Abstract
Bakgrunn
Eggstokkreft er den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner. Tidlig stadium sykdommen er fortsatt ofte ubemerket på grunn av mangel på symptomer og pålitelige biomarkører. Identifiseringen av tidlige genetiske endringer kan gi innsikt i nye signalveier som kan utnyttes for tidlig oppdagelse og behandling.
Metodikk /hovedfunnene
Mus eggstokkene overflaten epithelial (Mose) celler ble brukt til å identifisere scenen avhengige endringer i genuttrykk nivåer og signaltransduksjonsveier av musen hele genomet microarray analyser og genet ontologi. Disse cellene har gjennomgått spontan transformasjon i cellekultur og overført fra ikke-tumorigent til middels og aggressive, ondartede fenotyper. Betydelig endrede gener var overrepresentert i en rekke veier, særlig cytoskjelettet funksjonell kategori. Samtidig med genuttrykk endringer, ble cytoskeletal arkitektur gradvis uorganisert, noe som resulterer i avvikende uttrykk eller subcellulære fordeling av sentrale cytoskeletal regulatoriske proteiner (brennvidde heft kinase, α-actinin, og vinculin). Den cytoskeletal uorden ble ledsaget av endrede mønstre av serin og tyrosin fosforylering samt endret uttrykk og subcellulære lokalisering av integrert signalmellom APC og PKCβII.
Konklusjoner /Betydning
Våre studier har identifisert gener som er avvikende uttrykk under MOSE celle neoplastisk progresjon. Vi viser at tidlig feilregulering av aktin microfilaments følges av progressiv uorden av mikrotubuli og intermediate filamenter på senere stadier. Disse scene-spesifikke, trinnvise endringer gi ytterligere innsikt i tid og romlig sekvens av hendelser som fører til fullt forvandlet staten ettersom disse endringene er også observert i aggressive menneske eggstokkreft cellelinjer uavhengig av deres histologisk type. Videre er våre studier støtter en kobling mellom avvik cytoskjelett organisering og regulering av viktige nedstrøms signaleringshendelser som kan være involvert i kreftutvikling. Dermed vår MOSE-avledet celle modellen representerer en unik modell for inngå mekanistiske studier av kreft progresjon eggstokkreft
Citation:. Creekmore AL, Silkworth WT, Cimini D, Jensen RV, Roberts PC, Schmelz EM (2011) endringer i genekspresjon og Cellular Architecture i en Ovarian Cancer Progresjon Model. PLoS ONE 6 (3): e17676. doi: 10,1371 /journal.pone.0017676
Redaktør: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, USA
mottatt: 12 november 2010; Godkjent: 08.02.2011; Publisert: 03.03.2011
Copyright: © 2011 Creekmore et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studiene ble støttet av NIH R01 CA118846 (til EMS, PCR) og AICR gi 04B071 (EMS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
eggstokkreft utgjør bare 3% av diagnostisert kreft, men er den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinne, med fem års overlevelse på bare 45% [1]. Gjennomsnittsalderen for diagnose er 63 år, og de fleste pasientene (62%) til stede med metastatisk sykdom ved diagnosetidspunkt [1]. Eggstokkreft er en heterogen sykdom med ulike historiker eller clinicopathological subtyper som utvikler og nåværende annerledes. Den konvensjonelle syn er at ca 90% av ovariekreft er utledet fra det encellede lag av flate epitel som omgir eggstokk [2]. Som eggstokkepitelet forvandles til en ondartet fenotype, skiller den inn i flere undergrupper som har blitt kategorisert i serøs, mucinous, endometrioid og klarcellet karsinom, basert på deres morfologi snarere enn deres genotype [3]. Men opprinnelsen til enkelte subtyper kan variere og et høyere bidrag fra egglederne og endometrium til flere aggressive kreftformer er for tiden i dialog [4]. Opprinnelsen til både eggstokkene og fallopian epitel er den samme, nemlig cølomepitelet [2] som kan bidra til uenigheten.
