Abstract
Bakgrunn
Vi har nylig publisert den sjeldne påvisning av xenotropisk murine leukemi virus-relatert virus (XMRV) (1/105) i prostatakreft (PCA) vev av pasientene i Nord- Europa ved PCR. Den kontroversielle diskusjonen om virus blir oppdaget i PCA vev, blodprøver fra pasienter som lider av kronisk utmattelsessyndrom (CFS), samt fra et betydelig antall friske kontroller bedt oss om å utdype våre studier om påvisning av XMRV infeksjon anvende ulike deteksjonsmetoder (PCR, cocultivation og immunhistokjemi [IHC]).
metodikk /hovedfunnene
perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra 92 PCA og 7 friske kontroller ble isolert, PHA aktivert og cocultivated med LNCaP celler for opptil 8 uker. Supernatanten fra disse cellene ble påført på en reporter cellelinje, Derse-iGFP. Videre ble PBMC og cocultivated LNCaP-celler testet for tilstedeværelse av XMRV ved hjelp av PCR, så vel som Western Blot-analyse. Mens alle PCR presiseringer og Western Blot analyser var negative for tegn på XMRV infeksjon, Derse-iGFP celler vises isolert GFP positive celler i tre tilfeller. I alle tre tilfellene XMRV nærvær ikke kunne bekreftes av PCR-teknologi. I tillegg utførte vi XMRV bestemt IHC på PCA vevssnitt. Hele vevssnitt (n = 20), samt microarray (TMA) inkludert 50 benign prostatahyperplasi (BPH), 50 lav karakter og 50 høy klasse PCA seksjoner og TMA inkludert brystkreft, tykktarmskreft og normalt vev ble farget med to XMRV spesifikke antisera. XMRV protein uttrykk ble ikke påvist i noen kreft seksjoner inkludert. En BPH vev vises XMRV bestemt protein uttrykk i tilfeldige isolerte basal celler.
Konklusjon
Vi kan ikke entydig påvise XMRV i blod fra PCA pasienter eller fra friske kontroller, og det er ingen bevis av XMRV protein uttrykk i PCA, brystkreft og tykktarmskreft vevssnitt testet av IHC farging
Citation. Stieler K, Schindler S, Schlomm T, Hohn O, Bannert N, Simon R, et al. (2011) Ingen detektert av XMRV i blodprøver og vevssnitt fra prostatakreftpasienter i Nord-Europa. PLoS ONE 6 (10): e25592. doi: 10,1371 /journal.pone.0025592
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 07.06.2011; Godkjent: 06.09.2011; Publisert: 12 oktober 2011
Copyright: © 2011 Stieler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Foreløpig påvisning av xenotropisk Murine Leukemi Virus relaterte retrovirus (XMRV) i menneskelige bio prøver er kontroversielt diskutert alt fra XMRV bli assosiert med to store menneskelige sykdommer, kronisk utmattelsessyndrom (CFS) [1], [2] og prostatakreft (PCA) [3], [4] for å være en menn generert laboratorium forurensning på grunn av xenograft aging gjennom mus [5] – [18]
i 2006 har XMRV blitt identifisert i prostata vev fra pasienter med kjent prostatakreft (PCA) bærer en homozygot mutasjon i. RNAseL gen (R462Q) [19]. Sammenhengen mellom XMRV og PCA ble kraftig forsterket av studier som viser XMRV protein ekspresjon, så vel som tilstedeværelse av XMRV sekvenser i opp til 26% av alle tilfeller PCA [3], [4], [20]. XMRV protein uttrykk ble hovedsakelig sett i ondartet epitel tyder på en mer direkte rolle i tumorigenesis. Det er imidlertid flere studier bare sjelden eller helt unnlate å oppdage XMRV i prostatakreft prøver ved hjelp av PCR eller IHC metoder [3], [4], [9], [21] – [26]. Vi har nylig oppdaget at XMRV ved lav frekvens (1%) i sporadiske PCA prøver fra Nord-Europa ved hjelp av PCR-amplifikasjon metoder og RNA isolert fra friske frosne vevsprøver [27]. Ekspresjon av XMRV protein, så vel som tilstedeværelse av XMRV sekvenser i opp til 26% av alle analyserte PCA-prøvene ble demonstrert i 2009 ved anvendelse av immunhistokjemi (IHC) av hele monterings PCA-seksjoner med en anti-XMRV spesifikt antiserum [4], [20 ]. Men gjorde en fersk rapport med Rauscher MLV gag antisera som også anerkjenner XMRV gag protein, ikke bekrefte disse funnene [24]. Studien av Schlaberg et al. bedt oss å se utbredelsen av XMRV i PCA prøver ved IHC siden fokale infeksjoner sett av IHC kan være savnet i PCR-analyse. I tillegg vurderer vi tilstedeværelsen av XMRV protein uttrykk i deler av andre kreftformer samt normalt vev ved IHC. Som bruker, nylig publisert anti-XMRV serum [4] samt en XMRV gag spesifikt antiserum vi klarte ikke å påvise XMRV gag spesifikk farging av celler i PCA eller annen kreftvev. Men en godartet prostatahyperplasi (BPH) delen vises tydelig positive fargede celler ved hjelp av anti-XMRV gag K121 serum.
