelt av National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health. Studien sponsorer hadde ingen rolle i studien design, innsamling, analyse og tolkning av data, i skriving av manuskriptet, og heller ikke i beslutningen om å sende inn manuskript for publisering
Konkurrerende interesser. BR har en eierposisjon i Medicon Pharmaceuticals, Inc, selskapet som ga testforbindelsen; PPC og NO er tilknyttet det samme. Alle andre forfattere erklærer ingen interessekonflikt. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen (PC), referert til som «sturen sykdom» på grunn av sin aggressive natur og høy dødelighet, er en av de mest ødeleggende ondartede sykdommer i verden, blir ofte dødelig i løpet av 6 måneder [1]. Den høye dødeligheten av PC tilskrives sent diagnose, rask sykdomsutvikling og motstand mot cellegift. På grunn av de skuffende resultatene av dagens behandlinger, det er et presserende behov for å identifisere nye midler for sin behandling.
Signal Svinger og Activator av transkripsjon 3 (STAT3) transkripsjonsfaktor spiller en betydelig rolle i patogenesen av PC , blir forbundet med ondartet svulst initiering, transformasjon og progresjon [2], [3]. I tillegg til sine etablerte atomtranskripsjonelle rolle spiller STAT3 en tydelig rolle i mitokondriene, hvor den støtter Ras-avhengige malign transformasjon [4], og sikrer optimal funksjon av elektrontransportkjeden [5]. Fordi den regulerer flere veier viktige i tumorgenese [6], er STAT3 anerkjent som et potensielt mål for medikament PC [7].
Rasjonell medikamentutvikling krever blant annet utnytte egenskapene til putative molekylære mål. Vi har identifisert fosfo-valproinsyre (P-V; MDC-1112 Fig. 1 A), en ny valproinsyre (VPA) derivat, som en potent inhibitor STAT3. Denne agenten har blitt syntetisert basert på en generell tilnærming hvor en spesifikk kjemisk modifikasjon av kjente legemidler forbedrer sine ønskede kreft egenskaper, først og fremst deres effekt. Anticancer egenskaper av VPA, en forgrenet kortkjedet fettsyre er mye brukt som et antiepileptisk medikament, er under undersøkelse, spesielt siden det ble identifisert som en histon deacetylering (HDAC) inhibitor [8] – [10]. Pågående studier med VPA viser oppløftende resultater for flere menneskelige maligne [11].
(A) Den kjemiske strukturen til P-V (MDC-1112). (B) BxPC-tre tumorvolumvekst av kontroll (▴) og P-V 50 mg /kg /d (▪) behandlede mus. *
p
0,01
vs
. kontrollgruppe. (C) Bilder av representative svulster fra kontroll og P-V-behandlede mus. (D) MIA PACA-2-tumorvolum vekst av kontroll (•), 100 mg /kg (▪) og 150 mg /kg (▴) P-V-behandlede mus. *
p
0,01
vs
. kontroll. (E) BxPC-3 tumorvolum vekst av kontroll, P-V 50 mg /kg /d og VPA 250 mg /kg /dag behandlede mus. *
p
0,01
vs
. P-V og VPA grupper;
#
p
0,01
vs
. VPA gruppe. (F) Cimetidin (CIM) synergizes med P-V for å hemme veksten av humane PC-xenografter. Nude mus med MIA Paca-2 (
venstre
) eller BxPC-3 (
høyre
) xenografter ble behandlet med P-V 50 mg /kg, CIM 100 mg /kg, eller begge deler. *
p
0,01
vs
. kontroll;
#
p
0,05
vs
. PV eller CIM grupper.
Heri vi etablert PV som en potent middel for PC kontroll, identifisert cimetidin som en sterk kombinasjon partner og skissert av virkningsmekanismen, som involverte hemming av STAT3 på mitokondrie nivå
Materialer og metoder
Reagenser -. Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
PV og fosfor-aspirin (MDC-43) var en gave fra Medicon Pharmaceuticals Inc. (Stony Brook, NY ). Cimetidin og VPA ble kjøpt fra Sigma (St Louis, MO). Dihydroethidium (DHE), 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorecein diacetate (DCFDA), MitoSOX Red og Annexin V ble kjøpt fra Invitrogen. Alle generelle løsemidler og reagenser var av HPLC-kvalitet eller høyeste karakter kommersielt tilgjengelig.
