Abstract
Bakgrunn
urothelial blærekreft er den niende mest vanlige kreft. Til tross for kirurgisk og kjemoterapeutisk behandling prognosen er fortsatt dårlig når blærekreft utvikler seg til en muskel-invasiv tilstand. Funn av nye diagnostiske markører og pathophysiologic effektorer kan bidra til å bidra til nye diagnostiske og terapeutiske muligheter. Den ekstracellulære matrise mikro formet av den ekstracellulære matrise kritisk påvirker tumorcelle og stroma cellefunksjoner. Derfor Målet med denne studien var å vurdere mulig implikasjon av de små leucine-rik proteoglykan biglycan i utviklingen av menneske urothelial blærekreft.
Metoder og resultater
For dette formål tumor biopsier av 76 blærekreftpasienter med ulike kreftstadier (PTA, PT1-T4) ble undersøkt med hensyn til biglycan uttrykk og korrelert med en langsiktig (10 år) klinisk oppfølging. Interessant nok var høyere biglycan mRNA uttrykk forbundet med høyere kreft etapper og muskel invasivitet.
I
vitro
knock-down av endogent biglycan i menneskelige urothelial carcinoma celler (J82 celler) økt spredning, mens tillegg av rekombinant biglycan og overekspresjon av biglycan hemmet tumor celleproliferasjon. I tråd med dette veksthemmende effekt av biglycan, transplantasjon av J82 celler etter knock-down av biglycan førte til betydelig økt vekst av subkutane xenografttumorer i nakne mus
i
vivo
. Videre behandling med to anti-proliferative, multi-reseptor tyrosinkinasehemmere-sunitinib og sorafenib-sterkt oppregulert biglycan uttrykk. Kollektivt, de eksperimentelle data tyder på at høye biglycan ekspresjon er assosiert med redusert tumorcelle-proliferasjon. I samsvar, Kaplan-Meier analyse viste høyere 10-års overlevelse hos pasienter med høyt biglycan mRNA uttrykk i tumor biopsier.
Konklusjon
I konklusjonen, presentere data tyder på at biglycan er en endogen inhibitor blærekreft celleproliferasjon som oppreguleres som respons på anti-proliferative tyrosinkinaseinhibitorer. I tillegg er høy biglycan uttrykk forbundet med gunstig prognose
Citation. Niedworok C, Rock K, Kretschmer jeg, Freudenberger T, Nagy N, Szarvas T, et al. (2013) Hemmende rolle Small leucine-Rich proteoglykan Biglycan i blærekreft. PLoS ONE 8 (11): e80084. doi: 10,1371 /journal.pone.0080084
Redaktør: Nikos K Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 02.05.2013; Godkjent: 09.10.2013; Publisert: 06.11.2013
Copyright: © 2013 Niedworok et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert delvis av den Ifores Prog av universitetsklinikker Essen (D107-10800, https://www.uni-due.de/med/forschung/forschungsfoerderung/ifores.shtml) og ved Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG (FI 682 /4-1; https://gepris.dfg.de/gepris/OCTOPUS/;jsessionid=E43949FD6A49E805D72DE1129F1DB078?context=person displayMode=print findButton=Finden id=1433803 keywords_criterion=Jens+Fischer module=gepris nurProjekteMitAB=false task=showDetail). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
urothelial blærekreft er den niende mest vanlige menneskelige ondartet kreft med økende forekomst og utbredelse [1]. ikke-muskel invasiv blærekreft er behandlet av transurethral reseksjon og adjuvant drypping behandling ved høy grad sykdom eller i tilfeller med flere, ofte tilbakevendende svulster. Den lave grad av ikke-muskel invasiv sykdom kan utvikle seg til muskel invasiv høy risiko blærekreft. behandlingen av valget for muskel invasiv blærekreft er radikal cystektomi [2,3] som gir likevel bare en lav (~ 50%) 5-års overlevelse. den viktigste årsaken til denne ødeleggende overlevelse er hyppig forekommende metastatisk progresjon hos disse pasientene [6,7]. Cisplatin i kombinasjon med gemcitabin representerer førstelinje adjuvant behandling for pasienter med lokalavansert eller metastaserende blære kreft. Nye kjemoterapeutiske strategier, som involverer reseptor tyrosin-kinase-inhibitorer er for tiden undersøkt i prekliniske modeller, og i kliniske studier [4,5]. Derfor, til tross de kirurgiske og kjemoterapeutika behandlingstilbud alvorlighetsgraden av sykdommen og dårlig prognose trang for oppdagelsen av nye markører for sykdomsprogresjon samt ny innsikt i patofysiologien av blærekreft progresjon.