I 2009 XMRV ble identifisert i opptil 68% av PBMC (perifert blod mononukleære celler) prøver fra pasienter med kronisk tretthetssyndrom og 3-4% av kontrollgruppen viste tegn til infeksjon XMRV [2]. PCR-data ble styrket av cellen avhengig samt celle gratis overføring av viruset fra blodprøver av CFS-pasienter til indikatorceller. Men flere påfølgende studier av andre laboratorier unnlatt å bekrefte PCR data og ingen virus overføring eksperimenter har blitt reprodusert oppdatert [6], [9], [10], [11], [13], [15], [17 ], [18], [28], [29], [30], [31]. Nylig ble blodprøver fra ME-pasienter som tidligere er rapportert å inneholde XMRV sekvenser testes, men ble identifisert som XMRV negativ med PCR forsterkning strategier og serologiske metoder [12], [32].
Tidligere i år, mens denne studien var i gang, flere publikasjoner adressert risikoen for forurensing av spor av mus DNA (parafinsnitt, cellelinjer eller andre kilder) [7], [13], [15], og risikoen for falske positive PCR-produktene ved noen kommersielle forsterkersett [17], [33]. I tillegg, Hue og kolleger hevder at på grunn av den manglende sekvens variasjon av XMRV genfragmenter i-pasienter sammenlignet med sekvensen variasjon identifiseres i en XMRV positiv cellelinje 22Rv1, kan XMRV være et laboratorium forurensning i stedet for en sann eksogent menneskelig virus [11 ]. En sterk indikasjon på at XMRV er et virus som sirkulerer i den menneskelige populasjonen er identifikasjonen av viral integrering områder i vertsgenomet [34]. Imidlertid nyere funn viser at to integrerings områder som er publisert tidligere, er identiske med XMRV integrasjons områder i en in vitro-infisert cellelinje DU145 [35]. Videre Paprotka og kolleger gir bevis for at XMRV stammer fra to muse endogene pre-virus som gjennomgikk retroviral rekombinasjon i cellekulturer og dermed tyder på at alle XMRV sekvenser rapportert hittil har mest sannsynlig stammer fra denne cellekultur hendelsen [14]. I det presenterte studie rettet vi påvisning av XMRV og beslektede MLV-sekvenser i perifere blodceller fra prostata kreftpasienter og friske kontroller motivert ved påvisning av XMRV i blodceller på 3-4% av friske kontroller [2], og vår hypotese om at XMRV replikasjon kan bli aktivert på grunn av immunsuppresjon som ledsager PCA og deretter påvises i blodet hos pasienter. Til sammen 100 blodprøver ble tatt med i vårt studium. PBMC ble isolert, stimulert og senere brukes til genomiske DNA-isolering eller cocultivation eksperimenter følgende publiserte protokoller [1], [2]. Videre ble proteinekstrakter fra aktiverte PBMC generert og analysert for XMRV protein uttrykk. Vi viser at PBMC generelt kan være in vitro infisert med XMRV, noe som resulterer i 1-2% infiserte celler som lett kan overvåkes ved hjelp av PCR eller proteinekspresjon analyser som derved bekrefter nylig publiserte resultater [10]. Selv om virale genomer er sterkt redigert på grunn av Apobec begrensning, supernatant fra XMRV infiserte PBMC effektivt infiserer en reporter cellelinje, Derse-iGFP. Denne cellelinje (generert av Vineet N. KewalRamani, National Cancer Institute, Frederick, USA) uttrykker en GFP reporter som aktiveres ved revers transkriptase uttrykk. Selv om følsomheten for alle teknikker som brukes i vår studie er ganske høy, ble det ikke XMRV sekvenser eller XMRV spesifikt protein ekspresjon detektert i aktiverte PBMC. Interessant, vi har oppdaget i supernatanten fra 3/67 aktiverte PBMC og 2/67 cocultivation eksperimenter av PBMC med LNCaP celler, RT aktivitet resulterer i GFP positive Derse-iGFP celler, men vi var ikke i stand til å utvetydig bevis på at disse PBMC har blitt infisert med XMRV, kan andre kilder til RT aktivitet ikke utelukkes.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av etikkomiteen av Federal State Hamburg (ingen . OB-052-04).
