Abstract
Økende bevis indikerer at Rab GTPases, viktige regulatorer av intracellulær transport i eukaryote celler, spiller en viktig rolle i kreft. Vi analyserte dereguleringen på transkripsjonsnivået av genene som koder Rab proteiner og Rab-samspill proteiner i blærekreft patogenesen, skille mellom de to hoved progresjon veier så langt identifisert i blærekreft: den Ta pathway preget av en høy frekvens av
FGFR3
mutasjon og karsinom
in situ
sti der ingen eller sjelden
FGFR3
mutasjoner har blitt identifisert. En systematisk litteratursøk identifisert 61 gener som koder Rab proteiner og 223 gener som koder for Rab-samspill proteiner. Transcriptomic data ble oppnådd for normale urothelium prøver og for to uavhengige blærekreft datasett som svarer til 152 og 75 tumorer. Gene deregulering ble analysert med SAM (signifikant analyse av microarray) test eller binomial test. Overall, 30 gener ble nedregulert, og 13 ble oppregulert i tumorprøver. Fem av disse deregulerte gener (
LEPRE1
,
MICAL2
,
RAB23
,
STXBP1
,
SYTL1
) var spesielt deregulert i
FGFR3
non-mutert muskel-invasive svulster. Ingen genet som koder for en Rab eller Rab-samspill protein ble funnet å være spesielt deregulert i
FGFR3
-mutated svulster. Cluster analyse viste at
RAB27
clusteret (bestående genene som koder RAB27 og dets samspill partnere) ble deregulert og at dette deregulering ble assosiert med både veier av blærekreft patogenesen. Til slutt fant vi ut at uttrykket av
KIF20A Hotell og
ZWINT
var forbundet med at av sprednings markører og at uttrykket av
MLPH
,
MYO5B
RAB11A
,
RAB11FIP1
,
RAB20 Hotell og
SYTL2
var forbundet med at av uroteliale celledifferensieringsmarkører. Dette systematisk analyse av Rab og Rab effektor genet deregulering i blærekreft, ta relevante kreft undergrupper i betraktning, gir innsikt i de mulige roller Rab proteiner og deres effektorer i blærekreft patogenesen. Denne fremgangsmåten er anvendelig til andre gruppen av gener og typer av kreft
relasjon:. Ho JR, Chapeaublanc E, Kirkwood L, Nicolle R, Benhamou S, Lebret T, et al. (2012) Deregulering av Rab og Rab Effector Gener i blærekreft. PLoS ONE 7 (6): e39469. doi: 10,1371 /journal.pone.0039469
Redaktør: Wanjin Hong, Institutt for molekylær og cellebiologi, Singapore
mottatt 27. januar 2012; Godkjent: 21 mai 2012; Publisert: 19 juni 2012
Copyright: © 2012 Ho et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Centre national de la recherche scientifique (CNRS) og Institut Curie. Molecular Oncology teamet støttes av La Ligue Nationale Contre le Cancer ( «Equipe labellisée»). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Intracellulær menneskehandel er en viktig prosess i eukaryote celler. Det er avhengig av vesikulær eller rørformede transportskip som shuttle mellom cellekamre tilrettelegge konstant utveksling av proteiner og lipider. Mange studier har markert sin kompleksitet og førte til identifisering av et stort antall proteiner som er involvert i de forskjellige trinnene i intracellulær transport, det vil si dannelsen av transportbærere fra donormembraner, deres bevegelse langs cytoskeletal spor og deres deling /fusjon med target membraner. Små GTPases av Rab familien har dukket opp som viktige regulatorer av disse ulike trinnene. Som med andre GTPases, Rab proteiner sykle mellom en inaktiv BNP (guanosine difosfat) -bundet form og en aktiv GTP (guanosin trifosfat) -bundet form. Den aktive GTP-bundet form av Rab er membranbundet, mens hydrolyse av GTP til BNP resulterer i sin dissosiasjon i cytosol. Disse to sykluser styres av et komplekst regulatorisk nettverk av proteiner som inkluderer guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs), GTPase aktiverer proteiner (hull) og guanin nukleotid dissosiasjon hemmere (GDI). I sin aktive form Rab GTPases samhandle med et variert utvalg av effektor proteiner, slik som molekylære motorer, lipid kinaser, tethering faktorer og stillasproteiner (se [1] for vurdering).
