Abstract
Mål
Vår tidligere studie antydet de potensielle kliniske implikasjoner av BCAR1 i ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) (Mol Ther Diagn 2011. 15 (1):. 31-40). Heri, tar vi sikte på å evaluere prediktiv kraft BCAR1 som en markør for dårlig prognose hos NSCLC tilfeller bekrefte kreftfremkallende roller BCAR1 i A549 lunge adenokarsinom cellelinje, og vitner om BCAR1 /fosfor-p38 aksen.
Metoder
Mellom januar 2006 og juni 2010 var det totalt 182 pasienter med NSCLC (151 tilfeller med tilgjengelige følge opp data, og 31 tilfeller man ikke å følge opp på grunn av ugyldig kontaktinformasjon). Vi inspisert BCAR1, fosfor-BCAR1 (Tyr410), fosfor-p38 (Thr180 /Tyr182) og p38 uttrykk hos NSCLC vev og matchet tilstøtende normalt vev ved immunoblotting og IHC. Etter BCAR1 -RNA forstyrrelser i A549 celler, inspiserte vi protein uttrykk (BCAR1, fosfor-BCAR1, fosfor-p38 og p38) og utførte cellebiologi eksperimenter (cellevekst, migrasjon og syklus).
Resultater
BCAR1 ble overuttrykt i NSCLC vev (177/182) og cellelinjer (A549 og Calu-3). Det ble imidlertid ikke påvist i normale tilstøtende vev i 161 av de 182 tilfeller. Høyere BCAR1 nivåer ble sterkt assosiert med dårligere differensiert NSCLC og spådde dårligere prognose. BCAR1 knockdown forårsaket cellevekst arrest, cellemigrasjon hemming og cellesyklus arrest av A549 celler. Overekspresjon av BCAR1 var assosiert med aktivering av p38 i NSCLC tilfeller, og BCAR1 knockdown forårsaket reduksjon av fosfor-p38-nivåer i A549 celler.
Konklusjon
Overuttrykte BCAR1 er en prediktor for dårlig prognose i NSCLC og spiller viktige kreftfremkallende roller i kreftutvikling, sannsynligvis via aktivering av p38 MAPK. Imidlertid er videre undersøkelser nødvendig umiddelbart
Citation. Huang W, Deng B, Wang R-W, Tan Q-Y, Han Y, Jiang Y-G, et al. (2012) BCAR1 Protein spiller viktige roller i Karsinogenese og Spår dårlig prognose i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (4): e36124. doi: 10,1371 /journal.pone.0036124
Redaktør: Keiran Smalley, The Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 16 desember 2011; Godkjent: 26 mars 2012; Publisert: 27 april 2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (NSFC) (nr 81101782), NSFC prosjekt CQ CSTC (No. CSTC2011BB5020), og NSFC Third Military Medical University (No. 2010XQN36). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hvert år er det 1,35 millioner nye lungekrefttilfeller i verden [1]. På verdensbasis er Lungekreft den ledende årsak til kreft dødsfall [2]. På grunn av de intrikate biologiske funksjoner, prognosen for lungekreft er fortsatt svært dårlig [1]. Derfor er det viktig å avsløre de biologiske funksjoner av sykdommen for å få til bedre terapeutisk effekt [3].
Brystkreft anti-østrogen motstand 1 (BCAR1), også rett p130cas, var en av CAS protein (Crk-forbundet substrat) familiemedlemmer. Det ble opprinnelig identifisert som et cellulært protein migrerer på 130 kDa, og for å bli hyperfosforylert i v-Crk og v-Src-transformerte celler [4], [5]. Opprinnelig ble intensive studier rettet mot sammenhengen mellom brystkreft og BCAR1 [6], [1], [7], [8]. For eksempel, Brinkman et al. [7] har foreslått BCAR1 overekspresjon i ZR-75-1 brystcancer-cellelinjen gjengir antiøstrogen motstand til cellene. Videre Dorssers et al. [8] rapporterte at BCAR1 ekspresjon var ikke-reversibelt relatert til tilbakefall-overlevelse og total overlevelse tid for brystkreft.