Studier befolkning og prøveinnsamling. Studiepopulasjonen og prøveinnsamling
Blodprøver av 92 prostatakreftpasienter (alder 44-77) ble samlet en dag før radikal prostatektomi. Kliniske data er oppsummert i tabell 1. I tillegg ble blodprøver fra 7 menn (alder 30-44) uten noen bevis på PCA inkludert i studien. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke for den vitenskapelige bruken av blodprøver; EDTA-blod fra pasienter og friske kontroller ble behandlet av densitetsgradientsentrifugering hjelp Ficoll (Biocoll, Biochrom L6715). Primære blod mononukleære celler (PBMC) ble skilt, og dyrket som beskrevet nedenfor.
Cellelinjer
Den humane prostatacancer LNCaP-cellelinje (ATCC # CRL-1740), LNCaP DERSE- iGFP (vennlig levert av Vineet N. KewalRamani, National Cancer Institute, Frederick, USA) og XMRV positive menneskelige prostatakreft cellelinje 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco) supplert med 10% FCS, 5 % Penicillin /streptomycin og L-glutamin. Kronisk infiserte LNCaP celler (XMRV) ble generert ved transfeksjon av førvirus XMRV VP62 DNA som er publisert tidligere [36] og vedlikeholdes i flere uker. PBMC ble isolert fra 10 ml EDTA-blod og dyrket i RPMI 1640 (Gibco) tilsvarende etablerte prostatacancercellelinjer, men i tillegg supplert med PHA (5 pg /ml, Thermo Fisher Scientific) og rhIL-2 (180 IU /ml, R D Systems).
Cocultivation eksperimenter
1 ml cellesuspensjon som inneholder 1 × 10
6-3 × 10
6 PBMC aktivert for 7 dager ble lagt inn i 2 × 10
5 LNCaP-celler opprettholdt i 2 ml RPMI inneholdende 8 ug /ml polybren i 6-brønns plater. Plater ble sentrifugert i 30 minutter ved 37 ° C og 800 x g. PBMC ble fjernet 24 timer senere. LNCaP-celler ble dyrket i 6-8 uker. Cellene ble splittet når nå 100% samløpet. Supernatanter ble tatt etter 6 og 8 uker, og påført på Derse-iGFP celler (se nedenfor).
For positive kontroller human PBMC ble infisert med XMRV-inneholdende supernatant fra LNCaP-celler XMRV. Angitte mengde av virusinneholdende supernatant fra XMRV produserende celler (minst 80% konfluens) ble sterilfiltrert og tilsatt til 3 x 10
6 PBMC-pre-aktivert i to dager. Plater ble sentrifugert i 30 minutter ved 37 ° C og 800 x g. XMRV supernatant ble fjernet neste dag ved pelletering cellene ved 200 × g, vaske dem med 10 ml PBS (Gibco) og formidling av etter en ekstra sentrifugering skritt i en ny seks-brønns plate i 2 ml RPMI som inneholder PHA og rhIL-2. PBMC ble dyrket i 7 dager før analysere supernatanten, co-dyrking, nukleinsyre og protein utvinning.
Infeksjon bruker replikering kompetente XMRV
XMRV VP62 førvirus DNA ble transfektert inn LNCaP celler til å produsere virus som inneholder supernatanten som beskrevet tidligere [34], [36].