Nyere studier har funnet en rolle for en rekke Rab proteiner i kreft hos mennesker. Flere uttrykk studier har antydet at de kunne spille både en aktiverende og en hemmende rolle i tumorprogresjon.
RAB1A
er overuttrykt i tungen plateepitelkarsinom [2].
RAB3A
er uttrykt i insulinoma, men ikke i normale pankreatiske øyceller fra [3].
RAB11A Hotell og
RAB20
uttrykk økes under huden kreft [4] og i eksokrine pankreas adenokarsinomer [5], henholdsvis. I motsetning
RAB37
er nedregulert i metastatiske svulster i lungekreft [6]. Begge
RAB5A Hotell og
RAB7
ble vist å være oppregulert i autonome thyroid adenomer, slik oppregulering blir korrelert med en akselerert tyreoglobulin endocytose og hormonproduksjon [7].
Flere funksjonelle studier har bekreftet rolle Rab proteiner i kreft progresjon. RAB5A, overuttrykt i levercellekarsinom, synes å være bestemmende for leverkreft progresjon, som foreslått av det funn at en dominant negativ form for RAB5A demper EGF-mediert signalisering og cellevandring av en human hepatomcellelinje [8]. Andre resultater har vist at
RAB23
, forsterket og overuttrykt i diffuse-type magekreft, fungerer som en invasjon mekler gen [9]. RAB25 spiller en rolle i utviklingen av både eggstokkreft og brystkreft [10], [11]. Imidlertid har en motsatt rolle
RAB25
også blitt dokumentert, dvs. som en tumor suppressor gen for tykktarmskreft [12]. I tillegg er noen proteiner som er involvert i Rab syklusregulering også vært involvert i kreftutvikling. For eksempel
RIN1
, som koder for en RAB5 GEF, viste seg å være et bryst svulst suppressor genet [13], mens
TBC1D3B
, som koder for en RAB5 GAP, viste seg å være et onkogen forsterkes i prostata kreft [14].
kreft i urinblæren er den fjerde vanligste kreftformen i både europeiske og amerikanske menn. Hos kvinner er det den niende vanligste kreft i USA og 14
th vanligste kreftformen i Europa [15], [16]. I henhold til scenen, ved første presentasjon, omtrent 50% av blærekarsinom er Ta- tumorer som er generelt av lav grad (Ta- svulster er papillærtumorer som ikke invaderer utover basalmembran), 20% er T1 svulster (tumorer som invaderer utover basalmembranen, men ikke det underliggende muscularis propria) og 30% er muskel-invasive tumorer (T2-4). Carcinoma
in situ plakater (Cis) bestående av flat, høy grad av lesjoner ikke invaderende utover basalmembran er sjelden funnet i isolasjon. I stedet er Cis hovedsakelig oppstått med andre urothelial tumorer. Klinisk og molekylære bevis tyder på at blæren svulster oppstår og utvikling langs to hovedveier: «TA» bane og «carcinoma
in situ
» bane. Ta svulster viser en stor grad av tilbakefall (60%, [17]), men har en lav sannsynlighet (5-10%) av videre til T1 svulster og deretter til muskel-invasiv tumorer (T2-4). I motsetning Cis ofte fremgang (i ca 50% av tilfellene), til T1 svulster og deretter til muskel-invasiv tumorer ([18] til vurdering). Den Ta pathway er preget av en høy frekvens av aktiverende mutasjoner i
FGFR3
genet (som koder for tyrosinkinase fibroblast growth factor receptor 3).
FGFR3
mutasjoner er til stede i 70-75% av TA svulster og fraværende fra Cis. Deres relativt lav frekvens i T1 (20%) og T2-4 svulster (10-15%) er i tråd med den høye frekvensen av Cis progresjon og den lave frekvensen av Ta progresjon [19] – [24].
målet med dette arbeidet var å utføre en systematisk studie for å identifisere Rab proteiner og Rab-samspill proteiner hvis uttrykk er deregulert i TA og Cis veier av blæretumor patogenesen ved transcriptomic nivå.