Menneske bukspyttkjertelen (ASPC-en, BxPC-3, CAPAN-2, CFPAC-en, HPAF-II, Panc-1 og MIA PACA-2), bryst (MCF-7 og MDA-MB 231) og tykktarm (HT-29, og SW-480) celler ble dyrket som foreslått av ATCC (Manassas, VA). Alle cellelinjer ble dyrket in vårt laboratorium i mindre enn 6 måneder etter kvittering. Mitokondriene løse (ρ
0) derivater av BxPC-3-celler ble oppnådd ved å inkubere cellene med 200 ng /ml etidiumbromid og 50 ug /ml uridin i 8 uker [12].
Cellevekst ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Celleformering ble analysert ved 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) inkorporering; apoptose og nekrose ved farging med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) og analysere fluorescensstyrkene ved FACScaliber (BD Bioscience); og cellesyklus ved flowcytometri, alt som beskrevet [13].
antistoff microarray
Kinex antistoff microarray-analyser ble utført på proteinlysatene hentet fra BxPC-3 celler behandlet med eller uten PV for 2 h følge instruksjonene fra Kinexus (www.kinexus.ca).
Fastsettelse av ROS-nivåer
Celler ble behandlet med testmidler i 1 time, farget med 10 mm DCFDA, 10 mikrometer DHE eller 10 mm MitoSOX Red i 30 minutter ved 37 ° C og fluorescens intensitet ble analysert ved FACScaliber
Fastsettelse av mitokondriell O
2
-. av fluorescensmikropskopi
Celler sådd over natten i glassbunn kultur retter (Mattek, Ashland, MA) ble behandlet med PV og analysert ved fluorescens mikroskopi [14].
Fastsettelse av mitokondriell membranpotensiale
mitokondriemembranen potensial (ΔΨm) ble bestemt ved strømningscytometri ved å bruke JC-1 kationisk fargestoff [13].
Bestemmelse av den mitokondrielle elektrontransportkjeden kompleks i-aktivitet
aktiviteten av mitokondrielle elektrontransportkjeden kompleks i ble bestemt i mitokondrie utdrag fra MIA Paca-2 celler inkubert med PV 1,5 × IC
50 for en time, etter produsentens instruksjoner (MitoSciences, Eugene, Oregon).
mitokondrie~~POS=TRUNC import analysen
in vitro
mitokondrie import analysene ble utført som beskrevet [15] (detaljer i metoder S1).
Fastsettelse av HDAC aktivitet
HDAC aktivitet ble bestemt ved hjelp av en colorimetric- basert assay. Kort, Panc-1 celler ble behandlet med PV, VPA eller HDAC hemmer trichostatin A i 3 timer og HDAC aktivitet ble deretter evaluert følge produsentens instruksjoner (BioVision, Milpitas, CA)
Western blot analyse
helcelle fraksjoner ble oppnådd som beskrevet [13]. Cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner ble oppnådd ved bruk av Mitokondrier Brøk Isolation Kit (Pierce, Rockford, IL). Western blots ble utført som beskrevet [13].
STAT3 gen tie
Celler ble transfektert med 100 nmol /L STAT3 liten interfererende RNA (siRNA) eller uspesifikk kontroll siRNA (detaljer i Methods S1) .
STAT3 overekspresjon
Celler ble forbigående eller stabilt transfektert med STAT3 uttrykk plasmid (STAT3 cDNA, OriGene, Rockville, MD, detaljer i metoder S1). For
in vivo
studier, ble MIA PACA-2 celler med taushet STAT3, tilført med STAT3 Y705F Flag pRc /CMV plasmid [16], en gave av James Darnell (Rockefeller University, New York) (Addgene plasmid # 8709). På den annen side, ASPC-1 celler, med taushet STAT3, ble transfektert med MLS-STAT3 plasmid [17], en gave av Dr. Andrew Larner.
Dyrestudier
Alle dyr forsøkene ble godkjent av vår Institutional Animal Care og bruk komité Stony Brook University.
nude mus xenograft studier
Kjemoterapi protokollen.