PCR
Genomisk DNA ble ekstrahert fra PBMC ved bruk av Qiagen QIAamp mini-kit og lagret ved 4 ° C. Nukleinsyre konsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop (Peqlab). Forskjellige nestede PCR målrettet mot gag og env-sekvenser ble utført som nylig er publisert [1], [3], [19], ved bruk av 650 ng templat-DNA pr reaksjon. Gag utenfor primer: 5′-419F ATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGAC-3 «, 5′-1154R GCCGCCTCTTCTTCATTGTTCTC-3′; inne primer: NP116F 5′-CATGGGACAGACCGTAACTACC-3’and NP117R 5»-GCAGATCGGGACGGAGGTTG-3 «. For å bestemme sensitiviteten til Gag PCR opprinnelig publisert av Urisman et al. de følgende primere ble anvendt: GAG AV 5»-CGCGTCTGATTTGTTTTGTT-3 «, 5′-GAG OR CCGCCTCTTCTTCATTGTTC-3′, 5»-GAG IF TCTCGAGATCATGGGACAGA-3 «og 5′-GAG IR AGAGGGTAAGGGCAGGGTAA [19]. Det env-PCR ble utført som nylig er publisert [3] ved hjelp av de følgende primerpar F 5»-ACCAGACTAAGAACTTAGAACCTCG-3 «, R5′-AGCTGTTCAGTGATCACGGGATTAG-3′, 5»-IF GAACAGCATGGAAAGTCCAGCGTTC-3 «og 5′-IR CAGTGGATCGATACAGTCTTAGTCC-3» . Integriteten til DNA-prøver og tilstedeværelsen av antatte inhibiters ble kontrollert ved å forsterke GAPDH, F 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 «og R 5’GAAGATGG TGATGGGATTTC-3».
Western Blot
Cellelysater ble generert ved hjelp RIPA buffer som inneholder 1% Triton-X 100 og proteasehemmer mix (Roche). Spesifikke proteinbånd ble oppdaget av polyklonale konvolutt antistoff Rauscher 77S85 (gave C. Stocking, Heinrich-Pette Institute, Hamburg, Tyskland), XMRV bestemt kaninpolyklonalt Gag serum K121 og p30-Gag gjenkjenne hybridomsupernatant fra CRL-1912 celler (ATCC) . Like protein beløp per kjørefelt ble sikret med anti-human aktin antistoff mAb 1501 (Chemicon) inkubasjon. For påvisning av XMRV partikler i cellekultursupernatanter ble sterilfiltrert kulturmediet av infiserte celler ultrasentrifugert 1 time, 110.000 x g ved 4 ° C (Beckman SW60Ti). Den pellet av 11 ml supernatant ble resuspendert i 10 mL PBS og analysert ved immunoblotting.
Cell linje parafinsnitt og TMA
1 × 10
7 celler (LNCaP, LNCaP kronisk infisert med XMRV , 293T, 293T kronisk infisert med XMRV og mus SC1 celler) ble løst i 20 timer i 10% fosfat bufret formalin, forankret i agar og bearbeidet til parafin voks [37].
En forhåndsdefinert TMA inneholder prostatavevet ( 50 lav karakter PCA, 50 høy klasse PCA og 50 benign prostatahyperplasi (BPH)) ble brukt for IHC.
Immunhistochemistry
Lysbilder med parafinsnitt av prostatakreftpasienter ble opprinnelig deparaffinized hjelp xylen. For antigen innhentings seksjoner ble oppvarmet 4 x 2 min i en citrat-buffer ved bruk av en mikrobølgeovn (650 W) og deretter kjølt ned til romtemperatur i 30 min. Blokkering ble utført i 30 minutter ved romtemperatur med 10% svineserum i antistoff fortynningsbuffer (Dako). Etterpå endogent biotin ble blokkert ved hjelp Avidin /Biotin Kit (Dako). Primært antistoff (fortynnet i antistoff fortynningsbuffer med 2% svineserum, anti-XMRV 1:7500; XMRV anti-gag-K121 1:5000) ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur i et fuktig kammer. Kontroller ble enten belagt med det tilsvarende pre serum (samme fortynning) eller bare med antistoff-fortynningsbuffer med 2% svineserum. Den inkubasjon med det sekundære antistoff – biotin /streptavidin-merket – ble utført i 30 minutter ved romtemperatur. For en senere deteksjon av bundne antistoffer merket seksjoner ble belagt med alkalisk fosfatase-oppløsning (Dako, AK 5000) i henhold til produsentens anvisninger. IHC-farging oppløsning inneholdende levamisol å hemme endogen alkalisk fosfatase ble tilsatt til lysbildene i 15-20 minutter, mens kontra ble utført med Mayers Hansen løsninger. Den anti-XMRV serum ble vennlig levert av Ila Singh (University of Utah, USA).