Nylig har vår studie antyder at det er en klinisk innblanding av BCAR1 i ikke-små-celle lungekreft ( NSCLC) [9]. Vi undersøkte serumnivåer BCAR1 i 80 NSCLC-tilfeller og 80 friske kontroller, henholdsvis ved hjelp av et spesifikt enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) [9]. Intriguingly, har vi funnet at serum BCAR1 nivåene var signifikant høyere i NSCLC enn i kontrollgruppen, økes gradvis med progresjon av tumoren staging og redusert etter fjerning av maligne lesjoner [9]. Men de onkogene mekanismer for BCAR1 i NSCLC er fortsatt gåtene.
Heri, gjennomførte vi de videre undersøkelser for å evaluere prediktiv kraft BCAR1 som en biomarkør for dårlig prognose hos NSCLC pasienter. Og vi bekreftet kreftfremkallende roller BCAR1 via RNA interferens (RNAi) i A549 lunge adenokarsinom cellelinje. Eksperimenter in vivo og vitro viste den lukkede korrelasjonen mellom BCAR1 ekspresjon og aktivering av p38, som er et avgjørende gren av MAPK (mitogen-aktivert protein kinase) reaksjonsveien [10], [11].
Materialer og Metoder
Pasienter
studiet protokollen ble gjennomgått og godkjent av Forskningsetisk styret i Daping sykehus (Chongqing City, PRChina) [referansenummer. TMMU-DPH /2006-012], og informert samtykke ble skrevet og innhentet fra alle pasientene.
I studien utført mellom januar 2006 og juni 2010 var det totalt 182 pasienter med NSCLC. Lunge svulst ble diagnostisert radiografisk og bekreftet av patologi. Ingen av pasientene hadde fått behandling før innmelding i studien. De demografiske og clinicopathological kjennetegn ved pasientene er vist i tabell 1. Alle pasientene gjennomgikk lobektomi og lymphadenectomy. Ett hundre og tretti fem pasienter fikk postoperativ adjuvant kjemoterapi (paclitaxel pluss nedaplatin). Postoperativ oppfølging var tilgjengelig i 151 tilfeller per telefon eller brev intervju, og 31 tilfeller man ikke å følge opp på grunn av ugyldig kontaktinformasjon.
Cell Culture
A549 og Calu -3 lunge adenokarsinom-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection og dyrket i RPMI1640 /10% FBS, henholdsvis
RNA interferens av BCAR1
for det første ble de følgende oligoribonukleotid parene benyttes.: 5′- CCGGGGTCGACAGTGGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACCACTGTCGACCTTTTTTg-3 «og 5′-AATTCAAAAAAGGTCGACAGTGGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACCACTGTCGACC-3». Hele sekvenser ble avledet fra sekvensen av humant BCAR1 mRNA. Oligonukleotidene ble hentet fra Sunbio Medisinsk bioteknologi CO., Ltd (Shanghai City, P.R.China). De komplementære to tråder (hver på 20 uM) i 60 mL av sammensmeltningsbuffer (Sunbio Medical Biotechnology CO., Ltd, Shanghai City, P.R.China) ble oppvarmet i 5 minutter ved 95 ° C og deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble GFP-taggede lentiviral vektor pLVT351.LV for BCAR1-RNAi konstruert ved å sette annealing nukleotider inn i Age I + EcoRI stedet pMAGic 4,1 (Sunbio Medisinsk bioteknologi CO., Ltd, Shanghai City, PRChina).
for det andre, ble A549-cellelinjen sådd ut på 2,3 x 10
5 celler per brønn i 24-brønners cellekulturplate og infisert med lentivirus ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10. celler infisert med pLVT351- LV og CMV-GFP-LV (blank lentiviral vektor, pMAGic 4.1) ble kåret som A549-BCAR1-RNAi og A549-negativ kontroll, henholdsvis.
Western blotting-analyse av BCAR1, fosfor-BCAR1, fosfor-p38 og p38 hos NSCLC vev og celler
NSCLC og matchet tilstøtende normalt vev (minst 5 cm unna de primære svulster) var tilgjengelige fra i alt seksti (inkludert 35 adenokarsinomer og 25 plateepitelkarsinom) saker for western blotting . Under operasjonene ble prøvene samlet av teknikerne umiddelbart etter fjerning. Dessuten har vi også fremstilles av cellelinjene, inkludert Calu-3, A549, A549-negativ kontroll og A549-BCAR1-RNAi.
Deretter ble lysater fra vev og cellelinjer fremstilt på RIPA buffer omfattende 50 mM Tris -HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% deoksykolsyre og 0,02% natriumazid. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med et BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL).