Kvinne BALB /c naken mus (5- 6 uker gamle, Charles River, Wilmington, MA) ble subkutant injisert med 1,5 × 10
6 BxPC-3 eller MIA PACA-2 celler i 100 mL PBS i hver flanke. Når tumorene nådde 200 mm
3, mus (n = 10 /gruppe) ble randomisert i grupper som fikk maisolje (kontroll), eller PV (50, 100 eller 150 mg /kg) i maisolje gitt oralt 5 x /wk
chemopreventive protokollen
En uke før implantering BxPC-3 celler, mus ble delt inn i tre grupper.. (kontroll, PV, og VPA; n = 7 /gruppe) og startet på PV 50 mg /kg /d eller VPA 250 mg /kg /d oralt med sonde for 7 uker; disse dosene representerer 25% av deres respektive maksimale tolererte dose (MTD)
Kombinasjons studie
Dame NCR-hårløse mus (5-6 uker gamle, Taconic, Hudson, New York).. var subkutant inokulert i hver flanke med 1,5 × 10
6 BxPC-3 eller MIA PACA-2 celler i 100 mL PBS og randomisert i fire grupper (n = 7 /gruppe) som fikk 5 x /uke i 58 dager: kjøretøy (mais olje); 50 mg /kg P-V i maisolje ved oral sonde; 100 mg /kg cimetidin i PBS i.p. .; og PV pluss cimetidin som ovenfor.
ortotopiske bukspyttkjertel xenograft studie
Parent, STAT3-overekspresjon eller STAT3
Y705F-overekspresjon MIA PACA-2 celler, eller foreldre og MLS-STAT3 overekspresjon ASPC -1-celler (1 x 10
6 i 30 mL PBS) ble injisert i parenchyma i bukspyttkjertelen med en 27-gauge hypodermisk nål. Fem dager senere, mus ble randomisert i to grupper (n = 8 /gruppe) og behandlet med kjøretøy (maisolje) eller PV 150 mg /kg 5 × /wk muntlig med sonde i 18 eller 38 dager.
immunhistokjemi
Farging for Ki-67, Amylase, STAT3, p-STAT3
Ser727, p-STAT3
Tyr705, Mcl-1 og Bcl-2 ble utført som beskrevet. [18] apoptose var bestemmes immunohistokjemisk ved terminal deoksynukleotidyl-transferase-mediert deoksyuridin trifosfat-biotin nick ende-merking (TUNEL) analyse [14]. Se for mer informasjon.
Statistiske analyser
Resultatene fra minst tre uavhengige eksperimenter ble uttrykt som
bety
±
SEM Hotell og analysert av en-faktor analyse av varians etterfulgt av Tukey test for multiple sammenligninger.
P
0,05 var statistisk signifikant
Resultater
PV hemmer veksten av menneskelige PC transplantater i mus. Synergy med cimetidin
For å vurdere kjemoterapeutisk potensialet i PV, vi benyttet både ortotopiske og heterotop (subkutant) PC xenograft modeller i nakne mus ved hjelp av to menneskelige PC cellelinjer forskjellig i sin
Kras
status, BxPC-3 (villtype
Kras
) og MIA Paca-2 (mutant
Kras
) (fig. 1B-D). P-V 50 mg /kg /d hemmet veksten av BxPC-3 subkutane transplantater, og reduserer på dag 17 tumorvolumet med 75,4% sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,01). Ved doser på 100 og 150 mg /kg /x25d, P-V hemmet veksten av subkutane MIA PACA-2-xenografter med 76,6% og 96,9%, henholdsvis (p 0,01). En noe lavere inhiberende virkning ble bemerket i ortotopisk MIA PACA-2 transplantater i mus behandlet med PV 150 mg /kg /d utgangs 5 dager etter implantasjon og fortsetter i 38 dager (60% inhibering ved offer; p 0,001; fig S1. .)
Vi sammenlignet også kreft effekter av PV og VPA, dets modersubstansen, ved å behandle nakne mus med subkutane BxPC-3 xenografter med PV 50 mg /kg /d og VPA 250 mg /kg /d; disse dosene representerer 25% av deres respektive MTDs. Vi fulgte et forebyggende protokoll, dvs. behandling startet en uke før BxPC-3 implantasjon. På dag 38 etter-implantering, sammenlignet med kontroller PV redusert xenograft tumorvolumet med 68%, mens VPA reduseres det med 34% (p 0,01 for begge), med den forskjell mellom de to er signifikant (p 0,05, Fig. 1E) .
