Abstract
Vi rapporterer mekanismebasert bevis for kreft og chemopreventive effekt av [6] -gingerol, den viktigste aktive prinsipp i medisinsk plante, Ginger (
Zingiber officinale
), i tykktarm kreft celler. Forbindelsen ble evaluert i to humane koloncancer cellelinjer for sin cytotoksiske effekt og den mest sensitive cellelinjen, SW-480, ble valgt for den mekanistiske evaluering av dens anticancer og Kjemopreventivt effekt. Den ikke-toksiske naturen til [6] -gingerol ble bekreftet ved analyser levedyktighet på raskt delende normale mus kolon celler. [6] -gingerol hemmet celledeling og apoptose som gjenspeiles av eksternalisering av fosfatidylserin i SW-480, mens de normale tykktarmceller var upåvirket. Følsomhet for [6] -gingerol i SW-480 celler var assosiert med aktivering av caspases 8, 9, 3 7 og spalting av PARP, som attesterer induksjon av apoptotisk celledød. Mekanistisk, [6] -gingerol nedregulert forbolmyristatacetat (PMA) indusert fosforylering av ERK1 /2 og JNK MAP-kinaser og aktivering av AP-1-transkripsjonsfaktor, men hadde bare liten effekt på fosforylering av p38 MAP-kinase og aktivering av NF -kappa B. i tillegg er det suppleres av inhibitorer av enten ERK1 /2 eller JNK MAP kinase i å få ned PMA-induserte celleproliferasjon i SW-480-celler. Vi rapporterer hemming av ERK1 /2 /JNK /AP-en sti som en mulig mekanisme bak kreft samt chemopreventive effekt av [6] -gingerol mot tykktarmskreft
Citation. Radhakrishnan E, Bava SV , Narayanan SS, Nath LR, Thulasidasan AKT, Soniya EV, et al. (2014) [6] -Gingerol Induserer caspase-Dependent apoptose og Hindrer PMA-indusert spredning i tykktarm kreft celler ved å hemme MAPK /AP-1 Signa. PLoS ONE 9 (8): e104401. doi: 10,1371 /journal.pone.0104401
Redaktør: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, India
mottatt: 17 mars 2014; Godkjent: 13 juli 2014; Publisert: 26 august 2014
Copyright: © 2014 Radhakrishnan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Ruby John Anto er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Tykktarmskreft er den tredje mest diagnostisert type kreft, og den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødelighet i Forente stater. Globalt er det fjerde vanligste årsaken til dødelighet på grunn av kreft. Variasjonene i kosten mønster og økt forbruk av rødt og bearbeidet kjøtt bidrar til denne økningen i forekomsten av tykktarmskreft [1], [2] .Surgical prosedyrer og kjemoterapi utgjør de viktigste terapeutiske regimer for tykktarmskreft [3]. Økningen i medikamentresistens vanskeliggjør behandlingen av kreft i tykktarmen, og de problemer som er forbundet med metastase øker dens alvorlighetsgrad. Søk er på for nye terapeutiske midler som er rettet mot molekylære signalveier i tykktarmskreft for å arrestere sin vekst og metastasering.
Ginger (
Zingiber officinale
) har lenge vært brukt i tradisjonell medisin og er kalt «
Maha-aushadhi
» i Ayurveda, som betyr «
den store medisin
» [4]. Rhizome fra ingefær inneholder mange stikk fenoliske forbindelser som [6] -gingerol, [6] -shagol, [6] -paradol og Zingerone [5] .Disse forbindelser har blitt studert for sin anti-bakteriell, anti-oksidanter, anti- inflammatoriske og anti-tumor egenskaper [6], [7]. Mange studier har vist at anti-kreft egenskaper av disse fenolene mot cancer av forskjellig opprinnelse. Rhizome av ingefær er en ingrediens i daglige kosthold i mange land, og er en aktiv ingrediens i mange tradisjonelle systemer av urtemedisin, som orientalsk medisin og ayurveda, for å håndtere mange plager, inkludert dårlig fordøyelse og andre gastrointestinale forstyrrelser. Denne tradisjonelle kunnskap utløser en særlig interesse i å karakterisere chemo-forebyggende og anti-kreft naturen av disse phenolics mot mage kreft som tykktarmskreft eller bukspyttkjertel kreft.
