Abstract
Å utforske genekspresjonsmønster i magekreft, totalt 26 paret magekreft og noncancerous vev fra pasienter ble inkludert for genekspresjon microarray analyser. Limma metoder ble brukt for å analysere dataene, og gener ble ansett for å være vesentlig forskjellig uttrykt hvis False Discovery Rate (FDR) var verdien 0,01,
p
-verdi var mindre enn 0,01 og ganger endring (FC) var 2. Deretter ble Gene ontologi (GO) kategorier som brukes til å analysere de viktigste funksjonene til forskjellig uttrykt gener. Ifølge Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) database, fant vi veier betydelig forbundet med differensial gener. Gene-Act nettverk og ko-ekspresjon nett er bygget henholdsvis på grunnlag av forholdet mellom de gener, proteiner og forbindelser i databasen. 2371 mRNA og 350 lncRNAs anses som vesentlig forskjellig uttrykt gener ble valgt for videre analyse. GO kategorier, sti analyser og Gene-loven nettverk viste en konsekvent resultat at oppregulert gener var ansvarlige for tumorigenesis, migrasjon, angiogenese og mikromiljøet formasjon, mens nedregulert gener ble involvert i metabolismen. Resultatene av denne studien gir noen nye funn på koding RNA, lncRNAs, stier og co-uttrykk nettverk i mage kreft som vil være nyttig for å veilede videre etterforskning og målrette behandling for denne sykdommen
Citation. Li H Yu B, Li J, Su L, Yan M, Zhang J et al. (2015) Karakterisering av forskjellig uttrykt gener involvert i Pathways Associated med magekreft. PLoS ONE 10 (4): e0125013. doi: 10,1371 /journal.pone.0125013
Academic Redaktør: Francisco J. Esteban, Universitetet i Jaen, Spania
mottatt: 09.11.2014; Godkjent: 06.03.2015; Publisert: 30 april 2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under vilkårene Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden blir kreditert
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Alle microarray-filer er tilgjengelige fra NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (tiltredelse nummer «GSE65801»; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801).
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd for analyse fra Natural Science Foundation National Kina [No. 81172324, nr 91229106, nr 81272749, og nr 81372231], Vitenskap og teknologi Kommisjonen for Shanghai kommune [No. 13ZR1425600], og viktige prosjekter i National Science Teknologi Pillar Program of China (No. 2014BAI09B03). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at det ikke konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er et av de vanligste kreftformene i verden, og forekomsten er spesielt høy i Øst-Asia, spesielt i Kina. Omtrent 952 000 nye tilfeller av magekreft ble diagnostisert på verdensbasis i 2012, og halvparten av dem skjedde i Øst-Asia (hovedsakelig i Kina) [1]. I Kina, er de fleste av pasientene med GC diagnostisert på et sent stadium med dårlig prognose. Derfor belyse de molekylære mekanismene bak GC progresjon er viktig å identifisere viktige biomarkører og utvikle effektive målrettet terapi.
I løpet av det siste tiåret har genuttrykk mikromatriser blitt et vanlig verktøy for å undersøke genet transkripsjonsnivåer i kreftforskning. Microarray data brukes til et bredt spekter av analyser, for eksempel uten tilsyn clustering, klassifisering, differensial uttrykk analyse og uttrykk kartlegging av kvantitativ egenskap loci [2]. Det bidrar ikke bare til å identifisere viktige dysfunksjonelle gener i kreft, men gir genom-wide informasjon om genekspresjon på en gang, så vel [3,4]. I denne studien utførte vi et genom-wide kartlegging av uttrykk for lncRNAs og mRNA fra sammenkoblede prøver av primær mage kreft vev og noncancerous vev, for å profilere de forskjellig uttrykt lncRNAs og koding RNA. Studier av disse dataene vil gi verdifull informasjon om mekanismen for kreftutvikling og tillate oppdagelsen av viktige gener som kan fungere som fremtidig mål for anti-kreft terapi.