For å oppnå dette, rettet vi å undersøke bestemte endringer i den ekstracellulære micromilieu som definert av den ekstracellulære matriks (ECM) som er assosiert med progresjonen av blærekreft og hvorvidt en spesifikk biologisk aktivitet kunne tilskrives kandidatmolekyler . ECM er kjent for å påvirke begge, tumor og stromale celler med hensyn til deres fenotypiske karaktertrekk som er relevante for progresjon av kreft, slik som invasjon, proliferasjon og apoptose. Videre er sammensetningen av ECM micromilieu er sannsynlig at en del av den intercellulære kommunikasjonen mellom tumor og stromaceller. Proteoglykaner, sentrale komponenter i ECM, blir stadig mer relevant for kreft biologi på grunn av en mengde funksjoner som er kritiske for tumor-stroma interaksjoner [8]. Proteoglykaner er sammensatt av et kjerneprotein og et glykosaminoglykan kjede som er gjenstand for posttranslational modifikasjoner. Både kjerneproteiner og glykosaminoglykan kjeder bidra til funksjonen av proteoglykaner innen ECM. Små leucine-rike proteoglykaner (SLRP) er en familie av ekstracellulære proteoglykaner som er karakterisert ved leucine-rich gjentar i kjerneprotein. De SLRPs blir utskilt i det ekstracellulære rom, hvor de vekselvirker med andre proteiner, inkludert vekstfaktorer, cytokiner [9-11] og transmembrane reseptorer [12]. Biglycan (BGN) er medlem av SLRPs som samhandler med trans reseptorer av purinergiske P2X7 type og med toll-like receptor (TLR) 2 og TLR4 [13,14]. Førstnevnte er involvert i aktivering av inflammasome, mens den sistnevnte årsak aktivering av den medfødte immunsystemet. Disse handlingene tilskriver immunstimulerende egenskaper til BGN som kan være av betydning for begge, kreftutvikling og tumorprogresjon samt for metastasering. Videre BGN har vist seg å bidra til kollagen nettverkdannelse og stabilitet, til fibronektin fibrillogenese, til fibroblast differensiering og er foreslått for å bidra til angiogene responser [15-18]. I sammendrag, BGN modulerer sannsynlig tumorbiologi ved å utføre viktige kontrollmekanismer, slik som immunrespons, matrise montering og modulering av vekstfaktor-aktivitet. Dette er sannsynligvis oppnås ved begge, direkte cellulær signalisering fremkalt av BGN så vel som ved å forme mikromiljøet gjennom dens virkning på kollagen og fibronectin matrisedannelse.
I tråd med at BGN viser både hemmende og fremme effekter på tumorceller, kontroversielle roller har blitt beskrevet for BGN på ulike kreftformer. For eksempel i mage og tykktarmskreft, så vel som i pankreatisk adenokarsinom, ble BGN ekspresjon funnet å være korrelert med dårlig prognose [19-21]. På den annen side ble overekspresjon av BGN observert i human kreft i bukspyttkjertelen og funnet å hemme veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro product: [22]. Videre BGN nedregulering var assosiert med HER-2 /neu-mediert onkogen transformasjon som var sterkt assosiert med den ondartede fenotypen til disse cellene [23]. Derfor er rollen til BGN i tumorprogresjon avhenger sannsynligvis på tumortypen, stadium og differensiering. Følgelig er disse spørsmålene må tas opp spesifikt i de forskjellige tumortyper. Videre respons fra BGN terapeutiske inngrep er ikke ennå undersøkt. Hensikten med denne studien var å vurdere for første gang uttrykket og rolle BGN hos pasienter med blærekreft.