Resultater
For denne studien, søkte vi strategien presentert i figur 1 (flytskjema). Kort fortalt: 1. en uttømmende liste av gener som koder for Rab og Rab-veksel ble etablert fra offentlige databaser, 2. deregulerte gener (opp- eller nedregulert i forhold til normal urothelium) i hver av de to baner (
FGFR3
-mutated svulst sti og
FGFR3
non-muterte tumor sti) ble identifisert fra to transkriptom datasett, 3. deregulerte gener muligens på grunn av svulst stroma eller svulst – stroma interaksjoner ble identifisert og deretter utelatt fra videre analyse (analyse av transkriptom data i blæretumorcellelinjer sammenlignet med normale celler i kultur (NHU)), 4. for hver deregulert gen, en spesifikk assosiasjon enten med
FGFR3
-mutated tumor gruppe eller ikke- -mutated tumor gruppe ble undersøkt, så vel som en tilknytning til en differensiering eller proliferasjon fenotype. I tillegg har vi undersøkt for hver Rab klynge (bestående av en gitt Rab protein og dets samspill partnere) om det kunne være forbundet med blærekreft patogenesen.
Det første trinnet er å identifisere gjennom offentlige databaser og spisskompetanse på gener av interesse å studere, her Rabs og deres effektorer. Det andre trinnet består av å velge undergrupper av tumorer og analysere ekspresjon av forskjellige gener som er valgt i det første trinn i disse pasienter sammenlignet med normale urothelium. Den undergruppering her er gjort tar hensyn til
FGFR3
mutasjonsstatus, scenen og karakteren, skille svulster i to veier. En sammenligning av ekspresjon observert i blærecancercellelinjer og i dyrkede normale humane urotelialceller lov til kassering av gener som ekspresjonen kan være muligens på grunn av tilstedeværelse av stroma (i forhold til normale celler, oppregulering i blæretumorer, men ikke i blæren tumorcelle-linjer). Ulike typer analyser ble så utført på de valgte deregulerte gener: 1) en sammenligning av uttrykket i
FGFR3
-mutated svulster og
FGFR3
-Ikke-muterte tumorer tillot identifisering av gener spesifikt deregulert i en av de to veier av blærekreft patogenesen; 2) ved å gruppere gener inn klynge av gener (her de Rab klynger), identifiserte vi klynger med deregulert uttrykk; 3) ved å analysere mulig sammenheng mellom uttrykket av de deregulerte gener og uttrykk for spredning eller differensiering markørgener, identifiserte vi de deregulerte gener assosiert med spredning eller differensiering.
Resultatene oppnådd på hvert trinn av analysene er oppsummert i figur 2.
resultatene fra hvert analysetrinn er vist i flytskjemaet vist i figur 1.
Definisjon av listen av gener som skal analyseres
Den første delen av dette arbeidet besto av å etablere en liste av gener som koder for Rab proteiner og Rab-samspill proteiner, inkludert aktivering GEF og inaktivere GAP proteiner (figur 3). 61 mennesker
RAB
gener ble funnet. Listen over Rab-samspill proteiner ble etablert av litteratursøk for å samle papirer som har rapportert identifisering og /eller karakterisering av proteiner som kommuniserer direkte med Rab GTPases, ved hjelp av ulike tilnærminger (to-hybrid analyser, GST-trekke ned, coimmunoprecipitation , etc.). Denne listen består 217 proteiner: 23 GEFs, 20 hull og 174 effektor proteiner. Vi har lagt til denne listen to gener som koder for de to GDI (BNP Dissosiasjon Inhibitor) proteiner (
GDI1 Hotell og
2
) som er felles for alle Rab GTPases. Vi inkluderte også fire gener som koder for proteiner involvert i post-translasjonell modifikasjon og membran sammenslutning av alle nylig syntetiserte Rabs:
CHM Hotell og
CHML
koding for Rab eskorte proteiner (REP) og to isoformer av Rab geranylgeranyl transferase (
RABGGT A Hotell og
B
). Dette gjorde totalt 284 Rabs og Rab-samspill proteiner (figur 2).