Blant disse fenoliske forbindelser, [6] -gingerol (1- [4′-hydroksy-3′-metoksyfenyl] -5-hydroksy-3-decanone) er blitt undersøkt for sin cytotoksiske virkninger i forskjellige kreftcellelinjer, inkludert kolorektal cancer. [6] -gingerol ble vist å indusere celledød i livmorhalskreft cellelinje, HeLa, av caspase-3 avhengig apoptose og autofagi [8]. Det kunne hemme metastase av MDA-MB-231 bryst kreft celler og indusere apoptose i prostatakreftceller LnCap [9], [10]. Administrasjon av [6] -gingerol hemmet veksten av flere typer murine svulster som melanomer, nyrecellekarsinomer og tykktarmskreft ved å styrke de infiltrasjoner av tumor-infiltrerende lymfocytter CD4 og CD8 T-celler og B220
+ B-celler [11]. [6] -gingerol ble også vist å hemme progresjonen av forbolester-indusert hud tumor i ICR-mus [12]. Kun et begrenset antall studier har blitt publisert på anti-kreft egenskaper [6] -gingerol og virkningsmekanismen mot tykktarmskreft [13], [14], [15].
I denne studien var cytotoksiske effektene av [6] -gingerol på SW-480 tykktarmskreftceller ble sammenlignet med dens virkninger på raskt dele normal intestinal epitelceller fra mus. Studien har også foretatt en
in vitro
mekanistisk evaluering på de hemmende effekter av [6] -gingerol på forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) induserte anti-apoptotiske signaler i SW-480 celler.
Materialer og metoder
2,1. Materialer
Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) ble oppnådd fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA); Føtalt bovint serum (FBS) fra PAN Biotech (GmbH, Aidenbach, Tyskland); Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS), epidermal vekstfaktor (EGF) og insulin, transferrin, selen, natriumpyruvat oppløsning (ITS-A) fra Invitrogen; Antistoffer mot fosfo-p38, fosfo-ERK1 /2, fosfo-JNK, beta-aktin og caspaser ble anskaffet fra Cell Signaling (Beverly, MA, USA) og antistoff mot poly- ADP-ribose polymerase (PARP) var fra Santa Cruz Biotechnology (i Santa Cruz, California). [6] -gingerol ble kjøpt fra Biomol (Hamburg, Tyskland). De MAP kinase hemmere U0126, SP600125, SB203580 og NF-kappaB hemmer SN50 ble anskaffet fra Calbiochem (San Diego, California). Alle andre kjemikalier, inkludert Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) ble kjøpt fra Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA).
2,2. Cellekultur
Mennesketykktarmskreft cellelinjer, SW-480 og HCT116 ble innhentet fra Nasjonalt senter for Cell Sciences (NCCer), Pune, India. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) sammen med 100 U /ml penicillin, 50 mikrog /ml streptomycin og 1 mikrogram /ml amfotericin B. Cellelinjene ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og ble sub-dyrket to ganger i uken.
Normale intestinale epitelceller ELSE (IECS) ble isolert fra mus tykktarm pr etablert protokoll [16], [17], med passende modifikasjoner, som er godkjent av Institutional Animal Etisk Komité, Rajiv Gandhi senter for bioteknologi som per reglene for
Utvalget for formålet med kontroll og tilsyn med dyreforsøk
, Miljøverndepartementet og Forest, Government of India ( sanksjon No: IAEC /151 /RUBY /2012). I korthet, mus (
Swiss albino
, 7 uker gamle, IAEC sanksjonere No: IAEC /151 /RUBY /2012) colon ble dissekert ut og rengjøres aseptisk med en × Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) for å fjerne avføring . Tarmen ble åpnet i lengderetningen og skåret i 1 cm store stykker, og ble inkubert i nærvær av type 1 collagenase (200 U /ml) i 30 min med kraftig risting. De løsrevne epitelceller ble isolert ved sentrifugering av supernatanten. Disse cellene ble dyrket i høy glukose DMEM med 10% FBS og 2 x antibiotika, inneholdende 10 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF) og 5 ug /ml insulin-Transferrin-selen-natriumpyruvat (ITS-A) (Invitrogen, USA ). Denne cellelinjen ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og ble sub-dyrket en gang i måneden.