Epithelial eggstokkreft viser en høy grad av genetisk heterogenitet som et resultat av mutasjoner, stanse, og slettinger. Ettersom endringer i genekspresjon, enten gjennom mutasjon, epigenetisk regulering, eller differensiell spleising hendelser, påvirke tumorutvikling, progresjon, medikament respons og til slutt overlevelse av pasienten, er identifisering av svulsten subtype og dens genetiske fingeravtrykk avgjørende. Nylig har en ny klassifisering av epiteliale ovarietumorer i type I og type II kreft foreslått: type 1 er godartet til Borderline tumorer med relativt stabile genotyper mens type II omfatter aggressive og høy klasse svulster som er genetisk ustabile og utviser betydelige genetiske endringer [ ,,,0],5]. De fleste epiteliale kreftformer følge en progresjon ordning der initiert celler utvikle seg til adenomer til adenokarsinomer og metastasering, samler genetiske endringer på trinnvis måte under progresjon [6]. Denne sekvensen er også blitt beskrevet for lav grad av eggstokkene karsinomer; Det er imidlertid diskutert om alle eggstokkreft følge denne kreftutvikling siden forstadier for de mest aggressive ovarietumorer (type II) ikke er entydig identifisert [5]. Nylig, Lee et al. har foreslått at fimbria av egglederen kan være opprinnelsen for «Type II» serøse celler karsinomer [7]. De foreslår at type II svulster oppstår fra «p53 signatur» forstadier som stammer fra forsterkning av sekretoriske epitelceller. Påfølgende mutasjoner så lette progresjon til serøs tubal intraepitelial karsinom og til slutt til serøs carcinoma.
Foreløpig har genuttrykksmønster kun blitt brukt med hell til å skille mellom mucinous og klarcellet fra serøs karsinom [8] eller mellom lavgradig , lav malignt potensial og høy klasse, metastatiske svulster [9], [10], [11]. Pålitelige molekylære eller kliniske markører for å identifisere er ikke klarlagt ennå endringer i de tidlige stadiene av progresjon, og siden de tidlige stadiene av sykdommen er relativt asymptomatiske diagnosen ofte bare skjer på sene stadier. Derfor karakterisering av genuttrykk profiler av tidlige stadiet forstadier av kreft i eggstokkene kan gi ny innsikt og identifisere nye mål for forebyggende og behandlingstiltak.
Vi har tidligere utviklet og preget en celle modell av epitelial eggstokkreft progresjon å studere sekvensen av hendelser som fører til ovarialcancer [12]. De syngene mus eggstokkreft overflaten epithelial (MOSE) celler, avledet fra C57BL6 mus, har gjennomgått spontan transformasjon i cellekultur. De heterogene Mose celler gjennomgår forskjellige fenotypiske endringer som de kontinuerlig passert i kultur, med tidlige passasjer som representerer en premaligne, ikke-tumorigent fenotype, middels passasjer som representerer en overgangs fenotype, og senere passasjer som utvikler seg til en svært aggressiv malign fenotype når det gis til immunkompetente mus . Overgangs statene progresjon var lett gjenkjennelig med endringer i vekstrater, cellestørrelse, tap av kontakt hemming av vekst, og evnen til å vokse som kuler under ikke-heftende forhold. Viktigere, både mose-I (mellomprodukt passasje) og MOSE-L (late passasje) cellene har også anskaffet evnen til å danne svulster når de injiseres i bukhulen til syngeniske immunkompetente mus, enskjønt den tidligere ble mindre invasiv [12].
i denne studien har vi identifisert betydelige endringer i genuttrykk mønstre som ikke-transform MOSE-deriverte celler overgang til mer aggressive fenotyper og brukte genet ontologi verktøy for å bestemme deres funksjonelle kategorier. Overgangs tilstander av denne modellen mulig for oss å identifisere scenen avhengige gener, genprodukter og signaltransduksjonsveier involvert i eggstokkene tumor progresjon. Her kan vi markere progressive endringer som fører til en svært feilregulert cytoskjelettet. Mange av disse endringene ble bekreftet i arkiv menneskelige eggstokkreft microarray datasett. Viktigere, viser vi at cytoskjelettet uorden kan ha dyptgripende virkninger på subcellulære lokalisering av viktige signalmellomprodukter, som til slutt kan føre til modulerte signalveier som bidrar til eggstokkreft utvikling. Disse genene, deres genprodukter og de tilhørende signalveier kan representere nye mål for tidlig intervensjon av neoplastisk progresjon.