Rab GTPases syklus mellom en aktiv GTP-bundet form og en inaktiv BNP-bundet form. Rab aktivering formidles av en guanin utveksling faktor (GEF). Hydrolysen av bundet GTP katalyseres av en GTPase-aktiverende protein (GAP) som resulterer i inaktivering av Rab proteinet. I dets aktive form er Rab forbundet med membraner og kan samvirke med et utvalg av effektor-proteiner. I sin inaktiv form proteinet er cytosoliske og er i kompleks med en BNP dissosiasjon inhibitor (GDI) protein.
Listen av gener analysert i denne studien, og listen over artikler der de opprinnelig ble beskrevet er vist i tabell 1 og tabell S1. Figur 4 illustrerer klynge av proteiner vist å interagere med RAB27A /B (som et eksempel) og figur S1 illustrerer alle Rab klynger analysert; Rab proteiner er i gul, GEFs i grønn, hull i lyserøde og effektor proteiner i blått.
Eksempel på Rab27 klyngen. Den Rab27 klyngen består av de to
RAB27
isoformer (
RAB27A Hotell og
RAB27B
), GEF
MADD
, GAP
TBC1D10A Hotell og 12 effektor proteiner. De andre Rab og Rab-samspill proteiner er vist i supplerende figur S1.
Modell av blærekreft patogenesen brukt i denne studien
To hoved progresjon trasé har vært så langt identifisert i blærekreft, den Ta pathway preget av en høy frekvens av
FGFR3
mutasjon og karsinom
in situ plakater (Cis) sti der ingen eller sjelden
FGFR3
mutasjoner har blitt identifisert. I denne studien har vi derfor vurdert to veier:
FGFR3
-mutated svulst sti og
FGFR3
non-muterte tumor pathway (figur 5).
FGFR3
-mutated svulst pathway omfattet TaG1 og Tag2
FGFR3
-mutated svulster, T1
FGFR3
-mutated svulster og muskel-invasiv
FGFR3
-mutated tumorer (T2-4 svulster). Vi analyserte to sett med blæretumorer (n = 152 i den første datasettet og n = 75 i det andre datasettet). Antallet
FGFR3
-mutated TAG3 var for liten til å identifisere dem som en separat gruppe (2 svulster i de første datasettet og en tumor i den andre datasettet), men de kan ikke begge være inkludert i TaG1 /Tag2 gruppe på grunn av deres ulike kliniske og molekylære egenskaper slik at de ikke ble vurdert i analysen.
FGFR3
non-muterte tumor pathway omfattet TAG3
FGFR3
-Ikke-muterte tumorer, T1
FGFR3
-Ikke-muterte tumorer og muskel-invasiv
FGFR3
-Ikke-mutert svulster. Transcriptomic data fra KIS svulster var ikke tilgjengelig i vår serie. Vi brukte
FGFR3
-Ikke-mutert TAG3 svulster i stedet for Cis. Disse svulstene dele flere eiendommer med Cis som de utvikle seg til en invasiv scenen [25] med en høy sannsynlighet (45%, [26]). I tillegg har begge lesjoner er mikroskopisk ligner på enkelt celle eksamen. TaG1 /Tag2 svulster ikke mutert for
FGFR3 plakater (9 prøver i det første settet med data, 2 prøver i det andre settet med data) ble ikke vurdert i analysen som de ikke passer i Cis vei: ja disse svulstene er av lav karakter, og de sjelden videre til T1 og deretter til muskel-invasiv svulster [26].