Proteiner ble denaturert ved 95 ° C i 5 minutter, og 50 ug protein per felt ble løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid- gelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse av 10% polyakrylamidgel. Proteinene ble blottet på polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Thermo), som deretter ble blokkert med 5% skummet melk i 1 time ved romtemperatur. Proteinene ble immunblottet hjelp av anti-BCAR1 antistoff (BD Transduction Laboratories, USA, 1:1000), anti-fosfor-BCAR1 (Tyr410) antistoff (Abcam, USA, 1:1000), anti-p38 (BD Transduction Laboratories materiale, USA , 1:1000) og anti-fosfor-p38 (Thr180 /Tyr182) antistoff (cellesignale Transduction Laboratories, USA, 1:1000). En anti-β-aktin (Sigma) eller GAPDH (Sigma) antistoff tjente som kontroll.
Grå skalaer av immunoblotting av NSCLC og matchet tilstøtende normalt vev ble kvantitativt analysert ved hjelp av bildeopptak og analyseprogramvare (Bilde Lab programvare, BIO-RAD, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Tissue microarray konstruksjon og Immunhistokjemisk (IHC) analyse av BCAR1, fosfor-BCAR1, p38 og fosfor-p38 i NSCLC vev
den hematoxylin og eosin (H E) -stained lysbilder av alle 182 saker ble inspisert. For hvert tilfelle ble den patologiske diagnosen identifisert på H E-farget lysbilde og deretter sirklet. En tilsvarende lysbilde av normal tilstøtende vev ble også markert. Tissue microarray ble konstruert i henhold til de tidligere publiserte protokoller [9]. Den markerte lysbildet ble flukt med overflaten av den tilsvarende giverblokken. Deretter ble området merket på parafin vevsblokker. Fra hver prøve ble det vev kjerner med en diameter på 1,5 mm utstanset og deretter oppstilt på en mottaker parafinblokk. Seksjoner (4 mm) for disse mikroarray blokkene ble kuttet og deretter brukt til IHC analyse.
Snittene ble inkubert med serum blokkeringsløsning og primære antistoffer, inkludert anti-BCAR1 antistoff (BD Transduction Laboratories, USA, 1: 100), anti-fosfor-BCAR1 (Tyr410) antistoff (Abcam, USA, 1:100), anti-p38 antistoff (BD Transduction Laboratories, USA, 01:50) og anti-fosfor-p38 (Thr180 /Tyr182) antistoff ( cellesignale Transduction Laboratories, USA, 01:10), biotinylert sekundært antistoff, og streptavidin-pepperrot peroksidase. Diaminobenzidin løsning ble anvendt som et kromogen. Glassene ble deretter motfarget i hematoksylin en løsning. IHC resultater på protein overflod ble klassifisert i henhold til de prosentene av positive celler som følger: -, negativ farging; +, Svak posisjon (lt; 25%); ++, Moderat posisjon (lt; 50%); +++, Sterk posisjon (≥50%). » 25%» ble klassifisert som lav ekspresjon, ellers så høy ekspresjon tre observatører utført ved å score lysbildene og gjennomsnittsverdier ble oppnådd til slutt
TDT-mediert dUTP nick ende merkingsassay (TUNEL) av.. NSCLC vev
Vi har utført TUNEL analysen i vevssnitt av alle de 182 tilfellene apoptose. i svulsten ble inspisert med in Situ celledød Detection kit, POD (Roche, Tyskland). tissue seksjoner var deparaffinize i xylen, og hydrert ved hjelp av gradert etanol og forbehandlet med mikrobølge antigen gjenfinning (citrat-buffer, pH 7,5). Endogen peroksidase ble blokkert med 0,3% H
2o
2 i metanol i 15 min. Deretter ble vevssnitt ble behandlet med 3% bovint serumalbumin i 30 min, og inkubert med TUNEL reaksjonsblandingen. (TDT: dUTP, 01:20) i 45 minutter ved 37 ° C Vevssnitt ble kombinert med Converter-POD, fulgt av vasking og DAB (Zhong Shong, Kina) farvereaksjon . Under TUNEL prosedyren snitt ble vasket i fosfatbuffer saltvann (PBS). Vevssnitt ble kontra av hematoxylin, dehydrert gjennom gradert etanol, ryddet i xylen, og montert. For negative kontroller, ble avionisert vann benyttet i stedet for TDT. Positive kontroller besto av betent menneskelig mandel. Celler ble betraktet som positive når intens brun reaktivitet ble påvist i kjernen. Apoptotiske indeksen ble beregnet andelen av atom positiv flekk i 1000 celler i fem forskjellige områder av hver del til en 400 × forstørrelse.