Resultater
XMRV protein uttrykk i PCA vev ved IHC metoder
I 2009 funn av 23% av PCA seksjoner positive for XMRV protein uttrykk har blitt rapportert [4]. XMRV protein ekspresjon som i de fleste tilfeller lokalisert til tumoren epitel sterkt korrelert med høyere Gleason karakterer. Interessant, gjorde protein expression data ikke korrelerer med PCR resultater. En antatt forklaringen er noen knutepunkter infiserte XMRV celler i prostata som er nesten ikke påvises ved PCR ved hjelp av DNA fra hele mount vevssnitt som mal. Imidlertid ble disse funnene ikke bekreftet av en annen studie [24]. For å bidra til forklaringen av avvikene vi skjermet hele PCA seksjoner samt TMA bruker den nylig publiserte anti-XMRV serum [4] og en kanin polyklonale anti-XMRV gag serum (gag K121).
Begge sera har blitt testet i Western blot analyser med gag K121 serum som spesifikt gjenkjenner xenotropisk gag protein mens du viser ingen kryssreaksjon med noen cellulære proteiner. I motsetning til dette antiserum XMRV [4] har også anerkjent cellulære proteiner i ikke-infiserte humane og musecellelinjer (supplerende Figur S1). Vi genererte parafinsnitt med vare humane cellelinjer 293T, LnCap, begge cellelinjer infisert med XMRV og en musecellelinje SC1. Begge antisera gjenkjenner XMRV proteinuttrykkende celler i parafinsnitt som viser granulær farging av cytoplasma (figur 1). Ingen farging av ikke-infiserte celler og ingen farging av SC1 museceller ble oppdaget. Totalt 100 PCA (lav karakter og høy klasse PCA) og 50 BPH representert i en TMA samt 10 store deler av prostatakreft (med høy Gleason Score) ble analysert med gag K121 serum (tabell 2). I tillegg er en TMA inneholdende bryst, tykktarm og prostatacancer samt flere normale vev ble testet for XMRV protein ekspresjon. Hver IHC-farging ble kontrollert ved å ta med positive kontroller (parafin deler av cellelinjer) og negative kontroller (uten tilsetning av første antistoff), så vel som høyere fortynninger av det første antistoffet. Ingen farging av kreft seksjoner ble observert, så vel som de fleste av styre vev var negativ for gag K121 farging. vises bare en del av BPH svært få tilfeldige basal celler farging positiv med anti-gag K121 serum (figur 2). Ingen av TMA ble testet med anti-XMRV serum siden høy bakgrunn grunn av TMA generasjon prosedyren har blitt observert.
Parafin deler av cellelinje array som inneholder XMRV infiserte cellelinjer så vel som ikke-infiserte cellelinjer var farget for XMRV protein ekspresjon ved hjelp av antiserum XMRV (A) eller anti-gag K121 polyklonalt kaninserum (B). Større forstørrelse er vist for XMRV infiserte celler, så vel som for viltlevende mus cellelinje, SC1.
1/50 BPH ble observert tilfeldige positive fargede celler, som kan være basal celler basert på deres lokalisering i prostata.
Aktivert PBMC kan bli smittet med XMRV, men XMRV replikering er begrenset i PBMC.