Identifikasjon av opp- eller ned- regulerte gener
for å identifisere gener opp – eller nedregulert i løpet av blærekreft progresjon, ble de to baner av «FGFR3 modellen» analyseres separat. Vi brukte de tre gruppene, TAG3, T1, og T2-4, tidligere definert for
FGFR3
non-mutert veien og de tre gruppene, TaG1G2, T1, og T2-4 for
FGFR –
mutert svulst pathway (figur 5). For hver tumor gruppe, ble ekspresjon av Rab og Rab-vekselproteingener som er oppført i tabell S1 i forhold til deres ekspresjon i normal urothelium (oppnådd uten stroma) -gruppe ved bruk av den statistiske testen SAM. Resultatene ble filtrert med følgende terskler: Brett Change (FC) 1.5 for oppregulering (og 0,667 (= 1 /1,5) for nedregulering) og qValue 5%. Vi først analysert en samling av prøver som inneholdt fire normale urothelium og 141 tumorprøver (se Materiale og metode) ved hjelp av Affymetrix HG U133 Plus 2.0 DNA-mikromatriser. 269 av de 284 genene er oppført i tabell S1 var til stede i disse mikromatriser. For
FGFR3-
ikke-muterte tumor vei, 19 gener ble funnet å være nedregulert og 12 gener oppregulert (tabell 2); for
FGFR-
mutert svulst vei, 21 gener ble funnet å være nedregulert og 4 gener oppregulert (Tabell 3) (sammendrag i figur 2).
«FGFR3 modell «av blærekreft progresjon skiller en
FGFR3
non-muterte tumor sti og en
FGFR3-
mutert svulst veien. Cis: Carcinoma
in situ
. Stages ble definert av 1997 TNM klassifisering og karakterer av 1973 World Health Organization klassifiseringen (se Materiale og metode for referanse).
Vi deretter analysert et annet sett av svulstene verifisere de oppnådde resultater. Dette settet, samlet uavhengig av det første settet, ble analysert med Affymetrix HG U95A /U95Av2 DNA-mikromatriser og inneholdt fem normal urothelium og 72 tumorprøver (se Materiale og metode). Bare 165 av de 284 gener som er oppført i tabell S1 (58%) var til stede i disse mikromatriser. Blant de 31 gener funnet å være opp- eller nedregulert i
FGFR3-
ikke-muterte tumor pathway (tabell 2), 17 var til stede på Affymetrix HG U95A /U95Av2 DNA-mikromatriser:
CASP1
,
CAV1
,
CD2AP
,
EEA1
,
ICA1
,
ITGA5
,
MICAL2
,
PIGR
,
RAB11A
,
RAB14
,
RAB31
,
RAB4A
,
RABAC1
,
STXBP1
,
TBC1D30
,
TBC1D4 Hotell og
ZWINT
. Blant de 25 gener funnet å være opp- eller nedregulert i
FGFR3-
mutert svulst pathway (tabell 3), 14 var til stede på Affymetrix U95A /U95Av2 DNA-mikromatriser:
CAV1
EEA1
,
ICA1
,
ITGA5
,
PIGR
,
RAB11FIP2
,
RAB14
,
RAB27A
,
RAB27B
,
RAB9A
,
RABGAP1L
,
SDC1
,
TBC1D30 Hotell og
UNC13B
. For disse genene, ble 56% av de resultater som oppnås med det første settet med data validert med det andre settet av data med minst ett terskel fattet: FC 1,5 (eller 0,667) og /eller qValue mindre enn 5% (tabell S2). De andre resultatene var ikke signifikante. Av notatet, ble det ikke uharmoniske resultat mellom de to datasett funnet.
Expression analyser av oppregulert gener in vitro
En svulst er sammensatt av både kreft og stromale celler. Som transcriptomic Analysen er utført med denne blanding av celler, oppregulering av et gitt gen kan da være på grunn av tilstedeværelsen av stroma (gener oppregulert i stroma eller i kreftceller på grunn av stromal celle – tumorcelleinteraksjon) .