Metoder og materialer
Etisk uttalelse
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Studien ble godkjent av Human forskningsetiske komité for Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.
Vevsprøver
Vev ble tatt fra primær mage karsinom fra ubehandlede pasienter som gjennomgikk D2 radikal gastrektomi i Shanghai Ruijin Hospital. For hver kreftvev, ble en sammenkoblet noncancerous vevsprøve oppsamlet fra tilstøtende område på samme tid. Størrelsen på hver prøve var rundt 0.1cm
3. Alle prøvene ble plassert i RNAlater løpet av 15 minutter etter fjerning og lagret i flytende nitrogen inntil RNA-ekstraksjon. I denne studien ble 32 parvise vev samlet for microarray og 26 parvise prøver ble registrert for neste trinn analyse av GO, sti og nettverk etter kvalitetskontroll ved hjelp av 3D Principal komponentanalyse (3D-PCA) og Cluster analyse.
microarray eksperimenter
Agilent SurePrint G3 Menneskelig GE 8x60K Microarray (Motiv ID: 028004) ble benyttet i denne studien. Total RNA ble isolert og forsterket ved hjelp av en lav inngang Hurtig Amp Merking Kit, One-farge (Cat # 5190-2305, Agilent Technologies, USA). Deretter ble de merket CRNAs renset ved en RNeasy mini sett (Cat # 74106, QIAGEN, Tyskland).
Basert på produsentens instruksjoner, ble hvert lysbilde hybridisert med 600ng Cy3-merket cRNA ved hjelp av en Gene Expression Hybridisering Kit (Cat # 5188-5242, Agilent Technologies, USA) og vasket av Gene Expression Wash Buffer Kit (Cat # 5188-5327, Agilent Technologies, USA).
en Agilent microarray Scanner (Cat # G2565CA, Agilent teknologier, USA) og Feature Extraction programvare 10,7 (Agilent Technologies, USA) ble brukt til å skanne hvert lysbilde med samme innstillinger som vises som følger, Dye kanal: Green, Scan resolution = 3 um, 20bit. Rådata ble normalisert ved quantile algoritmen, Gene Spring Programvare 11.0 (Agilent Technologies, US) (beskrevet i S5 tabell).
Limma
Lineære modeller og empiriske Bayes metoder ble brukt for å analysere dataene i denne studien. De resulterende
P
-verdier ble justert ved å bruke BH FDR algoritmen. Det var tre standarder for oss å tenke på at et gen ble betydelig forskjellig uttrykt, FDR verdien var mindre enn 0,01,
P
-verdi var mindre enn 0,01 og fold endringen var 2. (Beskrevet i S5 tabell)
Gå kategori
Vi utførte Gene ontologi (GO) analyser for å analysere funksjoner av forskjellig uttrykt gener i vår microarray henhold til nøkkelen funksjonell klassifisering av Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI). Vanligvis Fishers eksakte test og
χ
2-testen ble påført klassifisere GO kategorien, og den falske funnrate (FDR,) ble beregnet til rette
p
-verdi (
N
k
refererer til antall Fishers test
P
-verdier lavere enn
χ
2 test
P
-verdier). Den anrikning Re ble gitt av: Re = (
n
f Twitter /
n
) /(
N
f Twitter /
N
) i de betydelige kategorier (
N
f
er antall differensialgener innenfor bestemt kategori,
n
er det totale antall gener innenfor samme kategori,
n
f
er antall differensial gener i hele microarray, og
N
er totalt antall gener i microarray) (beskrevet i S5 tabell)
Pathway analyserer
Pathway merknader av differensial exressed gener ble hentet fra KEGG (http: //www .genome.jp /kegg /). Pathway kategorier med en FDR 0.01 ble merket. Berikelse av betydelige trasé ble gitt av: berikelse = /, som hjalp oss med å finne mer betydelige trasé i vår studie (
n
g
er antall differensialgener innenfor spesielle måte,
n
en
er det totale antall gener innenfor samme vei,
N
g
er antall differensial gener som har minst en sti annotering og
N
en
er antall gener som har minst en sti merknad i hele microarray.) (detalj i S5 tabell).