etter hypotesen utgitt av Lombardi et al, kan det XMRV påvises i PBMC fra opp til 67% av CFS-pasienter, så vel som i opptil 4% av friske kontroller [2] vi ment å aktivere PBMC fra PCA pasienter og kontrollpasienter og skjerm for XMRV infeksjon anvende ulike metoder. Vi først etablert vårt XMRV deteksjonsmetoder på PBMC som har vært in vitro infisert med viral supernatant inneholder VP62 XMRV. Proviralt DNA ble brukt til å produsere infeksiøse XMRV supernatanter i LNCaP-celler som sterkt understøtter XMRV replikasjon på grunn av sterk aktivering av LTR så vel som mangelen på retrovirale restriksjonsfaktorer Apobec 3G uttrykk [36], [38] – [41]. PHA-aktiverte PBMC ble in vitro infisert med de angitte mengder av viral supernatant (figur 3) som var dyrket i nærvær av IL2 til en annen 7 d. Viruset inneholdende supernatant ble så underkastet ultrasentrifugering og virus pellets (figur 3A) samt cellelysat (figur 3B) fra de infiserte PBMC ble analysert ved Western blotting å sikre ekspresjonen av XMRV spesifikke proteiner. Basert på Western Blot eksperimenter med kronisk infiserte LNCaP celler fortynnet med den angitte cellen antall uinfiserte 293T celler (figur S2) kan vi anslå at ca 1-2% av PBMC er infisert med XMRV. Bare hvis vi infisere PBMC med høy viral titer vi har oppdaget effektivt XMRV i viral pellet etter ultrasentrifugering og Western Blot analyse (figur 3A). Genomisk DNA isolert fra disse in vitro XMRV infiserte PBMC var positivt for XMRV sekvenser ved PCR ved bruk av 650 ng genomisk DNA og to ulike primersett målretting gag og env (Figur 4A og figur S3). Sensitivitet av alle PCR-reaksjonene er antydet i fig supplerende S4 med alle PCR-påvisning av 1-10 infiserte celler i en bakgrunn av 10
6 uinfiserte celler.
PBMC fra to forskjellige donorer ble isolert, slått sammen, stimulert PHA og deretter infisert med de angitte mengder av XMRV supernatant (felt 1-5). Western Blot-analyse av cellelysat fra infiserte PBMC ble utført 7 dager tidligere infeksjon (B). Supernatanten av de infiserte PBMC ble anriket for viruspartikler ved ultrasentrifugering og farget for CA uttrykket (A). (C) 500 pl av XMRV supernatant stammer fra PBMC som vist i A og B ble anvendt for å infisere Derse-iGFP-celler som ble analysert for ekspresjon GFP 7 dager tidligere infeksjon ved FACS. Titere er angitt som GFP smittsomme enheter /ml. (D) Infeksjon av Derse-iGFP celler 100fold økes ved cocultivation av infiserte PBMC (vist i (A)) med LNCaP-celler til 7 dager, ble SN fra LNCaP-celler og deretter brukt til Derse-iGFP-celler, som ble analysert ved hjelp av FACS 5 d pi.
(B) Derse-iGFP celler ble infisert med 500 mL supernatant fra 22Rv1 celler, mock infiserte celler eller LNCaP celler cocultured med XMRV infiserte PBMC for 14 d. 72 h tidligere infeksjon Derse-iGFP celler ble overvåket for GFP positive celler ved mikroskopi.
Cocultivation av XMRV infiserte PBMC med LNCaP celler øker betydelig følsomhet for XMRV gjenkjenning.
Derse-iGFP cellene ble eksponert for filtrert kultursupernatant fra XMRV infiserte PBMC. 500 pl supernatant ble tilsatt til 5 x 10
4 Derse-iGFP celler som ble skåret for GFP uttrykk 7 dager p.i. ved mikroskopi og FACS analyse (Figur 3C). Generelt er viral supernatant fra PBMC smittende, imidlertid bare svært få GFP-positive celler ble detektert. Interessant, hvis vi cocultivate XMRV infiserte PBMC med LNCaP celler for 5 d, høste supernatanten og reinfect Derse-iGFP celler med filtrert supernatant, følsomhet for XMRV deteksjon ved hjelp Derse-iGFP celler ble 100fold økt Figur 3D og 4B.