Materialer og metoder
tumorprøver
genekspresjonsanalyser ble utført i frosne vevsprøver av 76 pasienter (19x PTA, 15x PT1, 14x pT2, 14x pT3 og 14x pt4), som gjennomgikk kirurgisk behandling på grunn av urothelial blærekreft i Universitetssykehuset i Essen mellom 1990 og 2004. Alle frosne vevsprøver var klipp og farget med H E for å bekrefte sin svulst innhold. Bare prøver som inneholder ≥ 70% tumorceller ble utsatt for videre analyse. I tillegg 20 tilfeller av parafininnstøpte blære karsinom (4x PTA – pT4) ble vurdert ved hjelp av immunhistokjemi. Alle pasienter gitt et informert skriftlig samtykke og etikkomiteen av Hospital godkjent studieprotokollen. Det primære endepunktet i studien var kreft-spesi fi c overlevelse (unntatt alle andre dødsårsaker). Dødsårsak ble innhentet fra døden serti fi kater. Forsøkspersonene ble fulgt opp fra baseline (dato for operasjon) undersøkelse frem til juli 2009. Normal blæren vev ble tatt fra pasienter som lider av ikke-ondartet sykdom (pyeloureteral striktur, nevrogen blæredysfunksjon) og fungerte som kontroll for analyse av genuttrykk.
Immunohistokjemi
Immunohistochemistry ble utført basert på protokollene fra produsenten. For BGN farging, ble seksjonene forbehandlet med kondroitinase ABC for å eksponere epitoper av BGN kjerneprotein som tidligere beskrevet [24]. I korte trekk ble spalting med chrondroitinase ABC utført ved behandling av de glir med kondroitinase ABC før inkubasjonen med det primære antistoff ved 37 ° C i 1 time. Vevssnitt ble deretter inkubert i 16 timer ved 4 ° C med kanin anti-BGN-IgG (1: 250 vennlig levert av Larry Fisher, National Institute of Dental Research, National Institutes of Health, Bethesda, USA). Seksjoner med utelatelse av det primære antistoff tjente som negative kontroller. Deteksjon ble utført ved anvendelse av 3,3′-diaminobenzidin (DAB). Bilder ble tatt med en Leica
® DM2000 system og representative områder av alle fargede objektglass ble dokumentert. I tillegg er den prosentandel av Ki67-positive celler som en markør av prolifererende celler ble bestemt i xenograft tumorer (kanin-anti-IgG-Ki67, 01:25, Novus Biologicals, Ltd., Cambridge, UK). Den midlere microvessel tetthet (MVD) ble bestemt som tidligere beskrevet [25]. I korthet ble et minimum på to separate vev seksjoner (10 um) på 6 mus hver gruppe farges ved hjelp av primært kanin polyklonale CD31-antistoff (1:50, Abcam®, Cambridge, UK,) og sekundære Alexa Fluor 568 geite-antikanin-antistoff (1 : 200, Invitrogen, molekylære prober, Eugene, Oregon, USA). Bilder av hele seksjonen ble tatt med et Zeiss Observer Z1 mikroskop med 10x objektiv. Deretter tre høyt vaskularisert områder av 0,49 mm
2 ble valgt til å telle fartøy. Enhver tydelig CD31-positive endotelceller klynge atskilt fra tilstøtende fartøy ble definert som microvessel. De resulterende verdier ble beregnet for hver mus.
Analyse av fargeintensitet ble utført ved hjelp av ImageJ 1,46 programvare (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) som beskrevet tidligere [26].
revers transkripsjon kvantitativ real-time PCR (RT -qPCR)
Total RNA ble isolert fra flash-frossen tumorprøver ved hjelp RNeasy total RNA sett (Qiagen, Hilden, Tyskland). RNA-konsentrasjon og renhet ble bedømt ved fotometrisk måling ved 260/280 nm. 1 pg RNA ble anvendt for cDNA-syntese ved hjelp av QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av Platinum® SYBR® Grønn qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) i 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). GAPDH-genet ble brukt til å normalisere målet genekspresjon. Relative uttrykk nivåer ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCq metode. Følgende primer sekvenser ble brukt. Menneskelige BGN, frem CTCCTCCAGGTGGTCTATCT, omvendt GGTTGTTGAAGAGGCTGATG og menneskelig GAPDH, fremover GTGAAGGTCGGAGTCAACG, omvendt TGAGGTCAATGAAGGGGTC
Cell kultur
J82 celler ble dyrket i RPMI medium som inneholdt 10% føtalt bovint serum. Reseptor-tyrosin-kinase-inhibitorer sorafenib og sunitinib ble anvendt som oppløsning i dimetylsulfoksyd (DMSO) ved en konsentrasjon på 10 pM (sorafenib) og 1 pM (sunitinib) og DMSO ble brukt som kontroll. Celler ble sådd ut ved en densitet på 1×10
5 celler per brønn i 6-brønners kulturskåler (Sigma-Aldrich
®, Hamburg, Tyskland) som resulterer i 60-70% konfluens av kulturene ved den neste dag. Deretter ble cellene vasket med fosfatbufret saltvann (PBS, Gibco
®) og dyrket i serumfritt medium i 6 timer. Mediet ble deretter fjernet, og medium inneholdende 10% serum og den respektive reseptor-tyrosinkinase-inhibitor tilsatt. 12, 24 og 48 timer etter stimuleringen ble supernatanten høstet og anvendt for immunblotting, mens cellene ble høstet for mRNA-analyse som beskrevet tidligere [27]. Renset BGN (rekombinant human BGN, R E farging for å søke etter metastasering. Den lokale Animal Facility samt LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) godkjent dyreforsøk og protokoller for håndtering og oppfølging.