Resultater
Forskjellig regulerte gener i mus eggstokkreft progresjon
Å identifisere genuttrykk endringer i løpet av progresjon av epitelial eggstokkreft og bestemme mulige scenespesifikke mønstre, vi brukte hele genomet microarray analyse for å sammenligne genuttrykk nivåer i celler som representerer godartet (MOSE-E), middels (MOSE-i), og ondartet ( MOSE-L) stadier av mus eggstokkreft. Tre biologiske replikater ble anvendt for å ta hensyn til variasjoner i de heterogene kulturer. Av de 45,102 probe sett på microarray (som representerer 18,136 kommenterte gener), ble 960 probe sett funnet å være signifikant oppregulert (701 kommenterte gener) og 1006 ble betydelig nedregulert (711 kommenterte gener) større enn 2 ganger (p≤ 0,05) mellom MOSE-E og MOSE-L-celler. Av disse 1966 skiftende probe-sett, 58,9% viste ingen signifikant endring i ekspresjonsnivåene under progresjon mellom MOSE-E og MOSE-I, noe som indikerer at majoriteten av forandringer i gen-ekspresjon er assosiert med senere hendelser i forbindelse med malign progresjon i vår modell, med 608 økende og 549 mink som celler overgang fra MOSE-i til Mose-L. I motsetning til 33,3% av de berørte genene viste en progressiv økning (272 probe sett) eller reduser (382 probe sett) i uttrykk som celler overgang fra MOSE-E til Mose-I til Mose-L-celler (figur 1). Et lite antall berørte sonder sett, 3,9%, demonstrerte MOSE-I /MOSE-E forhold som var innenfor 0,4 fold av MOSE-L /MOSE-E forhold, noe som indikerer at disse genuttrykk endringene kan være forbundet med svært tidlige hendelser i ondartet progresjon av våre celler. Sammen indikerer disse data at de fleste av endringer i genekspresjon nivåer enten skje kontinuerlig, på en trinnvis måte, gjennom hele utviklingen av vår modell eller finner sted i senere faser, mens bare en begrenset undergruppe endring i løpet av tidlige stadier. Den komplette datasettet kan bli funnet i GEO data base (GSE24789).
Av 45,102 probe sett analysert, 970 var signifikant (p≤0.05) oppregulert (A) og 1006 ble nedregulert (B ) større enn to ganger. Pilene viser mønsteret av uttrykk endres med antall probe sett indikert ved siden av pilen. Probe sett indikert som andre ikke følger de beskrevne mønstre.
overrepresentert genet ontologi kategorier i eggstokkreft progresjon
For å oppdage veier som kan bidra til å fremme og progresjon av eggstokkreft kreft, Gene Trail programmet ble anvendt for å identifisere de funksjonelle grupper av gener som viser statistisk signifikante endringer i deres ekspresjonsnivåer mellom MOSE-E og MOSE-L-celler. Gene Trail er en avansert gen sett berikelse analyseverktøy som bestemmer over-representert genet ontologi kategorier i datasett [13]. Den over-representerte cellulær komponent, biologisk prosess, og molekylær funksjon gen ontologispråk kategorier funnet i mose-L versus MOSE-E differensielt uttrykte gensesett er angitt i tabell 1 (p 0,01). Overrepresentasjon av gener i cellesyklus og celleproliferasjonsprosesser kategorier var forventet på grunn av tidligere rapportert økt vekst av MOSE-L-celler [12] og involvering av ukontrollert cellevekst i kreft [14]. Interessant, cytoskjelettet og Metal Ion /kation-bindende kategorier representert et betydelig antall av de differensielt uttrykte gener, med en betydelig overlapping av gener som er kategorisert i begge disse ontologispråk kategoriene. Men i motsetning til det brede spekter av funksjoner av gener i Metal Ion /Kasjon bindende kategori, gener samlet i cytoskjelettet genet ontologi kategorien var funksjonelt svært spesifikke. Siden det er antatt at endringer i ekspresjonsnivåer av cytoskeletal proteiner og deres regulatorer er forbundet med progresjon og metastase [15], [16], [17], endringene i gener som er involvert i strukturen og regulering av cytoskjelettet under progresjon av vår MOSE modellen var gjenstand for videre etterforskning.