2,3. Medikamentell behandling
[6] -gingerol lager (20 mg /ml) ble fremstilt i etanol og arbeids konsentrasjoner ble fremstilt ved å fortynne denne aksjen i dimetyl sufoxide (DMSO). For MTT-analysen, 5 x 10
3 celler /brønn av humane tarmkreftceller og 10
4 celler /brønn fra mus IECs ble sådd ut i 96-brønners plater. Celler ble behandlet med [6] -gingerol i 48 timer, 72 timer eller 96 timer før den utfører MTT-analyse og i 16 timer før Annexin V-farging. PMA (5 mg /ml) ble fremstilt i DMSO og lagret ved -20 ° C. I alle kombinasjonsbehandlinger [6] -gingerol ble lagt 2 timer før behandling med PMA. I celleviabilitet assay /Western blot for kombinasjonsbehandling med MAP-kinase-inhibitorer (2,5 mikromolar U0126, 5 mikromolar SP600125, 1’micromolar SB203580) eller NF-kappaB inhibitor (18 mikromolar SN50), Cellene ble først behandlet med inhibitoren i 1 time og deretter forbehandlet med [6] -gingerol i 2 timer, etterfulgt av eksponering for PMA i 48 timer før den utfører MTT-assay. For elektroforetiske mobilitet Shift analyse (EMSA), 10
6 celler av SW-480 ble sådd ut på 60 mm plater og cellene ble forbehandlet med [6] -gingerol i 2 timer og deretter med PMA i 30 minutter.
2,4. Celleviabilitet assay
Cytotoksiske effekter av [6] -gingerol ble bestemt ved MTT-assay som tidligere beskrevet [18], og den relative cellenes levedyktighet prosentandel er uttrykt som [A
570 av behandlede brønner /A
570 ubehandlede brønner × 100].
2,5. Annexin V-Propidium Jod flekker
Membranen flip-flop indusert av 16 h behandling med [6] -gingerol ble analysert ved å farge cellene med fluoresceinisotiocyanat-konjugert Annexin V /PI (Santa Cruz Biotechnology) i henhold til produsentens instruksjoner og apoptotiske celler ble fotografert under fluorescerende mikroskop [19]. Det totale antall celler i det mikroskopiske feltet ble tellet under et fasekontrastmikroskop, og antallet fluorescerende celler i det samme felt ble tellet under et fluorescerende mikroskop. Fraksjonen av fluorescerende celler til totale antall celler er representert som prosentandel av apoptotiske celler. Dette ble gjentatt i flere felt av samme brønn og gjennomsnittlig ble tatt for plotting.
2,6. Immunoblotting
totale protein isolert fra celler etter behandling, med eller uten PMA /[6] -gingerol, ble underkastet Western blotting som beskrevet tidligere [20]. Kort sagt, 60 mikrogram av hel-celle-lysat ble separert på en 10-15% polyakrylamidgel, blottet på en PVDF-membran, probet med tilsvarende antistoff og påvist ved anvendelse av ECL (Millipore, Billerica, MA, USA).
2,7. Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA)
EMSA ble utført for å vurdere DNA-bindende aktivitet av NF-kappa B eller AP-1 transkripsjonsfaktorer i celler behandlet med PMA og /eller [6] -gingerol, som beskrevet tidligere [21]. I korte trekk, 10 mikrogram av kjerneproteiner, isolert fra celler etter medikamentbehandlinger, ble inkubert i 30 minutter med
32P-ende-merket dobbeltkjedet 45-mer oligonukleotid for NF-kappaB (5’TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3 «, ved 37 ° C) eller 21-mer oligonukleotid for AP-1 (5»-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3 «, ved 30 ° C), og DNA-protein-komplekset ble løst i 6,6% ikke-denaturerende polyakrylamid gel, som ble tørket og visualisert på fosforavbilder (Personal Molecular Imager FX, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
2,8. Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført i det minste i tre paralleller (n = 3). Feilstolpene representerer ± standardavvik (S.D) av forsøkene. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av t-test og symbolene *, ** og *** representerer P-verdier, p≤0.05, p≤0.005 og p≤0.001 hhv.