Gene-loven nettverk
Ifølge KEGG databasen, kan ett gen være involvert i flere veier eller samhandle med flere andre gener. Alle gen-gen-interaksjoner ble samlet sammen for å bygge den Gene-loven nettverk basert på differensial trasé, som hjalp oss å avdekke signalveier og viktige regulatoriske gener i GC.
Co-uttrykk nettverk
Gene koekspresjon Network ble bygget i henhold til den normaliserte signalintensiteten av spesifikke ekspresjonssystemer gener. Grad sentralitet er definert som det antall koblinger en node til en annen, som bestemmer den relative betydningen av gener. Hva mer, ble k-kjerner brukt som en metode for å forenkle grafen topologi analyser. Kjerne regulatoriske faktorer (gener) som har de høyeste gradene koble mest nærliggende gener og bygge strukturen av nettverket (beskrevet i tabell S5).
Sanntids kvantitativ PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Den kvantitative sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR) ble utført ved hjelp av SYBR-grønn PCR-Master Mix i en Fast real-time PCR 7500 System (Applied Biosystems). Primerne av de 10 gener ble vist i tabell S4. PCR-reaksjoner ble utført ved 50 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. ΔCt ble beregnet ved å subtrahere Ct av β-aktin RNA (kontroll) fra Ct til RNA fra prøven, respektivt. ΔΔCt ble deretter beregnet ved å subtrahere ΔCt av styre fra ΔCt av prøven. Brett endringen ble beregnet ved ligningen 2-ΔΔCt.
Statistisk analyse
SPSS programvare 19 og Microsoft Excel 2010 var brukt til å analysere dataene. Expression nivåer mellom kreft vev og tilstøtende noncancerous vev ble analysert ved parvise sample t-test.
P
-verdier under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Mikromatrise analyserer
Totalt 42,405 menneskets gener ble profilert i vår studie av ved hjelp av en Agilent G3 Menneskelig GE 8x60K microarray. Vi har levert vår datasett i depotet av «Gene Expression Omnibus» og aksesjonsnummer var «GSE65801» (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801). Vi brukte lineære modeller og empiriske Bayes metoder for å analysere dataene (se Methods). Det var 2371 mRNA og 350 lncRNAs anses som differensielt uttrykte gener av limma for neste trinn analyse (figur 1A).
A) Volcano plott som viser differensial gener (røde prikker) i uttrykket mikromatriser (
P
-verdi 0,01, FDR 0,01). B) Clustering heatmap viser differensial lncRNAs. Hver kolonne representerer en prøve, og hver rad representerer en differensial lncRNA. C) Clustering heatmap viser differensial mRNA. Hver kolonne representerer en prøve, og hver rad representerer en differensial mRNA.
Blant alle 2371 differensial mRNA, det er 1142 mRNA nedregulert og 1229 mRNA oppregulert i vår observasjon på endringer i genuttrykk mellom magekreft og kontroll vev (fig 1c). De fleste av de differensielle mRNA-er har vist seg å være korrelert med karsinogenese og metastase i de fleste typer kreft (Tabell 1). Genene som GKN2, PGC, MUC6, Chia, PSCA og FBP2 var blant de topp 20 nedregulert gener, mens KLK8, SFRP4, INHBA, CLDN1, CST1, FAP, SPP1, OLFM4, og KRT17 var blant topp 20 opp -regulated gener (tabell 1). Imidlertid har enkelte gener som HOXC9, FNDC1, STRA6, KCNE2, PGA3 og KCNJ16 ikke blitt rapportert i magekreft og deres roller er ukjente (tabell 1).
I tillegg fant vi 193 nedregulert lncRNAs og 156 oppregulert lncRNAs blant totalt 350 differensial lncRNAs basert på profileringen (figur 1B). De fleste av lncRNAs har ikke fått en offisiell navn og deres funksjoner forblir ukjent. Men noen har blitt rapportert å spille viktige roller i kreft, slik som H19, GUCY1B2, MEG3 og AKR7L (tabell 2).