For å løse dette problemet, vi analysert i normal menneskelig urothelial (NHU) celler dyrket i kultur i henhold regenererende og differensierende forhold [27], [28] og i 7 etablerte blærekreft cellelinjer (uten stromale celler) uttrykket av de 13 gener funnet å være oppregulert i
FGFR3-
ikke-muterte og muterte kreft trasé:
CAV1
,
ITGA5
,
KIF20A
,
LEPRE1
,
MICAL1
,
MICAL2
,
RAB23
,
RAB31
,
RABAC1
,
SDC1
,
STXBP1
,
TMEM22 Hotell og
ZWINT plakater (tabell 2 og tabell 3). For de fleste av de genene, har vi funnet det minste en kreftcellelinje i hvilken dens ekspresjon var minst to ganger høyere enn i dyrkede normale urotelialceller. Dette var ikke tilfelle for
MICAL1
,
RABAC1 Hotell og
SDC1 plakater (figur 6). Overekspresjon av
MICAL1
og
RABAC1
er sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av stromale celler i svulsten som
MICAL1
er sterkt uttrykt i ulike typer hematopoetiske celler (dendrittiske celler , mast-celler og NK-celler), og
RABAC1
i mastceller (data ikke vist). Overekspresjon av
SDC1
kan skyldes stromal-epitelial interaksjon.
MICAL1
,
RABAC1 Hotell og
SDC1
ble ekskludert for videre analyse (se sammendrag i figur 2).
uttrykk for den 13 oppregulert gener (tabell 2 og 3) (
CAV1
,
ITGA5
,
KIF20A
,
LEPRE1
,
MICAL1
,
MICAL2
,
RAB23
,
RAB31
,
RABAC1
,
SDC1
,
STXBP1
,
TMEM22 Hotell og
ZWINT
) ble målt ved Affymetrix array i 7 blærekreft cellelinjer (KK47, MGHU3, RT112, RT4, scaber, SD48 og T24) og normale menneskelige urothelial (NHU) celler dyrket i kultur. Terskelen for gener for å bli betraktet som oppregulert i tumorcellelinjer (2 ganger ekspresjonen målt i NHU-celler) er representert ved en sort linje.
Genes særskilt opp- eller ned-reguleres i hver vei
Blant de genene som finnes skal dereguleres under blærekreft progresjon (tabell 2 og tabell 3), 13 var felles for begge veier, 10 nedregulert:
EEA1
,
ICA1
,
MLPH
,
MYO5B
,
MYO5C
,
PIGR
,
RAB14
,
RPH3AL
,
SYTL2
,
TBC1D30 Hotell og 3 oppregulert:
CAV1
,
ITGA5
,
MICAL1
. For å søke etter gener spesifikt deregulerte i hver vei, vi gikk videre i to trinn. 1. Vi valgte gener funnet betydelig opp- eller ned- regulert bare i
FGFR3-
ikke-muterte tumor gangsti eller i
FGFR3
-mutated svulst veien. 9 nedregulert og 8 oppregulert gener ble valgt for
FGFR3
non-muterte tumor sti og 11 nedregulert gener ble valgt for
FGFR3-
mutert svulst pathway (tabell S3, venstre kolonne). 2. Vi brukte statistisk SAM test for å sammenligne uttrykket av de utvalgte genene i svulsten gruppen av samme scene, men av motsatt
FGFR3
mutasjonsstatus (tabell S3, høyre kolonne).
SYTL1
var signifikant nedregulert i T2-4 (
FGFR3
non-mutert) tumor gruppe mens
LEPRE1
,
MICAL2
,
RAB23 Hotell og
STXBP1
var signifikant oppregulert i samme tumor gruppe (tabell 4 og figur 7, se sammendrag i figur 2). Ingen genet ble funnet å være spesielt deregulert for
FGFR3-
muterte tumorer.
Uttrykk for
SYTL1
,
LEPRE1
,
MICAL2
,
RAB23 Hotell og
STXBP1
målt ved Affymetrix array i normale prøver (n = 4) og
FGFR3
-mutated tumorprøver (TaG1G2, n = 28; T1 , n = 13; T2-4, n = 9), og
FGFR3-
ikke-muterte prøver (TAG3, n = 3; T1, n = 25; og T2-4, n = 63). Er representert den 10. persentilen (under bar), den 25. persentilen (boks nederst), median (bar i boksen), den 75
th persentil (boks øverst) og 90
th persentil (øvre bar) . Punktene representerer uteliggeren prøvene.