disorganization for mobiltelefon cytoskjelettet i løpet av ondartet progresjon
Actin cytoskjelett.
av de 141 genene kategorisert i cytoskjelettet gen ontologi kategori, 90 har genprodukter som er subenheter av actin filamenter (tabell 2), eller er involvert i organisasjonen og regulering av aktin cytoskjelettet (Tabell 3, full liste i supplerende tabell S1). For de fleste av disse genene, uttrykk nivåer gradvis endret på en trinnvis måte som cellene overført fra MOSE-E til Mose-I for å MOSE-L, noe som indikerer at disse endringene er kontinuerlig oppstår gjennom progresjon. Bare tre gener, γ-aktin 1, formin en, og drebrin 1, demonstrerte MOSE-I /MOSE-E forhold som var innenfor mindre enn 0,4 ganger av MOSE-L /MOSE-E forhold, noe som tyder på dette er tidlige endringer i ondartet progresjon (tabell 2 og 3). Syv gener, inkludert integrin-αv, -β1, og -β2 viste ekspresjonsnivåer som endret ved den største magnitude i MOSE-I-celler, hvorav to ble bekreftet ved QRT-PCR (tabell 2 og tabell 3). Et stort antall av disse genene er dysregulerte i kreft eller involvert i metastase inkludert alle de 15 gener som ble bekreftet av QRT-PCR (tabell 2 og 3).
Bilder
genprodukter av en undergruppe av gener bekreftet ved QRT-PCR ble også analysert ved hjelp av western blot, så vel som immunofluorescens-mikroskopi for å bestemme mulige forskjeller i deres subcellulære lokalisering. Microarray Resultatene indikerte en progressiv reduksjon av α-aktin og γ-aktin mRNA, som ble bekreftet ved QRT-PCR (tabell 2), imidlertid ble det ikke observert forandringer av β-aktin. Dette tilsvarer en nedgang i totale aktin protein nivåer under progresjon (figur 2A). Videre undersøkelse av F-aktin arkitektur ved immunfluorescens mikroskopi viste tydelige forskjeller i aktin subcellulære organisasjonen. MOSE-E celler utstilt lang, veldefinerte kabel-like stresset fibre etter farging med Alexa Fluor
488 konjugert phalloidin, mens ondartede MOSE-L-celler vises mindre distinkte F-aktin strukturer og organisasjon. (Figur 3A, en
st kolonne). I MOSE-L-celler, aktin strukturer varierte fra små tynne stresset fiber til prominente «ruffled» soner med svært korte aktin filamenter, som minner om podosomes (figur 3A og 3B, confocal bilde 2 innfelt). Av notatet, MOSE-I utstilt F-aktin uorden lik som MOSE-L-celler (figur 3A). Å spesielt sammenligne cellular F-aktin innhold mellom MOSE cellelinjer, ble en prosedyre basert på fluorescens-konjugert phalloidin ansatt. Som vist i figur 4, ble totalt cellulært F-aktin ble redusert med 78% (p 0,01). I MOSE-L-celler sammenlignet med MOSE-E-celler, noe som bekrefter QRT-PCR og Western-resultater
Hele celleekstrakter fra MOSE-E (E, hvite stolper), MOSE-i (i, grå søyler), og MOSE-L (L, svarte søyler) celler ble underkastet Western blot-analyse med antistoffer rettet mot (A) aktin regulerende proteiner og ( B) mikrotubulidynamikk proteiner. Expression nivåer er uttrykt som prosent MOSE-E nivåer normalisering til ribosomalt protein L19 (RPL19) eller γ-tubulin i tre biologiske replikater gjort i duplikat ± standardavvik. En representant blot fra de tre biologiske replikater vises. * P≤ 0,01.