Real-time RT-PCR
For å evaluere effekten av RNAi av BCAR1 utførte vi kvantitativ real-time RT-PCR i A549-BCAR1-RNAi og A549-negative kontrollceller. Hver av cellene ble sådd ut ved en konsentrasjon på 1 x 10
5cells /brønn i 6-brønns plater. Etter to dager såing, ble total RNA ekstrahert fra cellene ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen). Første cDNA ble syntetisert med M-MLV transkriptase (Promega) og oligo dT. Real-time PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn PCR Master Mix (TAKARA) og ABI Prism 7000 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster City, California). PCR-primere ble anvendt som følgende: 5′-CAATGCCTCACTGCTCTT-3 «og 5′-GTAGTCATAGTCCTCCATC-3». Spesifisiteten til detekterte signaler ble bekreftet ved en dissosiasjon kurve bestående av en enkelt topp. Alle prøver ble kjørt i duplikat i hvert forsøk. Verdier ble normalisert ved human β-aktin.
Cell Vekst analysen
For vurdering av cellevekst, ble A549-negativ kontroll og A549-BCAR1-RNAi celler belagt på 2,0 × 10
2-celler per brønn av seks-brønners plater, henholdsvis. Og hver av cellene ble inspisert og fotografert følgende Giemsa-farging, elleve dager etter plettering.
cellemigrering Assay
For vurdering av celle motilitet, ble kammermigrasjons analyser utført ved anvendelse av en cellekultur innsats ( 8-mikrometer porestørrelse, 24-brønners format, Cell Invasion Assay Kit Cat Chemicon, nr ECM550).. A549-negativ kontroll og A549-BCAR1-RNAi-celler ble sådd ut i duplikat med en tetthet på 3,0 x 10
5 celler /kammer. Etter 48 timer ble celler som ikke hadde flyttet til de nedre brønnene fjernet fra den øvre flate av filtrene ved hjelp av bomullspinner, og celler som hadde flyttet til den nedre overflate av filteret ble farget ved anvendelse av en celle invasjon Assay Kit Kat. (Chemicon, nr ECM550). Cellemigrasjon ble kvantifisert ved visuell telling etter å ha blitt fotografert. Forsøk ble utført i duplikat. Gjennomsnittsverdiene for tre tilfeldige områder ble oppnådd for hver brønn.
Cell Cycle Assays
For strømningscytometrisk bestemmelse av cellesykluser, 2,0 x 10
6 av A549-negative kontrollceller og A549 -BCAR1-RNAi cellene fiksert i 70% etanol og farget med propidiumjodid, henholdsvis. De fargede celler ble analysert på et FACScan flowcytometer for relative cellesykluser. Forsøk ble utført i duplikat.
Cell apoptose Analyser
Vi har evaluert celle apoptose ved hjelp av FACScan strømningscytometer. 2,0 × 10
6 av A549-negative kontrollceller (48 timer etter transient transfeksjon), A549-negative kontrollceller (stabil transfeksjon), A549-BCAR1-RNAi celler (48 timer etter transient transfeksjon) og A549-BCAR1-RNAi celler (stabil transfeksjon) ble fiksert i 70% etanol og farget med propidiumjodid, respektivt. De fargede celler ble analysert på et FACScan flowcytometer for relativ celle apoptose. Forsøk ble utført i duplikat.