Statistisk analyse
genuttrykk data var analysert enten ved analyse av varians og Bonferroni post hoc test eller ved Student «s
t
test som er hensiktsmessig. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. Statistisk signifikans ble gitt ved nivået for
p
0,05. Data som gjelder kliniske resultater fra pasientparametre ble mangler normalfordeling, noe som indikerer at bruk av ikke-parametrisk to-halet Wilcoxon rank sum test (Mann-Whitney) for parede gruppesammenligninger. Analyse av pasientoverlevelsesdata ble utført ved bruk av standard Kaplan-Meier-algoritmen (PROC LIFETEST, SAS-PC 9.3, SAS-INSTITUTE, Cary, USA). For optimal separasjon av grupper med hensyn til relativ BGN uttrykk, ble variabel klippepunkter evaluert og log-rank test p-verdier ble registrert. Optimal separasjon av to grupper svarende til en minimal p-verdi ble funnet ved en relativ BGN uttrykk verdi på 0,09. For multivariabel analyse Cox regresjonsanalyse ble brukt. Alle statistiske analyser ble beregnet ved hjelp av IBM SPSS® statistisk analyse programvare (versjon 18.0, Chicago, IL, USA).
Etikk uttalelse
Studiet protokoll og samtykke prosedyren ble godkjent av etikkomiteen ved University of Duisburg-Essen, Tyskland og hver pasient gitt et skriftlig informert samtykke. Prosjektet tallet var 07-3537 for lagring Dypfryst og paraffinized tumormateriale og relevante kliniske data.
musene ble utført i samsvar med de regler og standarder for LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) og den lokale Animal Facility av Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Den LANUV godkjent forsøkene og bekreftet overholdelse av kvalitetsstandarder. Prosjektet er identifisert med antall 87-51.04.2010.A149.
Resultater
BGN mRNA uttrykk i menneskelig blærekreft
Først ble prøvene av 76 pasienter med ulike stadier av blærekreft analysert med hensyn til BGN mRNA uttrykk og sammenlignet med uttrykket i sunt vev blæren. Interessant nok ble signifikante forskjeller påvist i mRNA-ekspresjonsnivåer i forhold til tumor invasivitet (figur 1A), gradering (figur 1B) og staging (figur 1C), som tyder på øket BGN mRNA i forløp stadier av blærekreft. Men til tross for denne positive tilknytning svulst staging multivariat analyse viste at BGN mRNA uttrykk nivå (
p
= 0,155) var ikke en uavhengig prognostisk faktor. I kontrast, tumorstadium (
p
= 0,012) og spredning til lymfeknuter (
p
= 0,039) var uavhengige prognostiske faktorer for kreftspesifikk overlevelse som forventet (tabell 1). Videre var det ingen sammenheng mellom BGN mRNA uttrykk og tid til utseendet på metastaser (
p
= 0,862), sykdomsutvikling (
p
= 0,624) eller tilbakefall av sykdommen (
p
= 0,142). BGN var høyere i tumorprøver av kvinner sammenliknet med de av menn (4.86-fold versus 1,66 ganger av kontroll, henholdsvis
p
= 0,003) og hos røykere sammenlignet med de ikke-røykere (3,40 ganger ; røykere 2,01 ganger, henholdsvis
p
= 0,008, Tabell 2)
BGN mRNA ble undersøkt hos 76 pasienter med blærekreft ved RT-qPCR og sammenlignet med ikke-ondartet blæren vev. . En betydelig heving av BGN mRNA uttrykk ble funnet i muskel-invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (A) og i høy grad sammenlignet med lavgradige svulster (B). Videre BGN mRNA-ekspresjon korrelerte med økende tumor trinn (C). n = 76 pasienter, *
p
. 0,05, ***
p
= 0,0003
kreft-spesifikke overlevelse
variabler
HR
CI
95% p
Stage (muskel invasiv) 1.4881.090-2.0300.012Grade (høyverdig) 2.1260.954-4.7400.065Lymphnodes (N +) 2.4001.045-5.5090.039BGN (høy ) 0.9460.876-1.0210.155Table 1. tumor scenen og lymfeknute status er uavhengige prognostiske parametere for blærekreft spesifikk overlevelse.