Resultater
3,1. [6] -gingerol induserer doseavhengig cytotoksisitet i tykktarm kreft celler mens normal intestinal epitelceller er upåvirket
[6] -gingerol ble screenet for sine cytotoksiske effekter på SW-480 og HCT116 cellene ved ulike konsentrasjoner fra 5 mikromolar til 300 mikromolar, i 72 timer, ved hjelp av MTT-analysen. Doseavhengige endringer i cellulær morfologi var tydelig etter fasekontrastmikroskop (fig. 1A). Resultatene viser [6] -gingerol for å være cytotoksisk overfor både SW-480 og HCT116-celler på en doseavhengig måte, med fremstående cytotoksisitet ved høyere konsentrasjoner produserer en IC
50 verdi på 205 ± 5 mikromolar, og 283 ± 7 mikromolar henholdsvis (fig. 1B og 1C fig.) sikret effekten var mer fremtredende i tilfelle av SW-480 enn HCT116 og således det tidligere ble anvendt i alle ytterligere studier. Tvert imot viser resultatene fra MTT-assay med mus normal IECs avslørte bare 10-15% cytotoksisitet selv på det dobbelte av IC
50 konsentrasjonen av [6] -gingerol mot SW-480.The cellulær morfologi, og celletallet ble observert i stor grad upåvirket selv ved 500 mikromolar av [6] -gingerol (fig. 2A). Studerer den tidsavhengige effekt av [6] -gingerol ved effektive konsentrasjoner avslørte en økning i cytotoksisitet av SW-480 celler over tid fra 48 timer til 96 timer, selv om cellelevedyktigheten av normale mus IECs forble uendret (fig. 2B) .Disse resultater tyder det spesielle ved [6] -gingerol i indusere cytotoksisitet i kreftceller uten å være giftig for normale celler selv ved høyere konsentrasjoner.
(A) fasekontrastmikroskop bilder av morfologiske endringer i SW-480 celler ved behandling med indikerte konsentrasjoner av [6] -gingerol i 72 timer. (B) Relative cellelevedyktighet SW-480 celler etter [6] -gingerol behandling, bestemt ved MTT-analyse og uttrykt som prosent av den ubehandlede kontrollen. 5000 celler /brønn av SW-480-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av [6] -gingerol i 72 timer før MTT-assay. (C) Relativ cellelevedyktighet HCT-116-celler etter [6] -gingerol behandling. Resultatene er representert som gjennomsnittet av triplikate forsøk ± standardavvik (SD).
(A) fasekontrastmikroskop-bilder av IECs behandlet med indikerte konsentrasjoner av [6] -gingerol i 72 timer. (B) Tidsavhengige cytotoksiske effektene av [6] -gingerol på SW-480 og IECs på 48, 72 og 96 timer. 5000 celler /brønn i SW-480 og 10.000 celler /brønn av IECs ble behandlet i 48 til 96 t med angitte doser av [6] -gingerol før MTT-analyse. Resultatene er representert som gjennomsnitt ± SD fra tredoble eksperimenter.
3,2. [6] -gingerol induserer apoptose i tykktarmskreftceller, men ikke i normale intestinale epitelceller
For å vurdere hvorvidt induksjon av cytotoksisitet av [6] -gingerol medieres av apoptose, membranen flip-flop og eksternalisering av phosphotedylserine ble overvåket i [6] -gingerol behandlet SW-480 celler ved å utføre Annexin-V /PI farging. Resultatene fra Annexin V-/PI farging bekreftet de tidlige hendelsene i apoptotis i [6] -gingerol behandlede SW-480-celler, som fremgår av den doseavhengige økning i de fluorescerende celler (fig. 3A) .De resultater fra tilsvarende studie utført på mus IECs viste bare ubetydelig antallet fluorescerende celler, selv ved 500 mikromolar av [6] -gingerol treatment.100 mikromolar 5-Fluro Uracil (5-FU) tjente som positiv kontroll for Annexin V-farging på normale IECs (fig. 3B ).
(A, øvre panel) SW-480 celler ble behandlet med angitte konsentrasjoner av [6] -gingerol i 16 timer og farget for Annexin V /propidiumjodid (PI) positivitet. Grønn-fluorescens indikerer Annexin V-binding til det skadede cellemembranen i løpet av tidlig apoptose, og den røde fluorescens indikerer PI binding til den eksponerte DNA i slutten av apoptose. (A, nedre panel) Grafisk fremstilling av prosentandelen av Annexin V /PI positive SW-480-celler i forhold til [6] -gingerol konsentrasjon. (B, øvre panel) IECs ble behandlet med opp til 500 mikrometer fra [6] -gingerol for 16 timer før du utfører Annexin V-PI farging. Behandling med 100 uM 5-FU ble benyttet som positiv kontroll for apoptose-induksjon. (B, nedre panel) Representant histogram av prosentandelen av Annexin /PI positive IECs følgende [6] -gingerol /5-FU behandling. Resultatene er representert som gjennomsnitt fra tredoble eksperimenter ± SD.