SYTL1
er nedregulert i
FGFR3
-Ikke-muterte tumorer, mens
LEPRE1
,
MICAL2
,
RAB23 Hotell og
STXBP1
er oppregulert.
Analyse av klynger av gener
i forrige del av denne studien, brukte vi den statistiske SAM test for å analysere hver for ekspresjon av hvert gen i løpet av blærekreft progresjon. For å undersøke hvorvidt et Rab klynge (bestående av en gitt Rab protein og dets samvirkende partnere, se figur 4 og figur S1) kan være spesifikt assosiert med blærekreft progresjon, brukte vi det statistiske binomial test for å bestemme om prosentandelen av gener deregulert innenfor et gitt Rab gruppe var signifikant større enn den prosentvise oppnådd ved å analysere hele Rab og Rab-vekselproteingener. Denne test ble anvendt for hver klynge Rab innenfor hver tumor gruppe og resultatene ble filtrert med terskelen p-verdi mindre enn 1%. Interessant, Rab27 klyngen passert denne terskelen for T2-4 tumor gruppene både
FGFR3-
ikke-mutert og muterte kreft trasé (Tabell 5 og Tabell S4, se sammendrag i figur 2). I tillegg til
RAB27A Hotell og
RAB27B
, genene nedregulert i denne klyngen består av
GCC2
,
MLPH
,
RPH3AL
,
SYTL1 Hotell og
SYTL2
.
gener assosiert med spredning
for å vurdere en mulig sammenslutning av de deregulerte gener som er oppført i Tabell 2 og tabell 3 med celleproliferasjon, beregnet vi en Pearson korrelasjon mellom deres uttrykk og at markøren spredning genet:
MKI67 product: [29]. For denne analysen, blant de 6 gruppene utgjorde for denne studien, jobbet vi med de to homogene svulst grupper med høyere antall prøver: den Ta G1 /G2 (
FGFR3
-mutated) tumor gruppe (28 prøver) og scenen T2-4 (
FGFR3
non-mutert) tumor gruppe (63 prøver). Vi først merke, som forventet, at uttrykket av
MKI67
var signifikant høyere i T2-4 (
FGFR3
ikke-mutert) gruppen enn i Ta G1 /G2 (
FGFR3
-mutated) gruppe (ca 3 ganger, Student test, p = 8.8E-10). Vi valgte å filtrere Pearson korrelasjonsverdier med terskelen: | r | 0,479 (pVal 1%) for den Ta G1 /G2 (
FGFR3
-mutated) tumor gruppe og | r | 0,323 (pVal 1%) for T2-4 (
FGFR3
non-mutert) tumor gruppe. Ekspresjon av et gen som ble ansett å være korrelert med ekspresjonen av
MKI67
hvis p-verdi mindre enn 1% med begge tumor grupper. Uttrykket av
KIF20A Hotell og
ZWINT
ble korrelert, mens uttrykk for
MYO5C
ble omvendt korrelert, med uttrykk for
MKI67 plakater (Figur 8 og tabell S5, se sammendrag i figur 2)
Pearson korrelasjonskoeffisient (r) mellom uttrykket av de deregulerte gener og uttrykk for markør spredning genet,
MKI67
, ble beregnet for.
FGFR3
-mutated svulster i TaG1G2 gruppe (n = 28) og for
FGFR3
-Ikke-mutert svulster i T2-4 (n = 63). Uttrykket av de deregulerte gener som en funksjon av
MKI67
uttrykket vises i TaG1G2
FGFR3
-mutated tumorer (øvre tall) og i T2-4 ikke-muterte tumorer (lavere tall). Bare tomter for korrelerte gener presenteres (p 1%, noe som tilsvarer en korrelasjonskoeffisient, | r | over 0,479 for
FGFR3
-mutated tumor gruppe og over 0,323 for
FGFR3
non-muterte tumor gruppe).