I vår forrige rapport [36], fold endring (FC) av H19 i 74 magekreft versus sammenkoblede noncancerous vev var 6,015, med en
p
-verdi på 0,017. Dette resultatet var konsistent med dataene på H19 (Absolute FC = 6.06) i denne microarray analyser. Videre over-uttrykk for H19 bidrar til spredning, migrasjon, invasjon og metastasering av magekreft.
Gene Ontologi kategorier
Alle de differensielt uttrykte gener ble klassifisert i ulike funksjonskategorier i henhold til Gene ontologi (GO) prosjekt for biologiske prosesser. Basert på våre microarray data, analyser GO indikerte at 208 GO termer ble beriket (
P
0,01, FDR 0,01) (S1 tabell). Den primære GO kategorier for 170 oppregulert GO termer ble fokusert på celle adhesjon, angiogenese, flercellet organisme utvikling, axon veiledning, skjelettsystemet utvikling, kollagen fibril organisasjon, positiv regulering av angiogenese, såret og negativ regulering av celleproliferasjon (Fig 2A) . De viktigste GO kategorier for nedregulert gener var fordøyelsen, xenobiotisk metabolske prosessen, trans transport, ion transport, små molekyl metabolske prosessen, negativ regulering av vekst, glutation metabolske prosessen, cellulær respons til kadmium ion og metabolisme (Fig 2B).
A) De betydelige GO kategorier for oppregulert gener. B) De betydelige GO kategorier for nedregulert gener.
P
-verdi 0,01 og FDR. 0,01 ble brukt som en terskel for å melde betydelige GO kategorier
Ifølge differensialgener og funksjoner, vi bygget en GO treet å utforske samspillet mellom alle differensial GO kategorier. Mangfoldet i disse kategoriene når man sammenligner kreft og kontroll vev antydet at magekreft kan være assosiert med signifikant oppregulert cellemigrering, celleformering, angiogenese, celle-celleadhesjon og celleoverflate-reseptor signalveier, mens celle metabolisme prosesser og ion transmembrane transport er nedregulert (fig 3).
Røde prikker representerer oppregulert GO kategorier og grønne prikkene representerer nedregulert GO kategorier.
Pathway analyserer
pathway analyser ble brukt for å identifisere de vesentlige baner er forbundet med de differensielt uttrykte gener i henhold til KEGG. Det var 32 oppregulert trasé og 31 nedregulert trasé basert på de data (Fig 4). Videre sti profilering var konsistent med resultatene for de GO kategorier i kreftrelaterte biologiske funksjoner. Våre data viste noen differensial gener sterkt oppregulert som foreslo deres involverte trasé ble activiated. For eksempel ble SFRP4, WNT11, FZD2, MYC sterkt uttrykt i kreftvevet som representerer Wnt sti ble activiated og BCL2A1, ICM1, TNFSF14 i NF-kB veien ble sterkt uttrykt i tillegg. De fleste av kreft-relaterte signalveier som JAK /STAT, Wnt, NF-kB, PI3K, mTOR, pinnsvin og Notch trasé ble aktivert i magekreft sammenlignet med noncancerous vev basert på våre data (S2 Table). De oppregulert trasé som ble fokusert på celle adhesjon, transcriptional feilregulering, kreftutvikling og differensiering ble korrelert med tumorogenesis eller metastasering (figur 4A). Men nedregulert trasé var generelt ansvarlig for metabolisme (Fig 4B).
A) Top-ranking oppregulert trasé identifisert av KEGG. B) Top-ranking nedregulert trasé identifisert av KEGG. Differensial trasé er oppført i henhold til
P
-verdi 0,01 og FDR 0.01.C) Pathway-loven nettverk viser samspillet av differensial veier. De røde prikkene representere oppregulert stier og de grønne prikkene representerer nedregulert trasé.