Gitt den aggressive natur PC, utforsket vi om PV kan med hell kombineres med andre midler. Vi har undersøkt flere forbindelser in vitro. Isobologrammer etablert synergi mellom P-V og 5-FU, GABA, Arsenikk og cimetidin (Fig S2.); alle er rapportert å ha en viss effekt mot PC [19] – [22]. Selv om 5-FU mislyktes i å virke synergistisk med P-V in vivo (fig. S3), cimetidin, en histamin-2 blokker, hadde en dramatisk effekt på veksten av PC-xenotransplantater i kombinasjon med P-V (fig. 1F). Administreres under en behandling protokollen til mus med MIA PACA-2 xenografter, kombinasjonen hovedsak produsert svulst stasis; hver forbindelse alene hadde bare en delvis effekt ( 45% inhibering ved slutten av studien). Administreres under en forebyggende protokoll til mus med BxPC-3-xenotransplantater, cimetidin samt PV eliminert alle tumorer hos alle dyr ved dag 58, i motsetning til hver forbindelse alene (31% hemming av cimetidin og 68% av PV).
PV redusert tumorvekst gjennom sin cytokinetic effekt. For eksempel, i studier av heterotop BxPC-3 xenotransplantater, P-V hemmet celleproliferasjon med 49% og økt apoptose med 78% sammenlignet med kontroller (fig. S4). Av notatet, i studier med disse to PC-celler (og ytterligere ni bukspyttkjertelen og ikke-PC cellelinjer), vises P-V, som hemmet deres in vitro vekst mer potent enn VPA, en trippel cytokinetic virkning: a) hemming av spredning; b) blokk på G
2 /M → G
en cellesyklus overgang, assosiert med økt p21 uttrykk; og c) induksjon av apoptose (Fig. S5), som var selektiv, skåner de normale bukspyttkjertelen akinærceller (fig. S6).
PV ble godt tolerert av musene i alle studier (fig. S1C), og viste ingen gentoksisitet på Ames test og ingen akutt giftighet i mus (Resultater S1)
PV hemmer STAT3 signalisering i PC. cytosolic /atom effekt
Identifisere molekylære mål (e) av en nye middel er en vesentlig del av dens utvikling. Fordi VPA hemmer histon deacetylering, vi først undersøkt om P-V kan også hemme histone deacetylering. For dette formålet målte vi HDAC aktivitet i Panc-1 celler etter 3 timers inkubering med P-V i konsentrasjoner svarende til en x og 1,5 x IC
50 for cellevekst. P-V hemmet HDAC aktivitet med 23 og 29%, henholdsvis mens VPA på sitt IC
50 hemmet det med 56%. Som forventet, trichostatin A inhiberte sterkt HDAC-aktivitet med 89% (Fig S7A.)
Ettersom NF-kB er konstitutivt aktivert i 70% av humane bukspyttkjertel kreft og i humane pankreatiske cellelinjer [23] – [25] , også undersøkte vi om PV hemmet sin aktivering. Som vist på fig. S7b, P-V bare beskjedent hemmet NF-kB aktivering i BxPC-3 celler.