i en multivariat Cox proporsjonal hazard overlevelse regresjonsanalyse i n = 76 pasienter tumor stadium og lymfeknute status var i stand til å forutsi kreftspesifikk overlevelse uavhengig av andre parametre,
p
-verdier 0,05 ble bestemt som betydelig. CSV Last ned CSV
BGN genuttrykk
P
valuesΣ = 76median (range) Alder ≤ 65 352,81 (0.06-24.33) 0,847 65 n1.95 (0,06 til 8,28) Kjønn Mann 591,66 (0.06-8.28) 0,003 Kvinne 174,86 (0,16 til 24,33) Stage Ta 191,00 (0.13-4.01) 0,986 T1 151,06 (0.12-4.26) 0,512 T2 141,30 (0,06 til 5,53) 0,069 T3 143,78 (0,23 til 12,62) 0,909 T4 145,21 (0,24 til 24,33) Non-invasiv 341,03 (0,12 til 4,26) 0,004 muskel-invasiv 423,37 (0,06 til 24,33) Vurder G1 130,76 (0,12 til 4,01) 0,919 G2 271,08 (0,13 til 4,26) 0.002 G3 363,80 (0,06 til 24,33) Low-grade (G 1-2) 380,97 (0.12-4.26) 0,001 Høyverdig (G 3) 373,76 (0.06-24.33) lymfeknute N0 /Nx622.05 (0,06 til 24,33) 0,196 N 143,66 (0,23 til 15,3) Primer 433,01 (0,12 til 24,33) 0.883Recurrent 331,44 (0,06 til 8,08) Røyking ja 422,01 (0,06 til 24,33) 0,008 ingen 233,40 (0.13-15.28) ukjente 18Table 2. BGN mRNA uttrykk nivåer er forhøyet i muskel invasive svulster, høy grad av svulster, røykfrie og kvinnelige kjønnspasienter.
mRNA genuttrykk nivåer av n = 76 pasienter med blærekreft. Data ble hentet fra flash-frossen tumorprøver. Univariate Cox proporsjonal hazard overlevelse regresjonsanalyse ble brukt for dataanalyse, en
p
-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. CSV Last ned CSV
BGN protein uttrykk i menneskelig blære carcinoma
BGN flekker i humane tumorprøver viste kun svake signaler i stromal vev av ikke-invasiv Ta og T1 svulster (Figur 2A). BGN fargeintensitet økt i muskel-invasiv tumor stadier (figur 2B og C). Som forventet, tumor morfologi i overfladiske trinn var lik normal morfologi blære med et klart skille mellom tumorvev og stromal vev. I høyere tumor trinn (T4), stromale celler og kreftceller, ble sammenblandet og begge celletyper viste sammenheng med BGN farging (figur 2B og C). Imidlertid, fordi BGN er et utskilt proteoglykan den cellulære Kilden kan ikke utledes fra immunfarging av vev. Kvantifisering av den positive området brøkdel bekreftet økt fargeintensitet av BGN i muskel-invasiv tumor etapper (T2-4) sammenlignet med ikke-muskel invasiv Ta og T1 stadier (figur 2D). I tillegg ble en korrelasjon av det BGN positive område fraksjon og invasivitet av tumoren påvises (
p
= 0,0025, figur 2E).