(A) Immunofluorescent farging av MOSE-E, MOSE-I og MOSE-L-celler til å visualisere aktin filamenter (phalloidin, grønn), α- tubulin (2
nd kolonne), β- tubulin (3
rd kolonner), eller cytokeratin (4
th kolonne) sammen med kjernen (blå, DAPI). (B og C) Trippel farging av MOSE-E og MOSE-L-celler med DAPI (blå), phalloidin (f-aktin, grønn), og antistoffer mot α-actinin (rød, B) eller vinculin (rød, C). De konfokale bilder som vises, er 0,6 um fra hverandre inne i cellen, med bilde en starter på bunnen av cellen og bilde to mot toppen av cellen. Samlokalisering vises som gul i fusjonerte og confocal bilder. (D) Trippel farging av MOSE-E og MOSE-L-celler med DAPI (blå), antistoff mot FAK (grønn), og antistoff mot FAK fosforylert tyrosin 861 (rød, FAK
Y861). Gul i sammenslåtte bildet viser samlokalisering. (Original forstørrelse X600)
like mange MOSE-E eller MOSE-L-celler der belagt. Etter 48 timer ble cellene fiksert med paraformaldehyde og farget med phalloidin konjugert med Alexa Fluor
488. Den phalloidin ble solubilisert med MeOH og fluorescensen ble bestemt. Data ble normalisert til cellenummer, og presentert som gjennomsnitts relative fluorescerende enheter (RFU) per celle ± standardavvik. . * P≤ 0,01
Konfokalmikroskopi avslørte stor forskjell i tykkelsen av cellene; MOSE-E-celler hadde en gjennomsnittlig tykkelse på 2 um, indikerer disse cellene er ganske flat når dyrket på plast, mens MOSE-L-celler viste en gjennomsnittlig tykkelse på 4,4 um tvers cytoplasmatiske regioner. De konfokale bilder som er vist på figur 3B (konfokalt bilde 1 og 2) er etterfølgende z-stabler 0,6 mikrometer fra hverandre starter på bunnen av cellen hvor aktin fibrene finnes rikelig ved tilknytningsseter. Siden den gjennomsnittlige MOSE-L-celle er 4,4 mikrometer tykt, og fanger den andre bildet omtrent den midterste tredjedel av cellen, ikke membranen, noe som tyder på ikke-fibrøse strukturer i MOSE-L-celler er ikke et resultat av membranen rusket. Men de er inne i cellen cytoplasma og minner om strukturer karakterisert ved invasiv brystkreft celler som podosomes [18]. I kontrast, MOSE-E (figur 3B) celler viste stresset fiber gjennom cellene uten korte aktin filamenter.
mikrotubuli.
genprodukter som komponerer eller regulerer microtubule nettverket består den nest største sett av gener (44 av 141) berørt under neoplastisk transformasjon av Mose celler (tabell 4; full liste i supplerende tabell S2). Alle bortsett fra seks gener er bare opp- eller nedregulert i MOSE-L-celler. Fem gener (Tubb2b, Cenpe, Mtap6, NDN, og Vav2) hadde uttrykk nivåer som gradvis endres fra MOSE-E til Mose-I for å MOSE-L, noe som indikerer at disse endringene er kontinuerlig oppstår gjennom progresjon. Bare ett gen, Ninl, demonstrerte MOSE-I /MOSE-E-forhold at der i løpet av mindre enn 0,4 ganger av MOSE-L /MOSE-E forhold, noe som tyder på at dette er en tidlig begivenhet i ondartet progresjon (tabell 4). Interessant, av 44 forskjellig uttrykt microtubule og mikrotubulidynamikk assosierte gener, 12 genene koder for proteiner involvert i kromosom congression (Kif18a, Kif22, Kif4), segregering (ASPM Cenpe, Ckap2, Incenp, Jub, Kif20a, Kif23, Lats2, Prc1) og /eller cytokinese (Incenp, Kif20a, Kif23, Prc1) (tabell 4) [19]. Alle 12 gener viste redusert ekspresjon med fem av de 12 gener som koder for kinesins som er molekylære motorer som bruker energi av ATP-hydrolyse for å bevege seg langs overflaten på mikrotubul filamenter eller destabilisere dem [19], [20].