Data Analysis
Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av t-test, Mann-Whitney U test, Kruskal-Wallis test,
X
2 test og Spearmans rho, henholdsvis. Død uansett årsak ble inkludert i beregningen av postoperative overlevelse. Sykdommen spesifikk overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-fremgangsmåten og analysert ved hjelp av log-rank test. Prognostiske faktorer ble undersøkt ved univariate og multivariate analyser ved hjelp av en Cox modell. Alle de ovennevnte beregninger ble utført ved bruk av SPSS versjon 11,0 programvare for Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). En verdi på p 0,05 (tosidig) ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
BCAR1 er overuttrykt i NSCLC vev og cellelinjer
BCAR1 uttrykk er registrert (enten. i kjernen, cytoplasma, eller begge deler) i 57 av de 60 NSCLC tilfeller ved hjelp av Immunoblotting (figur 1a), og 177 av de 182 tilfeller med NSCLC ved hjelp av IHC-analyse (figur 1c), respektivt. Det ble imidlertid ikke påvist i normale tilstøtende vev i 53 av de 60 tilfeller ved hjelp av Immunoblotting (figur 1a), og 161 av de 182 tilfeller ved hjelp av IHC-analyse (figur ikke vist), henholdsvis. Analyse av gråtoner av immunoblotting også foreslått BCAR1 nivåene var signifikant høyere hos NSCLC enn i den normale nærliggende vev (48,2 ± 24,7 vs 11,0 ± 9,8, t-test,
P
0,001, Figur 1b).
A: Immunoblotting indikert enten BCAR1 eller fosfor-p38 (Thr180 /Tyr182) nivåer i tre NSCLC vev (C) var betydelig høyere enn i de tilstøtende normalt vev (N). Men fosfo-BCAR1 (Tyr410) og p38 nivåene i NSCLC og de tilstøtende normale vev var lik. BCAR1, fosfor-BCAR1, p38 og fosfor-p38 uttrykk ble også påvist i A549 og Calu-3 NSCLC cellelinje ved hjelp Immunoblotting analysen. BCAR1 knockdown fører til nevneverdig reduksjon av fosfor-BCAR1 og fosfor-p38 nivåer i A549 celler. B: gråtoner analyse av immunoblotting også foreslått BCAR1 og fosfor-p38 (Thr180 /Tyr182) nivåene var signifikant høyere hos NSCLC enn i den normale nærliggende vev (48,18 ± 24,7 vs 10,97 ± 9,8,
P
0,001 ; 16,03 ± 5,8 vs 28,82 ± 8,0,
P
0,001). Men fosfor-BCAR1 (Tyr410) og p38 ikke hatt trend (20,72 ± 6,4 vs 24,37 ± 7,5,
P
= 0,22; 25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,
P
= 0,476 ). C: IHC foreslo uttrykk for BCAR1 (enten i kjernen, cytoplasma), fosfo BCAR1 (tilbøyelige til å finne i cytoplasma), fosfor-p38 (tilbøyelige til å finne i kjernen), p38 (tilbøyelige til å finne i cytoplasma ) og apoptotiske legemer. Merk: N (tilstøtende normalt vev); C (NSCLC vev); ** (
P
0,001); # (
P
0,05).
Men fosfor-BCAR1 (Tyr410) ble oppdaget i cytoplasma i 29 av de 60 NSCLC ved hjelp Immunoblotting (Figur 1a), og 32 tilfeller av de 182 NSCLC tilfeller ved hjelp av IHC-analysen (figur 1c), respektivt. Det ble imidlertid også oppdaget at i den normale tilstøtende vev hos 30 av de 60 tilfeller ved hjelp av Immunoblotting (figur 1a), og 34 av de 182 tilfellene ved hjelp av IHC-analysen (figur ikke vist), henholdsvis. Analyse av gråtoner av immunoblotting antydet at det ikke var noen nevneverdig forskjell fra BCAR1 nivåer i mellom NSCLC og det normale tilstøtende vev (25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2
P
= 0,476, Student t-test, figur 1b) .
BCAR1 og fosfor-BCAR1 (Tyr410) ble påvist i A549 og Calu-3 NSCLC celler ved hjelp av immunoblotting analysen (Figur 1a).
Høyere BCAR1 nivåer er sterkt korrelert med dårligere differensiert svulster og spår dårligere prognose
Ved å bruke IHC-analysen i de 182 NSCLC tilfeller, fant vi at høyere BCAR1 nivåene ble sterkt korrelert med dårligere differensiering. (Kruskal-Wallis test,
P
= 0,01; Tabell 1). Men det var ingen merkbar sammenheng mellom BCAR1 og andre klinisk-patologiske egenskaper som alder, kjønn, histologi, TNM stadium, tumorstørrelse og lymphonode metastase (tabell 1). Til tross for BCAR1 ekspresjon ble påvist enten i cytoplasma, kjernen, eller begge deler i NSCLC, var det ingen vesentlig sammenheng mellom protein plassering og klinisk-patologiske parametre (Data ikke vist). Dessuten var det ingen signifikant korrelasjon mellom fosfor-BCAR1 og de kliniske-patologiske egenskaper (data ikke vist).