A – C, BGN farging ble utført på parafininnstøpte vevssnitt. (A), Ta; (B), T2; (C), T4. (D), kvantitativ bildeanalyse av BGN i ikke-invasive svulster (Ta, T1) og muskel-invasiv tumor stadier (T2-T4). (E), korrelasjon av BGN positiv område brøkdel med svulst iscenesettelse. n = 5 pasient biopsi av hver tumor stadium, ***
p
0,0001, **
p
= 0,0025
antiproliferativ effekt av BGN i. menneskelige blærekreftceller
in vitro
resultatene fra human blærekreft prøver antydet at BGN uttrykk forbundet med tumorprogresjon. For å få mekanistiske innsikt, ble potensielle effekter av BGN på tumorceller fenotype undersøkt
in vitro
som beskrevet nedenfor. Først ble en immunoblot av utskilt BGN utføres fra kondisjonert medium av den humane blærecancercellelinje, J82 (figur 3A). Som påvist i den prøve av J82-celler uten kondroitinase ABC fordøyelse BGN proteoglykan ble sluppet i forholdsvis små mengder i gassmediet. I tillegg ble BGN kjerne-protein påvist i disse prøvene så vel. Som en kontroll for celler som utskiller store mengder BGN proteoglycan, ble immunoblot av kondisjonerte medium avledet fra humane koronare vaskulære glatte muskelceller inkludert (to baner til venstre). Immunoblotting avslørte videre at rekombinant BGN anvendt i de etterfølgende eksperimenter bestod hovedsakelig av kjerneprotein fordi båndene ikke var forskjøvet med kondroitinase ABC (figur 3A) og kjøre på en vanlig størrelse for den kjerneprotein. Deretter ble rekombinant biglycan kjerneprotein anvendes i en proliferasjonsanalyse (figur 3B). Tilsetningen av 0,26 til 26 nM BGN kjerne (0,01-1 ug /ml) forårsaket en doseavhengig inhibering av celleproliferasjon i J82-celler (Figur 3B). Til slutt, for å sette grunnlaget for en
in vivo
xenograft eksperimentere og å løse rollen som endogene BGN, lentiviral knock-down av BGN ble utført i menneske blærekreft cellelinje, J82. Viktigere, knock-down av BGN forårsaket økt spredning (shBGN 1,39 ± 0,06 ganger av kontroll,
p
0,05) som ble reversert ved tilsetting (2,6 nM) av eksogene BGN (0,83 ganger av kontroll ± 0,06) (figur 3C). Tilsetting av eksogene BGN til celler transduced med egge shRNA forårsaket en trend til redusert spredning. Deretter spredning ble bestemt etter overekspresjon av human BGN. Komplimentær til pro-proliferativ effekt etter BGN knock-down, BGN overekspresjon resulterte i signifikant reduksjon av DNA-syntese sammenlignet med tom vektorkontroll (oeBGN, 0,50 ± 0,06 ganger av kontroll; PCL-1, 1,0 ± 0,09 ganger så kontroll, Figur 3C).
(A) Immunoblotting av BGN renset fra kondisjonert medium av menneskelige J82 blære carcinoma celler og av rekombinant BGN plusminus kondroitinase ABC fordøyelsen. Som kontroll kondisjonert medium fra humane koronare vaskulære glatte muskelceller (CaSMC) ble anvendt fordi disse celler er kjent for å utskille store mengder BGN proteoglykan (venstre to baner). Kondroitinase ABC ble påført som ytterligere kontroll (høyre felt) (B) J82-celler ble inkubert i lavt serum (2%) med økende mengder av rekombinant BGN og celletallet ble bestemt ved FACS-analyse etter 7 dager; n = 3. Representative lys mikroskopiske bilder vises. (C) Menneskelig J82 celler ble enten lentivirally omformet til knock-down BGN uttrykk eller å overuttrykker human BGN. De respektive kontrollene var celler transduced med egge shRNA (SCR) eller tom vektor kontroll (PCL-1). I tillegg ble rekombinant BGN anvendt. Ni dager etter transduksjon, ble proliferasjon bestemt som gjenspeiles av DNA-syntese. Den BGN knock-down hadde en proliferativ effekt som ble reversert ved tilsetning av rekombinant BGN (2,6 nM = 100 ng /ml). Overekspresjon av BGN medførte redusert DNA syntese; n = 5, *
p
0,05.