Vi har også analysert celleekstrakter fra SW-480 celler behandlet med [6] -gingerol for aktivering av caspases-8, 9, 3 , 7 og PARP-spaltning av ved hjelp av immunoblottingforsøk eksperimenter. Kaspaser er en familie av cysteinproteaser som aktiveres i løpet av apoptotiske programmet. Vi har observert en betydelig spaltning av pro-kaspase 8 til dets aktive fragmenter (p43 /41) og procaspase-9 til dets aktive fragmenter (p35 /37) (Fig. 4A og 4B). Aktivering av effektorcellene kaspasene 3 og 7 ble også indusert ved [6] -gingerol på en doseavhengig måte, spalte procaspase-3 til dets aktive fragmenter (p17 /19) og styrke spalting av procaspase-7 til sin aktive fragment (p20) (fig. 4C og 4D). Til slutt, undersøkte vi spalting av DNA-reparasjon protein, PARP, som er et substrat for caspase-3.Upon å behandle cellene med 200 og 300 mikromolar av [6] -gingerol, ble den 116-kDa formen av PARP spaltet til den 89 kDa-fragmentet (fig. 4E), noe som bekrefter en caspase-mediert apoptose. Siden 200 mikromolar av [6] -gingerol var effektivt å aktivere kaspaser som fører til PARP-spaltning og apoptose, ble denne konsentrasjonen anvendt i videre signaleringsstudier.
SW-480-celler (10
6 celler /brønn) ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av [6] -gingerol i 48 timer og hele celleekstrakter ble Western blottet på PVDF-membran. Aktivering av kaspaser og PARP-spaltning ble påvist ved undersøkelser av blottet med antistoffer mot membranen Caspase-3, 7, 8, 9 og mot PARP. Blottene ble utviklet ved hjelp av Enhanced Chemiluminescence (ECL). De relative ganger forskjellen band med kontrollbehandlinger ble kvantifisert fra volumanalyse av bandene som bruker Biorad- Antall ett-maskinen. p-aktin tjente som lasting kontroll i hvert enkelt tilfelle.
3,3. [6] -gingerol hemmer PMA-indusert aktivering av MAP kinaser i SW-480 celler
PMA er et velkjent svulst promoter som aktiverer nesten alle protein kinase C (PKC) isoenzymer, som er fremtredende oppstrøms regulatorer av mitogen-aktivert protein (MAP) kinase pathway [22], [23] .De kinetikken ved fosforylering av Ras /Raf /ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK1 /2), c-jun NH2-terminal kinase (JNK) og p38 MAP-kinase i SW-480-celler i respons til behandling med 50 ng /ml (80 nM) PMA for ulike tidsintervaller ble studert. Western blot analyse viste en tidsavhengig fosforylering av ERK1 /2, JNK og p38.In alle tre tilfeller, fosforylering var tydelig i 5 min fra PMA behandling, og det nådde en topp ved 30 minutter og deretter avtok etter 120 minutter (Fig. 5A). Virkningen av [6] -gingerol på PMA-induserte transiente fosforylering av MAP-kinaser ble undersøkt i 30 min PMA-behandlede SW-480-celler, forbehandlet med 200 mikromolar [6] -gingerol i 2 timer. Interessant, [6] – gingerol forbehandling avskaffet PMA-indusert forbigående fosforylering av ERK1 /2 og JNK nesten helt, men bare delvis opphevet fosforylering av p38 MAP kinase i SW-480 celler (figur 5B.)