Ved hjelp av et antistoff microarray analyse (Kinexus, Vancouver, Canada), identifiserte vi STAT3 som et potensielt mål av P-V. Etter en 2-timers behandling av humane PC-celler med P-V 15 uM, mest uttalt effekt var hemmingen av STAT3 fosforylering. Gitt de ovennevnte, undersøkte vi den STAT3 veien ytterligere
i PC-cellelinjer, PV hemmet både konstitutive og IL-6-stimulert STAT3 aktivering, (men ikke STAT5, fig 2A)., Mink STAT3 fosforylering og blokkerer dens binding til DNA. Som et resultat av ekspresjonen av STAT3-avhengige proteiner som Bcl-x
L, Mcl-1 og Survivin, noe som bidrar til resistens mot apoptose ble undertrykket (Fig 2A-B;. Fig. S8). P-V også hemmet hendelser oppstrøms av STAT3 fosforylering, inkludert både JAK2 og Src fosforylering (Fig. 2B). Som vist på fig. 2C, P-V forstyrret sammenhengen mellom STAT3 og HSP90 uten å påvirke sine nivåer (Fig S9.); anstand protein HSP90 forenkler STAT3 fosforylering ved å optimalisere sin konformasjon for fosforylering [26]. Immunhistokjemiske studier av ortotopiske PC xenografter avslørte at P-V hemmet p-STAT3 og total STAT3 uttrykk in vivo samt (Fig 2D.). Hos mus med BxPC-3-xenografter ble behandlet med P-V, ble STAT3 ekspresjon redusert med 81%, sammenlignet med kontrollgruppen (p S10 Fig 0,01.). Immunoblotter av proteinlysatene fra xenografter bekreftet disse observasjonene. PV trykkes uttrykk for Stat3-avhengige proteiner Bcl-x
L og Mcl-en i disse svulstene (Fig. 2E).
(A) immunoblotter av STAT3, fosforylert STAT3 (p-STAT3), STAT5 og p-STAT5 fra BxPC-3-celler behandlet med PV i 1 time og stimulert med IL-6 i 30 min. (B) JAK2 og Src ble immunopresipitert fra kontroll og P-V-behandlede MIA PACA-2-celler, og bunnfallet ble immunoblottet. (C) HSP90 ble immunopresipitert fra kontroll og P-V-behandlede BxPC-3-celler, og bunnfallet ble immunoblottet for STAT3. IgG = Laster kontroll. (D) farging for STAT3 og fosforylert STAT3 (p-STAT3) uttrykk på vevssnitt av MIA PACA-2 ortotopiske svulster fra kontroll og P-V-behandlede mus (x40). Resultatene er uttrykt som prosent av positive celler for p-STAT3 og luminositetsindeks per 40 x felt for STAT3. Verdier er gjennomsnitt ± SEM (n = 7); *
p
0,05 vs
. kontroll. (E) Protein lysates fra BxPC-3 xenotransplantater ble immunblottet for STAT3, Bcl-x
L og Mcl-1 proteiner. Hvert felt representerer en annen tumorprøve. Laster kontroll: β-aktin. Bånd ble kvantifisert og resultatene uttrykt som prosent kontroll for hvert protein. Verdier er gjennomsnitt ± SEM (n = 7); *
p
0,01 vs
. kontroll. (F) (
Øvre
) Cimetidin (CIM) forbedrer P-V hemmende effekt på STAT3 in vivo. Protein lysates fra MIA PACA-2 xenotransplantater ble analysert for STAT3, Bcl-2 og Mcl-1 proteiner ved immunoblotting. Hvert felt representerer en annen tumorprøve. Laster kontroll: β-aktin. (
Nedre
) CIM forbedrer P-V er forstyrrelse av STAT3-HSP90 forening. HSP90 ble immunopresipitert fra MIA PACA-2-celler som ble behandlet med eller uten P-V, CIM eller begge deler. Etter immunoprecipitation ble immunoblotting for STAT3 utført.
Sammen med cimetidin, P-V også undertrykkes uttrykk for STAT3, Bcl-2 og Mcl-en i heterotop MIA PACA-2 xenografter (Fig. 2F). Av interesse, cimetidin forbedret evne til P-V for å forstyrre HSP90-STAT3 foreningen i MIA PACA-2 celler (Fig. 2F). Videre forbehandling av PC-celler med ranitidin, en annen H-2 blokker, klarte ikke å modulere den veksthemmende virkning av cimetidin (fig. S11), noe som tyder på at cimetidin kan ikke opptre utelukkende ved inhibering av H-2-reseptorer.