gener assosiert med differensiering
den samme analysen ble utført for å evaluere foreningen av deregulerte gener med differensiering prosessen med urotelialceller. De uroplakin gener
UPK1A
,
UPK1B
,
UPK2
,
UPK3A Hotell og
UPK3B
, koding for urothelium spesifikke markører [ ,,,0],30] – [33] og de to genene
GRHL3 product: [34] og
FOXA1 product: [28], koding for transkripsjonsfaktorer, ble brukt som markører for urothelial differensiering. Vi brukte de samme to tumor grupper som ovenfor. Resultatene av Pearson korrelasjon ble filtrert med de samme terskler som ovenfor, og vi betraktet at ekspresjon av et gen som er korrelert med ekspresjonen av et annet gen hvis p-verdi var mindre enn 1% for begge tumor grupper. Resultatene er vist i Tabell 6 og Tabell S6. Syv gener ble funnet å være korrelert med minst en urothelial differensiering markør:
ANKRD27
,
MLPH
,
MYO5B
,
RAB11A
,
RAB11FIP1
,
RAB20 Hotell og
SYTL2
. To gener ble funnet å være omvendt korrelert med minst en urothelial differensiering markør.
CASP1 Hotell og
RAB27A plakater (se sammendrag i figur 2)
Gene uttrykk i Nhu celler i kultur
Normale mennesker urotelialceller (NHU celler) kan vokse i kultur for et endelig antall passeringer før de trer i senescence. Før senescence, kan differensiering induseres ved å dyrke dem i bestemte medier. Her NHU-celler, etter passasje, ble enten dyrket i ikke-differensierende betingelser (kontroll) eller i differensiere betingelser (i nærvær av en EGFR (epidermal growth factor receptor) inhibitor og en aktivator av PPARγααμμ (peroksisom proliferator-aktivert reseptor gamma)) [28]. I kontrollbetingelser, cellene når konfluens og blir kontakt-inhibert, mens i differensierende forhold de også slutter å vokse, men begynne å uttrykke markører for urothelial terminal differensiering, for eksempel uroplakins (UPKs).
Vi brukte Affymetrix data for Nhu celler i ulike forhold for å se på uttrykket av gener tidligere funnet å være assosiert i svulster med spredning eller differensieringsmarkører. De NHU uttrykk data ble oppnådd på forskjellige tidspunkter etter passering: 6 timer, 1 dag, 3 dager og 6 dager, med eller uten differensiering medium. Som vist i figur 9, et uttrykk for
KIF20A
og
ZWINT
redusert i kulturer behandlet med differensieringsmedium, så vel som i kontrollkulturer ved oppnådd konfluens, som indikerer en kobling mellom disse to genene med spredning. I denne modellen
MYO5C
ble ikke knyttet til proliferasjon, som observert i tumor ekspresjonsdata, men med differensiering (økt ekspresjon i differensieringsmediet, men ikke i kontrollmediet). Blant de 7 genene positivt korrelert med differensiering markører i svulstene, ble seks faktisk indusert av differensiering medium (
MLPH
,
MYO5B
,
RAB11A
,
RAB11FIP1
,
RAB20 Hotell og
SYTL2
), men ikke
ANKDR27
. Ingen av de to genene omvendt korrelert med differensiering (
CASP1 Hotell og
RAB27A
) ble nedregulert ved differensiering i Nhu celler.
uttrykk av genene funnet å være assosiert med proliferasjon eller differensiering i svulster ble målt i normale urotelialceller (NHU) i kulturen på fire forskjellige tidspunkter etter passasje: 6 timer, 1 dag, 3 dager og 6 dager i differensierende betingelser (i nærvær av en inhibitor av EGFR og en aktivator av PPARγααμμ i NHU medium) eller i ikke-differensierende forhold (NHU medium only).
Diskusjoner
Økende bevis indikerer at Rab proteiner og deres effektorer er involvert i kreft progresjon , både som inhiberende og fremme faktorer. Men så vidt vi vet ingen systematisk studie har adressert sin deregulering under kreft progresjon. I denne studien har vi identifisert flere gener som koder for Rabs og Rab-samspill proteiner hvis uttrykk er deregulert i løpet av blærekreft patogenesen.
relevans av to veier modellen
Basert på klinisk og molekylær bevis