Overlevelsesraten av BCAR1 høy-uttrykk gruppe var betydelig lavere enn for lav-uttrykk gruppe (
P
= 0,001, figur 2a). Multivariat analyse viste at BCAR1 nivåer (hasardratio 1,777,
P
= 0,028), lymphonode metastase (hasardratio 1,277,
P
= 0,040) og TNM stadium (hasardratio 1,298,
P
= 0,007) var betydelige og uavhengige prognostiske indikatorer for NSCLC tilfeller (tabell 2)
A:. overlevelses~~POS=TRUNC av BCAR1 høy uttrykt gruppe var betydelig lavere enn for lavt uttrykt gruppe (
P
= 0,001). B: Phospho-p38 positive celler var signifikant og positivt korrelert med prosenter av BCAR1 positive celler, i de 182 NSCLC vev (Spearmans rho, korrelasjonskoeffisient = 0,811, p 0,001). Og prosenter av fosfor-p38 positive celler i BCAR1 høyt uttrykt vev var betydelig høyere enn i lavt uttrykt vev (Mann-Whitney U test z = -3,689
P
0,001). C: Den sekvensielle snitt ble farget for BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 og p38, som viste at cellene over-uttrykker BCAR1 har også et høyere nivå av fosfo-p38 (x 200). Enten fosfor-BCAR1 eller p38 var svakt positiv.
BCAR1 knockdown fører til cellevekst arrest, cellemigrasjon hemming og cellesyklus arrest av A549 celler
Vi etablerte menneske NSCLC kreft A549 celler som stabilt uttrykt pLVT351-LV (A549-BCAR1-RNAi celler) og CMV-GFP-L.V. (A549-negative kontrollceller) ved bruk av et lentivirus system. I det minste en 80% reduksjon i mRNA-nivåer av BCAR1 i A549-BCAR1-RNAi-celler ble bekreftet ved sanntids RT-PCR (figur 3a) og Western blotting-analyse (figur 1a), respektivt. Samtidig kan vi se hemming av fosfor-BCAR1 sammen med BCAR1 knockdown (Figur 1a)
A:. Minst en 80% reduksjon i mRNA av BCAR1 i A549-BCAR1-RNAi celler ble bekreftet av real- time RT-PCR. B: Colony forming enheter av A549-BCAR1-RNAi var påviselig mindre enn for A549-negative kontrollceller, elleve dager etter plating. C: Cell migrasjon analysen antydet BCAR1 knockout hindret cellemigrasjon av A549-BCAR1-RNAi celler. D: Flow cytometri indikert BCAR1 knockout også forårsaket cellesyklus arrest av A549-BCAR1-RNAi celler. E:. Flowcytometri indikert BCAR1 knockout økte ikke apoptose rente etter enten forbigående (39,1% vs 42,1%) eller stabil transfeksjon (0,33% vs 0,4%) i A549 celler
Figur 3b foreslåtte kolonidannende enheter av A549-BCAR1-RNAi celler ble påviselig mindre enn for A549-negative kontrollceller, elleve dager etter plating (figur 3b). Celle migrasjon analysen antydet BCAR1 knockdown hindret cellemigrasjon av A549-BCAR1-RNAi celler (figur 3c). Og flowcytometri indikert BCAR1 knockdown også forårsaket cellesyklus arrest av A549-BCAR1-RNAi celler (Figur 3d).
BCAR1 er negativt korrelert til apoptotiske indeksen i NSCLC vev. Imidlertid kan BCAR1 knockdown ikke øke apoptose i A549 celler
apoptotiske legemer ble oppdaget i alle de 182 NSCLC vev (Figur 1c). Blant vev, var det en betydelig og invers korrelasjon mellom BCAR1 og apoptotisk indeks (Spearmans rho, korrelasjonskoeffisient = -0,183;
P
= 0,013). Apoptotiske indeksen i BCAR1 høyt uttrykt vev var betydelig lavere enn i BCAR1 lavt uttrykt vev (t-test t = 2,312
P
= 0,022).
Men i sammenligning med negativ kontroll celler, gjorde BCAR1 knockout ikke øke apoptose rente etter enten forbigående (39,1% vs 42,1%) eller stabil transfeksjon (0,33% vs 0,4%) i A549 celler (figur 3e).