PV hemmer STAT3 signalisering i PC: Mitokondriell virkning
i mitokondriene, støtter STAT3 Ras-avhengige ondartet transformasjon, og er nødvendig for optimal funksjon av elektrontransportkjeden [4], [5]. I PC-celler, redusert P-V nivåene av STAT3 i mitokondriene uten å påvirke dets cytoplasmatiske nivåer (fig. 3A og S12 fig.). Interessant, VPA hadde ingen effekt på mitokondrie STAT3 nivåer. I motsetning til dette, fosfo-aspirin, som deler med P-V det samme aromatiske linker [13], redusert mitokondrielle STAT3 nivåer (Fig. 3B), som tyder på at bindeledds-del kan delta i denne effekten. Ingen av disse tre stoffene påvirket mitokondrie nivåer av HSP90 og hsp60 proteiner, både importert inn i mitokondriene, noe som indikerer at endringene i Stat3 nivåer var ikke på grunn av en generell undertrykkelse av protein transport inn i mitokondriene.
(A immunoblot) for STAT3, α-tubulin eller COX IV i cytosol (CF) og mitokondrielle (MF) fraksjoner fra MIA PACA-2-celler som ble behandlet med PV i 5 timer. (B) immunoblot for STAT3, HSP90, hsp60, α-tubulin og COX IV i mitokondrielle fraksjoner fra MIA PACA-2-celler som ble behandlet med P-V, VPA eller fosfo-aspirin (P-A) i 3 timer. (C) immunoblotter for p-STAT3
Ser727, STAT3 og HSP90 i mitokondrielle fraksjoner isolert fra MIA PACA-2 transplantater fra kontroll eller 150 mg /kg P-V-behandlede mus. β-tubulin = cytosolic krysskontaminering kontroll; COX IV = mitokondrie lasting kontroll. Hver bane svarer til en annen tumorprøve. (D) P-V reduserer aktiviteten av den mitokondrielle elektronoverførings; kompleks I (NADPH dehydrogenase). Aktiviteten av mitokondriell kompleks I ble målt som beskrevet i Metoder. Verdier er gjennomsnitt ± SEM (n = 3); *
p
0,05 vs
. kontroll. (E) MitoSOX Red, DCFDA og DHE fluorescens ble målt ved strømningscytometri i BxPC-3-celler behandlet med P-V i 1 time. Som positive kontroller, behandlet vi cellene med fosfo-aspirin (P-A) i 1 time, som induserer både DCFDA og DHE [13].
Høyre panel
: Mitokondriell O
2
– nivåer i et panel av seks PC-celler behandlet med P-V 1,5 x IC
50 ° C i 1 time. (F) BxPC-3-celler ble behandlet med PV for opptil 2 timer, etterfulgt av tilsetning av MitoSOX røde sonden og celler ble analysert ved konfokal mikroskopi (x40).
Nuclear-kodede proteiner er importeres til mitokondriene i hovedsak gjennom translocases av mitokondrie ytre membran (TOM) kompleks. TOM20, en komponent av dette komplekset, er vesentlig for spesifisiteten av denne prosessen [27]. P-V svekket assosiasjonen mellom STAT3-TOM20, vist ved immunoutfelling mitokondrielle fraksjoner med et anti-TOM20 antistoff og immunoblotting for STAT3 (fig. S13A). Dette funnet tyder på at P-V reduserer mitokondrie import av STAT3. Dette ble bekreftet av en mitokondriene import analysen.