PBMC av PCA pasienter er negativ for XMRV deteksjon av PCR-analyse
ved hjelp av denne tilnærmingen vi isolert PBMC fra 92 PCA pasienter og 7 friske frivillige ved Ficoll gradient; PBMC ble isolert PHA aktivert og dyrket i nærvær av IL-2 til 7 dager. PBMC ble underkastet forskjellige analyser som skisserer i Figur 5A: genomisk DNA etterfulgt av XMRV spesifikk nestet PCR anvende to publiserte XMRV PCR-strategi [1], [3], [19]; cocultivation aktiverte PBMC med LNCaP celler for 8 uker med påfølgende infeksjon av Derse-iGFP celler ved hjelp av supernatant 6 uker og 8 uker etter cocultivation. Lokalisering av de forskjellige primersettene som brukes er vist i fig S3 og følsomhet av de forskjellige XMRV PCR gjenspeiles i Fig S4. Integriteten av det genomiske DNA sammen med fraværet av mulige PCR-inhibitorer ble sikret ved GAPDH forsterkning (figur S4). Dyrking av PBMC, DNA-preparater og PCR-amplifikasjon ble utført i laboratorier Heinrich-Pette Institute hvor ingen andre XMRV studier ble utført. I tillegg til alle nestet PCR oppdage XMRV sekvenser ved hjelp av to forskjellige primerpar rettet mot gag, begge nylig publisert, ble samt en env PCR drives av to operatører som bruker 650 ng genomisk DNA som templat. Alle DNA-prøvene ble funnet å være gjennomgående negative (tabell 3). PCR reaksjoner ble rutinemessig kontrollert for mus forurensning bruke primere rettet mot retrotransposons, intracisternal En partikkel (IAP), som nylig publisert [15]. Ingen av PCR reaksjoner var positive for mus DNA-sekvenser (data ikke vist).
(A) Metoder som brukes til å screene for XMRV i PBMC fra PCA pasienter og friske kontroller. (B) Derse-iGFP celler 72 timer p.i. med SN fra LNCaP celler cocultured i 8 uker med pasient avledet PBMC (øvre paneler). De nederste panelene viser Derse-iGFP celler 72 timer p.i. med SN fra pasient avledet PBMC som ble aktivert med PHA for 7d.
67 PBMC prøver ble cocultured med LNCaP celler i opptil 8 uker og SN av LNCaP celler ble brukt til reporteren cellelinje Derse-iGFP. Denne cellelinjen bærer en MLV vektor, noe som fører til ekspresjon av GFP en reporter hvis revers transkriptase blir uttrykt. 72 h p.i. Derse-iGFP celler ble overvåket for GFP uttrykk ved mikroskopi. Av 67 prøver supernatant fra PBMC cocultured med LNCaP celler, to resulterte i 2-3 GFP positive celler i 5 × 10
4 celler (figur 5B). Vi har ikke observere en økning av GFP-positive celler over tid, noe som indikerer at det ikke var noen spredningen av virusinfeksjon. Interessant supernatanten av de aktiverte PBMC fra disse to pasienter uten cocultivation også resulterte i 1-2 GFP positive Derse-iGFP celler per brønn. I ett tilfelle to uavhengige PBMC isoleringer fra samme pasient ble utført (# 99 og # 100) som begge resulterte i 1-2 GFP positive Derse-iGFP celler. Men begge isolasjoner ble utført på samme dag ved den samme operatør. PCR fra LNCaP celler cocultured med PBMC av disse to pasientene ikke resulterte i påvisning av XMRV spesifikke sekvenser så vel som vi ikke var i stand til kultur og utvide GFP positive Derse-iGFP celler for senere analyser.
Diskusjoner
i denne studien har vi undersøkt påvisning av XMRV i pasienter med prostatakreft ved å studere ulike diagnostiske bio prøver for tilstedeværelsen av XMRV eller relaterte MLV sekvenser. Spesielt analyserte vi PCA vevsprøver samt deler vev fra andre kreftformer og normalt vev for XMRV protein uttrykk ved IHC. Videre ble PBMC fra 92 PCA og 7 friske kontroller screenet for tilstedeværelse av XMRV sekvenser og gjenvinning av infeksiøst virus. PBMC ble PHA aktivert, cocultured for inntil 8 uker og XMRV nærvær ble undersøkt av enten nestet PCR rettet mot to forskjellige XMRV regioner, Western Blot analyser ved hjelp av ulike anti-XMRV antistoffer eller infeksjon av Derse-iGFP celler som gjelder supernatant fra aktiverte PBMC eller supernatant fra LNCaP celler cocultured med PBMC i opptil åtte uker.
Vi kan ikke entydig viser at XMRV sekvenser kan påvises i aktiverte PBMC av PCA pasienter selv i to pasienter GFP positive Derse-iGFP celler ble oppdaget. I begge tilfeller påfølgende PCR-analyser av aktiverte PBMC samt cocultured LNCaP cellene var negativ for XMRV sekvenser så vel som vi ikke fant XMRV protein uttrykk i PCA deler av en av disse pasientene.