Knock-down av BGN akselererer J82 xenograft vekst i nakne mus
J82 celler transduced med shRNA targeting BGN og egge shRNA ble xenopodet inn nu /nu hårløse mus for å undersøke effekten av BGN nedregule også
in vivo
. Måling av xenograft tumorvolum viste signifikant økning av tumorvekst i den BGN knock-down gruppe i forhold til kontrollgruppen behandlet med egge shRNA 49 dager etter injeksjon av cellene (dag 49, shBGN 374.7mm
2 ± 82,8 mm
2, egge shRNA 204,2 mm
2 ± 28,5 mm
2, n = 6,
p
0,001, figur 4). Tumorene var av fast utseende med ingen tegn på nekrose og bare en av de tumorer i shBGN gruppen var den infiltrerende omgivende vev (i dette tilfelle de nedre ribber). Ingen av tumorene i kontrollgruppen ble infiltrere det omgivende vev. Det var ingen synlig metastastic vekst av tumorceller i lunge og lever som bedømt ved histologi. Ved immunhistokjemisk analyse viste at BGN farging fremdeles er redusert i BGN knock-down gruppe (BGN positiv område fraksjon i shBGN gruppe 10,82 ± 2,3% og 25,25 ± 2,4% i egge shRNA kontrollgruppe) etter 7 uker (figur 5 A-C). Viktigere, i tråd med
in vitro
dataene vist i figur 3, ble spredning av kreftceller økte etter BGN knock-down som dokumentert av Ki67 farging sammenlignet med kontrollgruppen (Ki67 positive område brøkdel i shBGN gruppe 16,68 ± 2,1 % og 7,18 ± 1,2% i egge shRNA kontrollgruppen,
p
= 0,005, figur 5D-F). Tumor vaskularisering ble ikke påvirket som dokumentert av CD31 flekker (Figur 5G-I).
Etter knock-down av BGN i menneskelige J82 celler
i
vitro
de omsatte cellene ble injisert bilateralt inn i flankene av nakne mus og tumorvekst ble overvåket over en periode på 7 uker. Som et resultat av tumorvolumet var betydelig høyere etter påføring av J82-celler transdusert med shRNA målretting BGN sammenlignet med egge kontroll (375 mm
2 lignet med 204 mm
2); n = 6, ***
p
0,001.
xenografttumorer ble høstet etter 7 uker, og behandlet for farging og morfologisk analyse. BGN farging og bildeanalyse avdekket redusert BGN uttrykk i forhold til egge kontroll (A, B). Arealet fraksjon av BGN positiv farging var 25,3% i kontrollgruppen versus 10,8% i xenograft tumorer avledet fra shBGN celler, n = 6, **
p
= 0,0087 (C). Deretter ble den proliferative indeksen vurderes ved hjelp av Ki67 antigen. Sammenlignet med kontroll (D) prosentandelen av arealet fraksjon av Ki67-positive celler ble signifikant forhøyet i tumorer sammensatt av shBGN transduserte J82-celler (E, F, 7,2% vs. 16,7%, n = 6, **
p
= 0.005). (GI) gjennomsnittlig microvessel tetthet (MVD) som bestemmes av CD31 farging ble ikke berørt i xenografttumorer, n = 6.
Multi-reseptor tyrosinkinasehemmere indusere BGN
in vivo Hotell og
in vitro
dataene ovenfor sterkt antydet at BGN er en vekst inhibitor i menneskelige blæren kreftceller. Opptil dato ingen terapeutiske modulatorer av BGN uttrykk i kreft har blitt beskrevet. Derfor ble effekten av små molekyl-reseptor-tyrosin-kinase-inhibitorer på BGN uttrykk undersøkt. For dette formål multi-reseptor-tyrosinkinase-inhibitorer, sorafenib og sunitinib, ble anvendt ved konsentrasjoner som er kjent for å inhibere proliferasjon av cancerceller, inkludert blærekreft (J82)-celler [30-32]. Cellemorfologi ble ikke påvirket i løpet av 24 timer etter behandling med sorafenib og sunitinib. Av notatet, behandling med sorafenib (10 mm) og sunitinib (1 mm) resulterte i kraftig oppregulering av BGN mRNA uttrykk etter 24 timer (Figur 6A).