En betydelig reduksjon i nivåene av α-tubulin isoform 4a og flere isoformer av β-tubulin ble også bemerket i de mikroarray data. Bekreftelse av QRT-PCR av individuelle isoformer viste seg å være vanskelig på grunn av høye nivåer av homologi, men reduksjon av tubulin β3 mRNA i MOSE-L-celler ble bekreftet. Det ble imidlertid ikke vesentlige endringer av beta-tubulin protein nivåer mellom MOSE-E og MOSE-L-celler påvises (figur 2B). I motsetning til dette, ble a-tubulin proteinnivåer ble redusert med 34% i MOSE-L-celler og 67% i MOSE-I-celler i forhold til MOSE-E-nivåer. Det ble ikke observert signifikante endringer i y-tubulin mRNA (data ikke vist) eller proteinnivå (figur 2B) og farging viste ingen lett merkbar forskjell i protein lokalisering mellom MOSE-E og MOSE-L-celler (data ikke vist).
Viktigere var det betydelige forskjeller mellom MOSE-E og MOSE-L-celler når subcellulære organisering av mikrotubulidynamikk proteiner, a- og β-tubulin, ble undersøkt ved immunfluorescens (figur 3A). I MOSE-E celler, både α- og β-tubulin vises så lenge definert filamenter som stråler ut fra hva som er sannsynlig å være den perinukleær lokaliserte centriole (figur 3A, 2
nd og 3
rd kolonner toppanelet), rapporterte å være en normal organisering av tubulin i epitelceller. I motsetning til i MOSE-L-celler tubulin filamenter var mindre definert, viser tilfeldig uorganisert forgrening og opprinnelsen til tubulinpolymerisering var ikke lett synlig i mange celler (figur 3A, 2
nd og 3
rd kolonner, bunnpanelet ). MOSE-I-cellene synes å ha en mellomliggende fenotype med centriole tydelig i omtrent 50% av cellene sammen med kortere, mindre definerte filamenter enn i MOSE-E-celler (figur 3A, 2
nd og 3
rd kolonne , mellompaneler).
intermediate filamenter.
den endelige undergruppe av berørte cytoskjelett forbundet gener (7/141) har genprodukter som utgjør og regulerer mellomfilament (IF) nettverk. De mRNA-nivåer for antall cytokeratins redusert i MOSE-L-celler med cytokeratins 7,8, og 19 bekreftet ved QRT-PCR (tabell 5). Immunfarging med en pan-cytokeratin-antistoff viste at MOSE-E-celler har en godt organisert mellomliggende filamentnettverk som strekker seg i hele celler, mens de mellomliggende filamentnettverk i MOSE-L-celler består av korte trådformede strukturer som ikke utstråle gjennom hele cellen i en organisert måte (figur 3A, siste kolonne). Veldefinerte cytokeratin filamenter ble registrert i bare ca 25% av MOSE-I celler, mens resten av celler som viser diffus cytokeratin farging med begrenset organisasjon som minner om MOSE-L-celler.