Overuttrykte BCAR1 er korrelert med aktivering av p38 i NSCLC tilfeller og BCAR1 knockdown fører til reduksjon av fosfor-p38 i A549 celler
phospho-p38 uttrykk ble påvist i 31 av de 60 NSCLC tilfeller ved hjelp av immunoblotting (Figur 1a), og 91 av de 182 NSCLC tilfeller (utsatt å finne i kjernen) ved hjelp av IHC analysen (Figur 1c). I likhet med utviklingen av BCAR1 nivåer, grå skalaer analyse avslørte fosfor-p38 nivåene var signifikant høyere hos NSCLC enn i de vanlige tilstøtende vev (16,03 ± 5,8 vs 28,82 ± 8,0,
P
0,001; figur 1b) . Men p38 hadde ikke trenden (20,72 ± 6,4 vs 24,37 ± 7,5,
P
= 0,22) (Figur 1b). Dessuten IHC foreslo positiv rate på enten BCAR1 eller fosfor-p38 var betydelig høyere i NSCLC enn i normalt vev (
P
0,001 og P 0,001, henholdsvis) (tabell 1). Men p38 hadde ikke en slik trend (
P
= 0,62).
Vi fant prosenter av fosfor-p38 positive celler var signifikant og positivt korrelert med de av BCAR1 positive celler, i alt 182 NSCLC vev (Spearmans rho, korrelasjonskoeffisient = 0.811, p 0,001; figur 2b). Og prosenter av fosfor-p38 positive celler i BCAR1 høyt uttrykt vev var betydelig høyere enn i BCAR1 lavt uttrykt vev (Mann-Whitney U test z = -3,689
P
0,001; figur 2b). Men det var ikke noen sammenheng mellom fosfor-BCAR1 og fosfor-p38 nivåer (P = 0,892).
I et forsøk på å skildre den sterke korrelasjonen mellom BCAR1 positive og fosfor-p38 positive celler, presenterte vi den sekvensielle seksjoner beiset i en sak for BCAR1, fosfor-BCAR1, fosfor-p38 og p38, som viste at cellene over uttrykker BCAR1 har også et høyere nivå av fosfor-p38 (figur 2c).
BCAR1 nivåer i Calu-3-celler var påvisbart høyere sammenlignet med A549-celler (Figur 1a). Forbløffende nok Figur 1a foreslo fosfor-p38 nivåer også hadde samme trend. Videre BCAR1 knockdown fører også merkbar reduksjon av fosfor-p38 overflod i A549-celler (Figur 1a).
Diskusjoner
BCAR1 som en adapter protein lokaliserer til kromosom 16q22-Q23
7 , og hovedsakelig består av fire funksjonelle deler, inkludert en amino-terminal Src-homologi 3 (SH3) domene, et Src-bindende domene (SBD), et stort substrat domene (SD) og en helix-loop-helix domene (HLH) [12 ], [1. 3]. BCAR1 lokaliserer ubiquitously in vitro og in vivo [14], [15], [16], og er involvert i en rekke cellulære prosesser, inkludert migrasjon, kjemotaksis, apoptose, cellesyklus, differensiering og så videre [17], [18].
Så langt, svært få studier som fokuserer på kreftutvikling av BCAR1 i lungekreft. Wei et al. [19] har foreslått at forankrings-uavhengig fosforylering av BCAR1 beskyttet lunge adenokarsinom celler fra anoikis. Nylig har vår studie antydet at serum BCAR1 nivåene var signifikant høyere i NSCLC enn i kontrollgruppen, økes gradvis med progresjon av tumoren staging og redusert etter fjerning av maligne lesjoner [9]. Som et resultat, det antas at en roman onkogen rolle BCAR1 i NSCLC. Heri, rettet vi å verifisere de kliniske implikasjonene av BCAR1 overekspresjon og NSCLC, og å belyse de kreftfremkallende mekanismene for BCAR1 i NSCLC. Som ventet, har vi funnet BCAR1 protein er spesielt rik på NSCLC-celler og vev. Og våre studier in vivo og vitro viste det nær sammenheng mellom BCAR1 uttrykk og aktivering av p38 MAPK. Selv om det tidligere studier har vist at tyrosinfosforylering av BCAR1 kan være kritisk for nedstrøms signalisering [20], vår undersøkelse indikerte at fosfo-BCAR1 (Tyr410) ble detektert i bare 34 av de 182 tilfellene, og ikke korreleres med klinisk-patologiske egenskaper. Så langt, er mange områder av menneskelig BCAR1 fosforylering funnet som: tyrosin rester aa 12, 128, 165, 192, 222, 224, 234, 249, 267, 287, 306, 327, 362, 372, 387, 410, 653, 664, 666; serinrester aa 134, 139, 292, 437, 639; og treonin rester aa 269, 326, 385. Vi antar at noen bestemte områder av fosforylering er avgjørende for signalkaskader BCAR1 i NSCLC. Intriguingly, tilstøtende normale vev viser mye høyere nivåer av fosfo-BCAR1 enn av BCAR1 proteiner (Figur 1a). Vi har også bekreftet ved inhibering av fosfo-BCAR1 sammen med BCAR1 knockdown i et forsøk på å verifisere effekten av dette antistoff. Vi antar at en spesielt enzym i lunge vev spesielt dekomponerer ikke-fosfor-BCAR1 imidlertid fosfor-BCAR1 kan overleve. Og alle de ovennevnte hypoteser fortjener ytterligere flere undersøkelser.