35S-metionin merket STAT3, generert av
in vitro
sette
STAT3
, ble behandlet med eller uten P-V før dets interaksjon med intakte mitokondriene. P-V reduserte nivået av
35S-STAT3 i mitokondriene, etablere dens evne til å inhibere den mitokondrielle transport av STAT3 (fig. S13B). Det PV hemmer mitokondriell STAT3 ble bekreftet in vivo.: P-STAT3
Ser727 og STAT3 nivåene ble redusert i mitokondriene isolert fra PC-xenotransplantater av PV-behandlede mus, mens de av HSP90-proteinet forble upåvirket (Fig. 3C)
STAT3 optimaliserer funksjonen av elektrontransportkjeden, [5] hovedgeneratoren av ROS. I MIA PACA-2 celler, redusert P-V med 29% (p 0,05) (Fig. 3D) aktiviteten av mitokondrie kompleks I, påvirker ROS produksjon. Ved hjelp MitoSOX Red, en molekylær probe spesifikk for mitokondrie superoksid anion (O
2
-), viste vi at PV økt O
2
-. Nivåer i mitokondriene i seks PC-cellelinjer (Fig 3E -F). Denne effekten var mitokondriene spesifikke, som P-V ikke klarte å overtale andre mobil ROS, bestemmes ved hjelp DCFDA (oppdager flere ROS arter) og DHE (prober for total cellular O
2
-). Som positive kontroller, brukte vi fosfor-aspirin, tidligere vist å indusere både DCFDA og DHE [13]. Av notatet, VPA hadde ingen effekt på ROS, inkludert mitokondrie O
2
– (Fig. S14). Som kombinasjonspartnerne, P-V og cimetidin synergized å øke mitokondrie O
2
– nivåer. P-V og cimetidin hver alene økte andelen MitoSOX Rød (+) PC-celler 3.7- og 0,1-fold, henholdsvis, og 5,6 ganger i kombinasjon (fig. S15A). Effekten av P-V på STAT3 var vesentlig for generering av mitokondriell O
2
-. Denne oppfatningen støttes av funn at når STAT3 ble slått ned, nivåene av mitokondrie O
2
– økt (Fig. 4A), noe som indikerer at STAT3 hemmet produksjonen av O
2
– ved mitokondriene. I motsetning til dette, når vi overuttrykt STAT3, som inkluderte dets overekspresjon i mitokondriene, økningen i mitokondriene O
2
-.-Nivåer i respons til PV ble avskaffet (Fig. 4B)
(A) knocking ned STAT3 øker mitokondrie O
2
– nivåer i BxPC-3 celler. Kontroll-siRNA og STAT3-siRNA celler ble forhåndslastet med MitoSOX Red, og mitokondrie O
2
– ble bestemt ved flowcytometri (
venstre
) eller konfokalmikroskopi (
midt
; x40). (B) STAT3 overekspresjon reduserer økningen i mitokondrie O
2
– indusert av P-V. BxPC-3-celler ble transfektert med en STAT3-uttrykkende plasmid eller en kontroll plasmid (tom vektor) i 48 timer, og deretter behandlet med P-V i 4 timer fulgt av tilsetning av proben MitoSOX Rød. Cellene ble så undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi (x40). (C) P-V kollapser mitokondriemembranen potensial (ΔΨm) i en tids (
toppen
) og konsentrasjonsavhengig (
nederst
) måte. Fluorescens histogrammer ble kvantifisert og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SEM; *
p
0,05 vs
. kontroll. (D) immunoblotter for cytokrom c, pro-caspases og caspases 9 og 3 i cytosolprotein utdrag fra BxPC-3 celler behandlet med P-V. (E) BxPC-3 mitokondrier-mindre (ρ
0) celler er markert mer motstandsdyktig mot P-V-indusert apoptose.
Topp
: immunoblotter for COX IV og STAT3 i foreldre (-) og ρ
0 BxPC-3 celler. Laster kontroll. P-aktin
En konsekvens av den økte mitokondrielle ROS-nivåer var sammenbruddet av mitokondriemembranen potensial (ΔΨm). Behandling av PC-celler med P-V kollapset deres ΔΨm, dokumentert av redusert rød /grønn fluorescerende forholdet mellom celler forhåndslastet med sonden JC-1 (fig. 4C). Sammenbruddet av ΔΨm aktivert den iboende apoptotiske sti, manifestert ved frigjøring av cytokrom c til cytosol (starter fire timer etter behandlingsstart); spalting av procaspase 9 (som starter ved 12 timer); og aktivering av kaspase 3 (som starter ved 18 h) (fig. 4D). Synergien mellom P-V og cimetidin var også tydelig i induksjon av apoptose. Etter 24 timer med behandling med PV /cimetidin, fold-økning på annexinV (+) celler var 2,6, sammenlignet med 1,1 for PV og ingen for cimetidin alene (Fig. S15B).
Disse funnene tyder på at mitokondriene kan formidle PC celledreping effekten av PV. Følgelig genererte vi mitokondrier løse (ρ
0) BxPC-3-celler (i fravær av mitokondrie protein cytokrom c oksidase subenheten IV (COX IV) fra ρ
0-cellene bekreftet deres mangel på mitokondrier). Sammenlignet med foreldre celler, ρ
0 celler var 43% mer motstandsdyktig mot PV-indusert apoptose, som fastslår at mitokondriene megle delvis induksjon av celledød ved PV (fig. 4E).