Sammenligning med arkivert menneskelige eggstokkreft microarray datasettene
for å bestemme relevansen av de observerte endringene i cytoskjelettet genuttrykk nivåer av vår MOSE celle progresjon modell for menneskelig eggstokkreft, vi evaluert arkiverte DNA microarray datasettene som sammenlignet genuttrykk nivåer i ulike etablerte menneske eggstokkene cellelinjer med normale eggstokkene overflaten epitelceller som referanse (se Materialer og Metoder for en beskrivelse av cellelinjer evaluert). Selv differensial uttrykk for cytoskeletal gener ikke var et samlingspunkt i disse humane studier, ca 50% av aktin og fokale heft forbundet gener oppført i tabell 2 som signifikant nedregulert i løpet av MOSE celle progresjon var også signifikant nedregulert i den menneskelige eggstokkene cellelinjer. Som vist i tabell 6, var det en klar anrikning for betydelige endringer i aktin og kontaktklebe tilhørende gener. Ved å bruke den kumulative fordelingen bionomial, en beregning av sannsynligheten for å observere dette mange forskjellig uttrykt aktin og fokal adhesjon gener i humane studier av tilfeldighet var 2,23 x 10
-6 og 1,87 x 10
-7, henholdsvis for sammenligningen med data fra Nagaraja et al. [21] og Iorio et al. [22]. I tillegg, sammenlignende analyse viste at flere andre aktinbinding gener som er oppført i tabell 3, var signifikant nedregulert i de humane ovarie cancer-cellelinjer. Av notatet, ble Marcks og Tpm2 nedregulert av 10- og 23 ganger i henholdsvis aggressive ovarietumorceller forhold til normal OSE. Overlappingen av forskjellig uttrykt gener i microtubule funksjonell kategorien nådde ikke signifikans [21]. Dette kan være et resultat av de forholdsvis små endringer i genekspresjon nivåer i denne kategorien. Men NDN genet, som var 27 ganger nedregulert i mose cellene, var så mye som 125 ganger nedregulert i den menneskelige kreftcellelinjer [21]. Sammen disse resultatene tyder på at endringer i cytoskjelettet er felles for mange eggstokkreft cellelinjer uavhengig av deres histologisk type.
Endringer i aktin cytoskjelettet regulering og arkitektur i løpet av neoplastiske progresjon
Å bestemme mekanismene for cytoskeletal deregulering under MOSE ondartet progresjon, undersøkte vi uttrykket nivåer og subcellulære lokalisering av flere regulatoriske proteiner, inkludert α-actinin, vinculin og fokal vedheft kinase (FAK). Disse proteinene ble valgt på grunn av deres engasjement i cytoskjelettet regulering, cellemotilitet og kreft progresjon /metastase. α-actinin er involvert i aktin bunting av tverrbindings aktin filamenter, og er en del av det sentrale adhesjon kompleks som binder aktin cytoskjelettet til integriner [23], [24]. Microarray Resultatene indikerte progressivt avtagende α-actinin ekspresjonsnivåer som ble bekreftet ved QRT-PCR (tabell 2). α-actinin proteinnivåer ble signifikant redusert i både MOSE-I og MOSE-L-celler sammenlignet med MOSE-E-celler (figur 2A). En distinkt ko-lokalisering av α-actinin (rød) med aktin filamenter (grønn) som går parallelt med den fremre kant alltid var lett synlig i MOSE-E-celler (Figur 3B). I MOSE-L-celler, α-actinin dukket opp i stor grad som diffus farging i cytoplasma med betydelig mindre tydelig co-localiziation med aktin filamenter (figur 3B, rød). Dette ble også observert i MOSE-I-celler (data ikke vist). Konfokalmikroskopi indikert α-actinin ikke co-lokalisere til de svært korte aktin filamenter og uorganisert aktin finnes i MOSE-L-celler (Figur 3B, confocal bilder og innfelt).
I tillegg til aktin filament bundling, α -actinin fungerer som en plattform for å formidle protein-protein interaksjoner, inkludert de som er involvert i å danne og opprettholde fokale sammenvoksninger [23], [24]. Mose celler hadde variable nivåer av genprodukter kjent for å omgås eller modulere fokale sammenvoksninger (tabell 2, Focal Adheranser). Også en rekke genprodukter direkte forbinder med α-actinin modulere fokale sammenvoksninger (zyxin, vinculin, inte b1 og b2) eller regulere aktin (Palladin og syndecan). Endringer i mRNA-nivåer av flere av disse genene ble bekreftet ved QRT-PCR (tabell 2). Viktigere, gener assosiert med kreft progresjon (dvs. Itgb2, Itgb5, paxillin, Fyn) vises økt uttrykk, mens de tenkte å undertrykke progresjon (dvs. vinculin, Gravin) viste redusert nivå av uttrykk i forhold til MOSE-E celler.