Våre eksperimenter in vitro viste at BCAR1 knockdown i A549 celler forårsaket cellevekst arrest, cellesyklus arrest og cellemigrasjon hemming. Selv BCAR1 knockdown i A549 cellene ikke forårsake celle apoptose, var det en merkbar og invers korrelasjon mellom BCAR1 og apoptotisk indeks i NSCLC vev. Vi vet ikke årsaken til avviket mellom NSCLC celler og vev. I tillegg vår studie in vivo viste at BCAR1 nivåene var signifikant og negativt korrelert med tumor differensiering, enten ved å telle positive prosentene av celler (Kruskal-Wallis test,
P
= 0,010) eller vurdere beiset intensitet (achromasy = 0 , stramineous = 1, buffy = 2, brun = 3; Kruskal-Wallis test,
P
= 0,014). Kaplan-Meier kurve også indikert at høyere nivåer av BCAR1 spådd dårligere prognose i 151 tilfeller med gyldig følge opp data. Alle de nevnte forsøkene foreslått BCAR1 hadde en avgjørende rolle i kreftutvikling. Dessuten er BCAR1 kjent som Src substrat, og Src-inhibitoren AZD0530 kan også resultere i signifikant inhibering av cellemigrering og matrigel invasjon i lungekreftceller [21], noe som potensielt støtter carcinogenesis av Src /BCAR1 akse.
Ved hjelp av immunoblotting, Greenberg et al. [22] fant at bare aktivert p38 MAPK ble konsekvent økt i NSCLC sammenlignet med normalt vev, noe som tyder på en ekstra rolle for denne veien i ondartet cellevekst eller transformasjon. Faktisk tallrike studier har avslørt de kreftfremkallende aktivitetene til p38, inkludert stimulering av proliferasjon og migrasjon [1], [23], [24]. Matsuda K et al. [23] fant at EGF fremmer spredning via p38 MAPK signalering kaskader i ASPC-en, PANC-en og T3M4 bukspyttkjertelkreft cellelinjer, og p38 MAPK inhibitor SB203580 kan hemme EGF-stimulert mitogenesis. Dessuten har den p38 MAPK-reaksjonsveien blitt implisert å spille en viktig rolle i endotelial cellemigrering fordi inhiberende aktivitet p38MAPK nedregulerer VEGF-stimulert migrasjon [24]. Nylig, Wendt et al. Studie [25] har vist at å øke ekspresjonen av enten full-lengde eller bare i karboksylsyreenden av BCAR1 i mammary epitelceller økt p38-aktivering. Forbløffende nok i 182 NSCLC vev, fant vi at det var en nær sammenheng mellom uttrykk for BCAR1 og fosfor-p38. Ved å evaluere farget intensiteten av fosfor-p38 og BCAR1 (achromasy = 0, stramineous = 1, Buffy = 2, brun = 3, » 2 score» ble klassifisert som lav uttrykk, ellers så høyt uttrykk), vi fant overflod av fosfor-p38 var også signifikant og positivt korrelert med den av BCAR1 (Spearmans rho, p 0,001). Dessuten BCAR1 knockdown også forårsaket nevneverdig reduksjon av fosfor-p38-nivåer i A549 celler Men de underliggende mekanismene fortjener videre undersøkelser tillegg..