Overuttrykte mitokondriell STAT3 opphever anticancer effekten av PV
for å bekrefte at STAT3 er et sentralt mål for PV, genererte vi MIA PACA-2 celler stabilt overekspresjon STAT3 (STAT3
høy
), ved hjelp som kontrollerer sine foreldre celler som har basale nivåer av STAT3 (STAT3
normal
). STAT3 overekspresjon avskaffet veksthemmende og proapoptotiske effekten av P-V in vitro (Fig. S16). For eksempel, induksjon av apoptose ved PV i STAT3
høye
celler var mindre enn halvparten av i STAT3
normale
celler (2,2 vs. 5,2 gangers økning av annexin V (+) celler etter 24 timers behandling, fig. S16B). Tilsvarende overekspresjon av STAT3 redusert til det halve induksjon av mitokondrie O
2
– nivåer ved PV (6,1 ganger økning av MitoSOX Rød (+) celler i STAT3
høy
celler vs . 12,6 ganger høyere STAT3
normale
celler, fig. S16C). Overekspresjon av STAT3 i mitokondriene av STAT3
høye
celler ble bekreftet av immunoblotting.
For å vurdere disse funnene in vivo, vi implantert orthotopically inn i nakne mus STAT3
høy
eller Stat3
normale
celler. Etter 18 dagers behandling, PV ikke klarte å påvirke veksten av STAT3
høy
svulster, i motsetning til 72% hemming av STAT3
normale
svulster (p 0,001; fig. 5A). PV klarte å undertrykke nivåene av STAT3 eller dets avhengige proteiner Bcl-x
L, Mcl-en og BCL-2 i STAT3
høye
svulster, mens det gjorde undertrykke dem alle i STAT3
normale
svulster (fig. 5B-C og S17).
(A) MIA PACA-2 celler med basal (STAT3
normal
) eller uttrykt STAT3 (STAT3
høyt
) nivåer ble orthotopically implantert i nakne mus, som så ble behandlet uten (kontroll) eller med PV 150 mg /kg i 18 dager.
Topp
: Bilder av representative pankreastumorer.
Bunn
: Bukspyttkjertel svulst vekt (gjennomsnitt ± SEM). *
p
0,01 vs
. kontroll;
#
p
0,01 vs
. STAT3
høy
P-V-behandlede gruppen. (B) STAT3 og Mcl-1 uttrykk i STAT3
normal Hotell og STAT3
høy
MIA PACA-2 ortotopiske svulst vev seksjoner fra kontroll og PV-behandlede mus (x20 ). (C) immunoblotter for STAT3 og Bcl-x
L i ortotopiske tumorprøver. Hvert felt representerer en annen tumorprøve. Laster kontroll: β-aktin. (D) MIA PACA-2-celler med overuttrykt STAT3 Y705F mutant (STAT3
Y705F
) nivåer ble orthotopically implantert i nakne mus, som så ble behandlet uten (kontroll) eller med PV 150 mg /kg for 18 dager. Bukspyttkjerteltumorvekt (gjennomsnitt ± SEM). (E) ASPC-1 celler med basal (STAT3
normal
) eller overuttrykt mitokondrier-målrettede STAT3 (MLS-STAT3) nivåer ble orthotopically implantert i nakne mus, som så ble behandlet uten (kontroll) eller med PV 150 mg /kg i 21 dager. Bukspyttkjerteltumorvekt (gjennomsnitt ± SEM). *
p
0,01 vs
. kontroll;
#
p
0,01 vs
. MLS-STAT3 PV-behandlede gruppen.
For å bekrefte at mitokondrie STAT3 er en betydelig mål av PV, genererte vi MIA PACA-2 celler stabilt overekspresjon STAT3
Y705F
mutant [16], som beholder mitokondriefunksjon, men mangler atom transkripsjonen aktivitet [5]. Vi implantert disse cellene orthotopically inn i nakne mus, og behandlet dem med eller uten P-V i 18 dager. På offer, PV ikke klarte å påvirke veksten av STAT3
Y705F
svulster, hvis vekten var sammenlignbar med kontrollmusene (Fig. 5D).
For ytterligere å undersøke hvilken rolle