Vinculin, som binder aktin og er en del av det sentrale vedheft kompleks knytte aktin til inte, viste både redusert mRNA (tabell 2) og proteinnivå (Figur 2A) i løpet av ondartet progresjon. For å visualisere mulige endringer i subcellulære lokalisering, ble MOSE celler immunostained for både F-aktin og vinculin (figur 3C). I MOSE-E-celler, vinculin co-lokalisert til endene av aktin bunter, som danner veldefinerte kontakt vedheft strukturer som ligner den som er observert for ikke-transformerte epitelceller. I kontrast vinculin flekker var i stor grad diffus og bare marginalt samlokalisert med aktin fibrene i MOSE-L-celler. Naturlig, brenn vedheft lignende strukturer i MOSE-L-celler var mindre definert og mer punktformet. Konfokalmikroskopi avslørte at vinculin ble distribuert gjennom cytoplasma av MOSE-L-celler og ikke ser ut til å knytte direkte med uorganisert aktin, (figur 2C, confocal bilder). Lignende vinculin fargemønstre ble observert hos 90% av MOSE-I (data ikke vist), noe som tyder på at avvikende vinculin subcellulære lokalisering er en tidlig hendelse som celler overgang fra MOSE-E til Mose-I.
Den primære komponent av fokal adhesjon, FAK, viste ikke signifikante endringer i mRNA-nivåer i løpet av MOSE progresjon (tabell 2). Imidlertid FAK protein nivåer var signifikant forhøyet i begge MOSE-I og -L-celler sammenlignet med MOSE-E (figur 2A). For å finne ut om det er også en endring i FAK aktivitet og lokalisering, ble MOSE celler immunofluorescently farget for total FAK (rød) og FAK fosforylert på tyrosine861 (FAK-P
Y861, grønn) (Figur 3D). Av notatet, fosforylering av FAK på tyrosin Y
861 av Src, en av to rester fosforylert av Src, bidrar til celle migrasjon [25], [26]. Som vist i figur 3D, ble FAK bare marginalt forbundet med membraner av MOSE-L-celler sammenlignet med den lyse punktformet flekk på celle periferien av MOSE-E, men ble snarere diffust fordelt i cytosol. Totalt var det svært lite punktat farging av FAK i periferien av MOSE-L-celler. Interessant, det perifere total FAK samlokalisert med den aktive FAK-Y
861, noe som tyder på at perifere FAK er aktiv i både MOSE-E og -L celler (figur 3C, slå sammen). Siden FAK flekker krever MeOH fiksering, gjorde konfokalmikroskopi ikke gi konkluderende resultater med hensyn til samlokalisering av diffuse total FAK og pFAK-Y
861 observert i MOSE-L-celler. Dermed er det uklart om diffuse lommer av uorganisert aktin og total FAK bidra til redusert dannelse av brennvoksn observert i MOSE-L-celler.
neoplastiske cytoskjelettet endrer innflytelse signaltransduksjonsveiene
cytoskjelettet spiller en viktig rolle i tumorcelleprogresjon og arrangementer som migrering og invasjon, slik at cellene til å tilpasse seg og overleve i forskjellige mikromiljøer; forbindelser som regulerer cytoskjelettet organisasjonen har blitt brukt som kreftbehandling [27]. På den annen side, organiseringen av cytoskjelettet påvirker cellulære organisasjon, adhesjon komplekser og polaritet, og vesikulær transporter. Som nevnt ovenfor, vises det subcellulære lokalisering av proteiner forbundet med fokal adhesjon aberrasjoner samtidig behandling med uorganisert tilstand av cytoskjelettet. Dette kan gi kreftceller til å omgå cellulære homeostatiske reguleringsmekanismer ved å avlede signalanlegg proteiner til forskjellige steder, og dermed endre tilgjengeligheten av bindingspartnere eller underlag, noe som kan endre signaltransduksjonsveiene. Siden avvikende signalisering er et tegn på ondartethet [28], farging for globale tyrosin og serin-fosforylerte proteiner ble anvendt som en generell måler av signaltransduksjonsbane organisasjon og funksjon.
tyrosinfosforylering, en indikator på reseptor og ikke- reseptor-tyrosinkinase-aktivitet, spiller en kritisk rolle i kreftceller, som regulerer proliferasjon, differensiering og metabolisme;