Vi har tidligere publisert at XMRV sekvenser er bare sjelden påvist i Tyskland ved bruk av cDNA generert fra PCA vev RNA amplifisert ved PCR [27]. Lignende resultater for en studie i USA har nylig blitt publisert av Switzer et al., [26]. Men det er flere studier som ikke identifiserer noen XMRV sekvenser i PCA vev samt det finnes studier med høyere forekomst av XMRV i PCA [3], [9], [21] – [24], [31], [42] . Vurderer muligheten for fokus XMRV infeksjon i prostata som kan bli savnet av PCR forsterkning på grunn av bare et mindretall av celler infisert vi etablert IHC flekker bruker publisert anti-XMRV serum og en XMRV spesifikke anti-gag serum. Vi klarte ikke å påvise XMRV protein uttrykk i PCA vev, brystkreft eller tykktarmskreft vev samt mest kontroll vev (inkludert 10 seksjoner hver: binyrene, tykktarm, endometrium, bitestikkel, hjerte, nyre, lunge, bukspyttkjertel, morkake, spyttkjertel , milt, mage, tverrstripet muskel, thymus, mandel, og testis) ikke viser noen positiv farging for gag K121 serum. Interessant, ved hjelp av anti-gag-serum K121 vi har oppdaget 1/50 BPH seksjoner som var positive for XMRV protein ekspresjon. Proteinekspresjon ble identifisert i noen få isolerte basalceller i prostata epitelet. Basal celler er fraværende i PCA, støtter det faktum at XMRV mest sannsynlig ikke er direkte involvert i PCA utvikling. Det lille antall hele mount vevssnitt undersøkt kunne redegjøre for avviket mellom våre funn og tidligere funn av Schlaberg et al. [4]. Vi bare farget hele ti mount vevssnitt med både antisera, anti-XMRV serum [4] ble ikke brukt på TMA seksjoner på grunn av høy bakgrunnsfarging. Aloia et al. og Sakuma et al. både diskutere en kryssreaktivitet av anti-XMRV serum med menneskeproteinantigener som resulterer i IHC positiv farging i PCA deler [16], [24]. Vi oppdager noen kryssreaktivitet med den publiserte anti-XMRV serum på Western blot analyse cellelysater fra infiserte og ikke-infiserte celler, men det var ingen bakgrunn observert på parafinsnitt av cellelinjer eller hele deler av PCA vev ved hjelp av serum ved de angitte fortynninger . Negativ IHC farging utelukker ikke muligheten for å få celler som bærer XMRV provirale sekvenser som vi kan gå glipp av PCR forsterkning. Vi fikk ikke bruke DNA FISH teknologi for å oppdage XMRV førvirus integrering i menneskelig vev. Evaluering av FISH positivt signal i 0,1% eller mindre av cellene, spesielt hvis bare en viral eksemplar per celle er å forvente, er svært utsatt for feil.
Nylig, Lombardi et al. rapportert påvisning og overføring av smittsomme XMRV fra PBMC eller plasma fra pasienter med CFS ved coculturing med LNCaP celler [2]. Interessant nok var 3-4% av PBMC isolert fra kontrollpasienter identifisert til å være positiv for XMRV smittende virus som resulterer i generell bekymring om sikkerheten av blodprodukter. Flere senere studier motivert av disse resultatene ikke var i stand til å bekrefte disse originale funnene. Årsaker til disharmoni er uklare og er for tiden undersøkt. Mens flertallet av studier fokusert på PCR-teknikker samt påvisning av XMRV spesifikke antistoffer bare én studie inkluderte cocultivation aktiverte PBMC fra CFS pasienter med LNCaP celler [10] og en nyere studie testet overføring av XMRV fra plasma (avledet fra CFS pasienter) til LNCaP celler [43]. Begge studiene ikke oppdage XMRV i noen av prøvene som ble testet. Med fokus på muligheten for at XMRV er en tilskuer virus reaktiveres i prostatakreftpasienter sammen med funn at XMRV kan påvises i PBMC av pasienter [2] vi søkte etter tegn til XMRV infeksjon i blodceller på PCA pasienter søker PCR-teknologi og cocultivation av aktiverte PBMC med indikatorceller.