Gene-loven nettverk
Basert på GO kategorier og sti analyse, ett gen kan være involvert i flere veier eller samhandle med flere andre gener. Vi samlet differensial gener og bygget et nettverk av interaksjonene differensielt uttrykte gener. En høy grad regulerer protein eller reguleres av mange andre proteiner, noe som innebærer en viktig rolle i den Gene-Act nettverk (S3 tabell). Glutation S-transferase (GST) familie, cytokrom P450 (CYP) familie, UDP glucuronosyltransferase 2 (UGT2) familie, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) familie og cAMP-avhengig protein kinase katalytisk beta (PRKACB) var i kjernen av gen-gen interaksjon nettverk. De kan spille viktige roller i nettverket fordi de hadde den sterkeste grad (grad 25) centralities (gen-gen-interaksjoner) (figur 5). Det har blitt rapportert at GST, EGFR og PRKACB er ansvarlig for signaltransduksjonsveier involvert i tumor vekst og differensiering i ulike typer kreft [42,43].
Røde prikker representerer oppregulert gener og grønne prikker representerer nedregulert gener. Pilene viser tilkoblingen og regulatoriske forhold mellom to gener. Gener som har flere forbindelser med andre gener har en høyere grad poengsum.
Gene co-uttrykk nettverk
Vi produserte et gen co-uttrykk nettverk basert på de forskjellig uttrykte gener, proteiner og proteinkompleks i kreft vev og (kontroll) noncancerous vev, henholdsvis. Sammenlignet med kontrollgruppen, forbindelsene mellom genene i kreftvev var mindre, noe som antydet at de fleste av de fysiologiske gen-gen-interaksjoner og bindinger i normale vev hadde blitt ødelagt eller tapt i kreftvev (figur 6A og 6B). Genene med høy grad og k-kjerne som betyr at de eide det meste av interaksjoner med andre geneswere kjent som viktige gener i samspillet nettverk (figur 6B) inkludert TRO, GPR124, TIMP2, EMCN, SLIT3, HTRA1, SPARC, LAMA4 og MEOX2 (tabell 3). De var ansvarlig for celle signalisering, vedheft, angiogenese, vandring, vekst og metastasering.
En) Samtidig uttrykte gener og deres nettverk i noncancerous vev. B) Co-uttrykte gener og deres nettverk i magekreft. Jo større verdien av K-score, jo sterkere differensielt uttrykte gener er co-uttrykt. Omfanget av K-score er fra 1 til 21 i normalt vev, men 1-5 i kreftvev.
Bekreftelse av microarray resultatene av qPCR
Vi utførte kvantitativ real-time PCR (qPCR) på 6 oppregulert gener (COL1A, BGN, SPP1, Melk, IGFBP4, SPARC) og 4 nedregulert gener (PGC, SST, MT1X, S100P) for å verifisere våre data i mage kreft vev (Tumor) og noncancerous vev (Normal). Uttrykket prosenter av disse 10 gener (Tumor /Normal) fra qPCR er i overensstemmelse med de fra microarray (S4 tabell). Det foreslo data av differensial gener uttrykk fra microarray var pålitelig. Hva mer, har vårt team vært jobbet med noen av differensial gener som PHF10 [55], CEACAM6 [56], SFRP1 [57], SOX11 [58], CLDN1 [59] for å undersøke deres uttrykk og funksjoner i magekreft og resultatene perfekte viste vår microarray data.
Diskusjoner
Microarray gen-uttrykk analyser på magekreft har tidligere blitt brukt til å forutsi diagnostiske markører [60] og for å identifisere genuttrykksmønster forbundet med prognose [ ,,,0],61,62], men det er ikke blitt brukt til å avdekke molekylære interaksjoner mellom lncRNAs og mRNA i GC. I denne studien analyserte vi 26 mage kreft vev med tilkoblede noncancerous vev og profilert genene forskjellig uttrykt i henhold til deres GO kategorier, veier, Gene-loven nettverk og Co-Expression nettverk.