(A) over natten dyrket SW-480-celler ble behandlet med 50 ng /ml PMA for forskjellige tidsintervaller (0-120 min) og det hele cellelysatet ble immunoblottet på PVDF-membran, probet ved bruk av antistoffer mot fosfo-ERK1 /2, fosfo-JNK og fosfo-p38, som er utviklet av ECL. Kinetikken av PMA-induserte fosforylering av disse MAP-kinaser ble fulgt fra dette blot (B) SW-480-celler ble forbehandlet med 200 pM [6] -gingerol før behandling med 50 ng /ml PMA i 30 minutter, og hele cellelysater ble immunblottet, undersøkt og oppdaget som ovenfor. Den relative ganger forskjell av band med kontrollbehandlinger er angitt under hvert kjørefelt. β-actin tjente som kontroll lasting i hvert enkelt tilfelle. (C) SW-480-celler, forbehandlet med indikerte konsentrasjoner av [6] -gingerol i 2 t, ble behandlet med PMA (50 ng /ml) i 30 min. De nukleære ekstrakter fra hver behandling ble analysert for aktivering av AP-1 eller (D) NF-kappaB, ved å utføre den transkripsjonelle bindingsanalysen på isotop-merket AP-1 /NF-kappaB spesifikke DNA-bindende proben og å analysere den på elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA). Pilspissen i hvert enkelt tilfelle indikerer komplekser mellom AP-1 /NF-kappaB og DNA-probe.
3,4. [6] -gingerol hemmer transkripsjonelle bindingsaktiviteten til PMA-indusert AP-1, men ikke NF-kappaB, i SW-480
PMA er et velkjent aktivator av transkripsjonsfaktorene AP-1 og NF- kappaB i forskjellige kreftceller [24], [25], [26], [27]. For å bestemme den transkripsjonelle bindingsaktiviteten av AP-1 i SW-480, induseres som svar på PMA, kjerneekstrakt fra cellene behandlet med 50 ng /mikroliter PMA i 1 time ble benyttet for EMSA. En klar doseavhengig aktivering av AP-1 ble observert i SW-480-celler ved PMA-behandling (figur 5C;. Felt 5) .A doseavhengig nedregulering av dette PMA-indusert AP-1 ble observert bindende 2 timer pre -rensing med [6] -gingerol (figur 5C,. Lane 6-8). [6] -gingerol forbehandling ikke viser en drastisk effekt på den transkripsjonelle bindende egenskapen av NF-kappaB, selv om det var en signifikant inhibering av dets DNA-binding på 300 mikromolar [6] -gingerol (figur 5D,. Lane 6-8 ).
3,5. [6] -gingerol hemmer PMA-induserte celleproliferasjon i SW-480 via hemming av ERK1 /2 og JNK MAP-kinase-trasé
For ytterligere å forstå de mekanistiske detaljer bak de inhiberende virkninger av [6] – gingerol på PMA-aktiverte signalveier i SW-480, ble levedyktigheten og spredning av SW-480 celler overvåkes av MTT-analyse etter å behandle dem med ulike kombinasjoner av PMA, [6] -gingerol og hemmere av MAP kinaser eller NF-kappaB. Primært PMA behandling økt spredning av SW-480 celler betydelig. Men, [6] -gingerol forbehandling av cellene brakt ned PMA-indusere spredning drastisk. Imidlertid levedyktigheten til SW-480-celler etter [6] -gingerol behandling var betydelig større i nærvær av PMA (fig. 6A).
(A) over natten dyrket SW-480-celler ble forbehandlet med inhibitorer ( U0126, SP600125, SB203580 for ERK1 /2, JNK og p38-MAP-kinaser henholdsvis eller SN50 for NF-kappaB) i 1 time og deretter behandlet med [6] -gingerol i 2 timer, etterfulgt av eksponering for PMA i 48 timer, før utføre celleviabilitet analyse ved hjelp av MTT. Den relative levedyktigheten til SW-480-celler i hver behandlings representeres som prosent av ubehandlet kontroll. De presenterte verdier er gjennomsnittet av tredoble eksperimenter ± SD. Total lysater fra celler behandlet med kombinasjonen av [6] -gingerol med (B) U0126 og (C) SP600125 inhibitorer og fra passende kontrollbehandlinger var Western blottet og probet med anti-kaspase-3 antistoff, og blottene ble utviklet ved bruk av ECL. Beta-aktin tjente som lasting kontroll.