genuttrykk resultater ble oppnådd ved hjelp av en Agilent G3 Menneskelig GE 8x60K microarray, som ikke bare dekker transkriptom databaser for mRNA mål, men inkluderer også prober for lncRNAs (lange ikke-kodende RNA). Med kombinasjonen av mRNA og lncRNAs, kan det utføre to forsøk på en enkelt mikromatrise og forutsi lncRNA funksjon og interaksjon med mRNA. Analysene viste et sett av gener som er differensielt uttrykte mellom magekreft og normalt vev. Noen av dem har blitt rapportert tidligere i mage eller andre kreftformer. For eksempel uttrykk for gastrokine-2 (GKN2) var signifikant nedregulert eller fraværende i magekreft cellelinjer, mage tarm Metaplasi og tumorvev. Over-uttrykk for GKN2 bidratt til celleproliferasjon, migrasjon og invasjon av magekreft og arrestert cellesyklusen på G1-S overgangsfase [6]. I kontrast, nivåer av uttrykk for inhibin beta A (INHBA) var signifikant høyere i kreftvev enn i tilstøtende normal slimhinne, og det regnes som en selvstendig prognostisk faktor magekreft [22]. I tillegg oppdaget vi noen nye gener, for eksempel TMEM184A, PSAPL1, KIAA1199, CLRN3 og FNDC1, som ikke har blitt rapportert i magekreft tidligere, og deres roller i kreft fortsatt ukjent.
En av fordelene med vår genuttrykk microarray analyse er at den representerte et uttrykk for lncRNAs og mRNA, slik at begge kan bli undersøkt sammen. Vår tidligere rapport om rollen lncRNA H19 og dets nettverk i GC [36] var basert på denne microarray data. Men de fleste av lncRNAs som DRD5, FMO6P, SNAR-A3 og TPRXL viste i vår microarray ikke har blitt identifisert og trenger videre undersøkelser for å avklare sine roller i magekreft.
Basert på vår genuttrykk profilering data, gener og deres funksjoner aktiveres i magekreft var ansvarlige for spredning, vedheft, migrasjon og metastasering, som var i samsvar med resultatene fra veien analyser. Interessant, oppdaget vi at de fleste av kreft-relaterte signalveier som er rapportert tidligere som Notch, mTOR og Hedgehog ble aktivert i GC basert på våre data. Disse resultatene understøtter det synspunkt at heterogeniteten er karakteristisk for GC. Sammenligning av co-uttrykk nettverk mellom normalt vev og kreft foreslått at uttrykket, funksjoner og interaksjoner av flertallet av fysiologiske genet ble tapt eller skadet i magekreft, mens spredning, migrasjon og metastase ble unormalt forbedret. Disse interessante funn passer til egenskapene for kreft, for eksempel anaplasia og dedifferentiation. Disse differensielt uttrykte gener involvert i signalveier fungerte som viktige gener i co-uttrykk nettverk kan være potensielle mål for anti-kreft terapi eller diagnostiske markører i fremtiden.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Pathway analyser av differensial gener
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s001 plakater (XLSX)
S2 Table. GO analyser av differensial gener
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s002 plakater (XLSX)
S3 Table. Gene-Act nettverk av differensial gener
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s003 plakater (XLSX)
S4 Table. Grunning og verifikasjon
doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s004 plakater (docx)
S5 Table. Metoder og materialer
doi: 10,1371 /journal.pone.0125013.s005 plakater (docx)
Takk
Vi ønsker å takke Dr. Fred Bogott på Austin Medical Center , University of Minnesota, og Dr. Joshua Liao på Hormel Institute, Austin of Minnesota, for deres engelsk redigering av dette manuskriptet. Vi vil gjerne takke de organer for å støtte denne studien. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation Nasjonalt Kina [No. 81172324, nr 91229106, nr 81272749, og nr 81372231], Science and Technology Commission av Shanghai kommune [No. 13ZR1425600], og viktige prosjekter i National Science Teknologi Pillar Program of China (No. 2014BAI09B03).