Deretter utførte vi de samme eksperimentene på SW-480 celler pre-behandlet med hemmere av medlemmer av MAP kinase familie og NF-kappaB. U0126 ble benyttet som en spesifikk inhibitor av ERK1 /2 pathway, SP600125 som en inhibitor av JNK-aktivering og SB203580 som hemmer av p38 MAP-kinase pathway.SN50 ble brukt som en inhibitor av NF-kappaB transkripsjonsfaktor. Ingen av de ovennevnte inhibitorer hadde noen cytotoksisk effekt på SW-480 celler ved den testede konsentrasjon (fig. 6A). Men, forbehandling med U0126 og SP600125 betydelig redusert PMA-induserte proliferasjon av SW-480-celler for å utvide den samme, selv om i mindre utvide sammenlignet med [6] -gingerol forbehandling (Fig. 6A). Disse resultater viser den vesentlige rollen til ERK1 /2 og JNK MAP-kinaser baner i å indusere proliferasjon av SW-480-celler i nærvær av PMA. Forbehandling med SB203580 og SN50 hadde liten effekt på PMA-indusert spredning av SW-480 celler (fig. 6A), beviser manglende involvering av p38 MAP kinase sti og NF-kappaB transkripsjonsfaktor i denne prosessen.
til slutt, [6] -gingerol behandling ble utført på SW-480-celler forbehandlet med hver av de ovennevnte inhibitorer før induksjon med PMA. Overraskende, i hvert tilfelle cellenes levedyktighet ble redusert til et nivå lik den for forbehandling med bare [6] -gingerol før PMA-behandling. Dette resultatet tyder på at, i nærvær av U0126, [6] -gingerol utfyller dette ERK1 /2-inhibitor ved lertid aktivering av JNK-MAP-kinase og, i nærvær av SP600125 den hemmer ERK1 /2-aktivering, og dermed redusere cellenes levedyktighet til den samme nivå i begge disse tilfellene. I nærvær av SB203580 og SN50-inhibitorer [6] -gingerol utøver sin hemmende effekter på både ERK1 /2 og JNK MAP kinase veier, og således bringer ned cellelevedyktigheten til det samme nivå som ovenfor. Disse resultatene beviser den like bidrag fra begge ERK1 /2 og JNK MAP kinase baner i [6] -gingerol hemming av PMA-induserte celleproliferasjon av SW-480. Siden det ikke er noen additiv eller synergistiske inhiberende virkninger på proliferasjon av PMA-behandlede SW-480 celler som følge av forbehandlingen med kombinasjonen av [6] -gingerol med U0126 eller SP600125, sammenlignet med forbehandling med [6] -gingerol alene , ERK1 /2 og JNK MAP kinase vei synes å være de viktigste signalveier som er berørt av [6] -gingerol under hemming av PMA-indusert celleproliferasjon i SW-480.
for å teste om de hemmende effekter på PMA-induserte celleproliferasjon av SW-480-celler fra [6] -gingerol og U0126 eller SP600125 ble apoptose mediert, overvåket vi aktiveringen av caspase 3 fra hver av disse behandlingene ved hjelp av Western blotting. Vi observerte spalting av procaspase tre i alle behandlinger som involverer [6] -gingerol, U0126 eller SP600125 og i kombinasjon [6] -gingerol og disse hemmere (Fig. 6B og 6C). Det var også interessant å merke seg at ingen ytterligere forringelse av caspase 3 mor bandet ble produsert når hemmere og gingerol ble brukt sammen. Dette attesterer at nedregulering av ERK1 /2 /JNK /AP-en sti indusert av PMA, er ansvarlig for de hemmende effekter av [6] -gingerol på PMA-indusert celleproliferasjon i SW-480.
diskusjon
anti-kreft og anti-inflammatoriske egenskaper [6] -gingerol har blitt anerkjent siden lenge, og mange studier har rapportert ulike molekylære mekanismene bak disse egenskapene. De inhiberende virkninger av [6] -gingerol mot cancer av forskjellig opprinnelse ble rapportert tidligere. [6] -gingerol har vist seg å være spesielt effektiv mot huden karsinom, og ved inhibering av angiogenese i endotelceller [28], [29]. Ingefær er et kosttilskudd og en viktig ingrediens i mange tradisjonelle medisiner, er det logisk å studere effekter av [6] -gingerol om kreft i mage-tarmkanalen som tykktarmskreft. Dessuten var de farmakokinetiske studier på de aktive komponentene av ingefær fra oralt administrerte ingefær ekstrakter i mennesker oppdaget en betydelig grad av [6] -gingerol, enten i fri eller konjugert form, i plasma og tykktarm vev [30], [31]. En annen studie på biotilgjengeligheten av [6] -gingerol i rotter antydet at når oralt administrert det blir detektert ved konsentrasjoner på 4,3 ug /ml i plasma ved ti minutter etter administrasjonen. Den samme studien bestemmes også av sin høye distribusjon i vev med høyest konsentrasjon i vev av mage-tarmkanalen. Vevet til plasma-forhold av [6] -gingerol ble rapportert å være 1, og ble tilskrevet dets lipofilitet [32]. Alle disse fakta støtte en studie på anti-kreft effekt av [6] -gingerol på tykktarmskreft.
Den første tiåret av 21
århundre hadde en økning i antall studier på karakter mekanismene bak anti -cancer effekter av fytokjemikalier. Studier på mekanistiske evaluering av anti-kreft egenskaper [6] -gingerol mot ulike typer kreft gitt verdifull innsikt i sin flere virkningsmekanismer i å bringe om cytotoksiske eller pro-apoptotiske effekter i kreftceller. Noen nyere rapporter om anti-kreft aktiviteter [6] -gingerol mot tykktarmskreft presenteres ulike mekanismer for sin handling på ulike tykktarmskreft cellelinjer [13], [14], [15], [33]. Denne studien på SW-480 cellelinje viser
in vitro
cytotoksisitet av [6] -gingerol med en IC
50 verdi av 205 mikromol. Den tidligere studie på
in vitro
cytotoksiske effektene av [6] -gingerol på SW-480 cellelinje rapporterte kun 17% celledød ved denne konsentrasjonen [13] .Disse forskjeller i omfanget av effektene kan skyldes variasjonene i den fremgangsmåte som brukes for å studere cytotoksisitet. Det er også verdt å merke seg at den samme studie rapporterte bare 13% cytotoksisitet i LoVo-celler ved behandling med 200 mikromolar av [6] -gingerol i 72 timer, noe som senere ble rapportert i en annen studie som 75% ved 50 mikromolar i den samme cellelinjen etter 48 timers behandling [15]. Den doseavhengige økning i apoptotiske celler (Annexin V-/PI positive celler) i SW-480-celler ved behandling med [6] -gingerol, opp til 25-folds ved 300 uM konsentrasjon, viste at cytotoksisiteten ble indusert hovedsakelig av apoptose. Tidligere studier rapportert både cellesyklus og apoptose som virkningsmekanismen av [6] -gingerol [13], [34]. To ganger økning i apoptose ble rapportert med lignende forhold i SW-480 fra [13], men de viste også betydelig G2 /M arrest i cellesyklusen som svar på [6] -gingerol behandling. Mange tidligere rapporter antydet at [6] -gingerol induserer apoptose bare ved eller i nærheten av 300 mikromolar i kreftceller [13], [34], [35], [36], og under denne konsentrasjonen det fremkaller cytotoksisitet hovedsakelig ved andre mekanismer. Men observerte vi fluorescerende celler i SW-480 behandlet med enda 100 mikromol [6] -gingerol, klart tyder tidlige apoptose hendelser selv ved lavere konsentrasjoner. Videre er dose-avhengig aktivering av kaspaser-8,9, 3 og 7 i vårt studium ytterligere bekreftet apoptose som den viktigste mekanisme av celledød i SW-480-celler behandlet med [6] -gingerol. Aktivering av caspase-9 etter [6] -gingerol bekrefter involvering av mitokondrie vei i [6] -gingerol-mediert apoptotis. Imidlertid spaltingen av caspase-8 indusert ved [6] -gingerol kanskje ikke i det vesentlige foreslå involvering av reseptor-mediert vei, som mitokondrie pathway kan også føre til spaltning av caspase-8 gjennom spalting av BH3 i samspill-domene død agonist (BID ) [37]. Induksjon av apoptose i SW-480, en p53-mutert koloncancercellelinje, ved [6] -gingerol er spesielt interessant som p53-mutant-celler er ansett for å være mer motstandsdyktig mot standard kjemoterapeutiske midler og stråling [13], [36]. p53-uavhengig induksjon av apoptose etter [6] -gingerol ble rapportert tidligere i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, der uttrykk for cyclin-avhengig kinase inhibitor, p21
cip1, ble økt uavhengig av p53 uttrykk som fører til reduksjon i Cyclin A og
