Abstract
svulstens mikromiljø spiller en avgjørende rolle under svulst utvikling. Integrert kombinasjon av medisiner som er rettet mot svulsten mikromiljøet er en lovende tilnærming til kreftbehandling. Her rapporterer vi en multifunksjonell kombinasjon av lav-cytotoksiske legemidler består av dipyridamol, bestatin og deksametason (DBDx) som i hovedsak virker på svulsten mikromiljøet viser svært potent antitumor effekt
in vivo
. I mus hepatoma H22 modell, trippellegemiddelkombinasjonen viste synergistisk og svært potent antitumor effekt. Kombinasjonsindeksene for forskjellige kombinasjoner av trippel stoffene var mellom 0,2 og 0,5. DBDx hemmet veksten av et panel av humane tumorxenografter og viste ingen åpenbare systemiske toksisitet. Ved tolererte doser, DBDx undertrykkes veksten av humane leverkreft BEL-7402, HepG2, og lunge adenokarsinom A549-xenografter med 94,5%, 93,7% og 96,9%, respektivt. Klonogene analysen viste at DBDx viste svak cytotoksisitet. Western blot viste at Flk1 og Nos3 ble nedregulert i DBDx-behandlede gruppen. Proteomikk analyse viste at DBDx hovedsakelig påvirket den metabolske prosessen og immunsystemet prosess; i tillegg ble det angiogenese og VEGF signalveien også berørt. Sikkert, DBDx, et multifunksjonelt legemiddel kombinasjon av tre lave cytotoksiske legemidler, viser synergistisk og svært potent antitumor effekt tydeligvis mediert av modulering av svulsten mikromiljøet. Basert på dets lave cytotoksiske egenskaper og dens bredspektret antitumor terapeutisk virkning, kan denne multifunksjonelle kombinasjonen være anvendelige ved behandling av kreft, spesielt de som er motstandsdyktige overfor konvensjonelle kjemoterapeutika
relasjon:. Liu XJ, Zheng YB, Li Y, Wu SY, Zhen YS (2014) et multifunksjonelt legemiddelkombinasjonen Viser svært potent terapeutisk virkning mot kreft hos mennesker xenografter i atymiske Mus. PLoS ONE 9 (12): e115790. doi: 10,1371 /journal.pone.0115790
Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Senter for Bioteknologi, India
mottatt: 04.07.2014; Godkjent: 01.12.2014; Publisert: 22.12.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra «Betydelig utvikling nye legemidler» Major Science and Technology Projects of China (No. 2012ZX09301002, http: //www.nmp. gov.cn) og Natural Science Foundation National of China (No. 81201665, https://www.nsfc.gov.cn). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en kompleks sykdom som involverer endringer i tumorceller og tumormikromiljøet [1]. Som rapportert, svulstens mikromiljø endringer i forbindelse med svulst utvikling og fremmer tumorvekst og metastase [2], [3]. Bruk av legemidler som er rettet mot svulsten mikromiljøet gir en lovende strategi for kreftbehandling [4] – [5]. Kombinasjonen av legemidler som er rettet mot svulsten mikromiljøet har vist seg å være effektiv i behandling av kreft [6] – [8]. Her rapporterer vi en multifunksjonell legemiddelkombinasjon består av dipyridamol (DPM), bestatin (BEN) og deksametason (DEX) som i hovedsak er rettet mot svulsten mikromiljøet og den svært potent terapeutisk effekt.
Dipyridamole, en velkjent anti -thrombotic medikament, er en aktiv nukleosid transport inhibitor. Det kan forsterke antitumoraktivitet av mange antimetabolitter, for eksempel 5-fluorouracil og metotreksat [9]. Dipyridamole kan også svekke svulstens mikromiljø og forebygge brystkreft-kreft progresjon hos mus [10]. Bestatin (Ubenimex), en aminopeptidase-inhibitor, har vist diverse antitumor-aktivitet og immunmodulerende aktiviteter [11], [12]. Klinisk blir bestatin anvendes som en immunomodulator i kombinasjon med kjemoterapi eller radioterapi [13]. Bestatin kan hemme tumorcelle-proliferasjon og undertrykke tumor angiogenese [14], [15]. Deksametason er et mye brukt legemiddel av glukokortikoid steroider familie med potente anti-inflammatorisk og immunsuppressive effekter. I sykehus, er det ofte brukt til å behandle inflammatoriske og autoimmune sykdommer. I tumorbehandling, blir deksametason vanligvis brukt for å lindre bivirkningene ved kjemoterapi [16]. Det er rapporter om at deksametason kan også undertrykke tumor angiogenese [17], [18].
I denne studien har vi utviklet et integrert, multifunksjonell kombinasjon inkludert dipyridamol, bestatin og deksametason og undersøkt sin antitumor aktivitet, særlig dens terapeutiske effekten
in vivo
. Vår forskning viser at DBDx er en svært effektiv, bredspektret antitumor kombinasjon hovedsakelig rettet mot svulsten mikromiljøet.
Materialer og metoder
Material
Dipyridamole og deksametason ble hentet fra National Institutes for Food and Drug Control (Kina). Bestatin ble gitt av Apeloa Kangyu (Kina). For dobbel eller trippel kombinasjoner forberedelse, ble agentene blandet i henhold til de angitte doser i saltvann, deretter bakken og homogenisert ved hjelp av en morter. Gemcitabin (Gemzar) ble kjøpt fra Lilly, Frankrike. Gefitinib (Iressa) var fra Astrazeneca. 5-FU var fra Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co., Ltd. Alle kjemikalier og biokjemiske agenter som ble brukt var av analytisk kvalitet.
Cell kultur
Menneskelig leverkreft BEL-7402 celler ble hentet fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences. Menneskeleverkreft HepG2 celler ble kjøpt fra ATCC. Menneske lunge adenokarsinom A549 celler og menneske epidermoid carcinoma A431 celler ble hentet fra Celle Center of Institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College. Menneskelige lungekjempecellekreft PG celler ble hentet fra Avdeling for patologi, Peking University Health Science Center. Alle disse cellelinjene ble oppbevart i vårt laboratorium og dyrket ved 37 ° C i RPMI-1640-medium (Gibco BRL Inc.) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Gibco BRL Inc.), 2 mM glutamin, 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2.
in vivo behandlingsstudie
Alle Kunming mus og NIH (nu /nu) atymiske mus ble kjøpt fra Vital River Laboratories (Beijing, Kina).
I mus hepatoma 22 (H22) modell, kvinnelige Kunming mus (18-22 g) ble tilfeldig fordelt med 10 mus i hver gruppe. På dag 0, ble murin lever-22-celler fra ascites av tumor-bærende mus transplantert subkutant inn i høyre armhule region med 1,5 x 10
6 celler /mus. Fra dag 3 til dag 12, ble tumorbærende mus behandlet oralt med saltvann, enkle midler, dobbel eller trippel kombinasjoner, henholdsvis. 5-FU ble administrert med samme timeplan men gitt intraperitonealt. Ved dag 14 alle musene ble avlivet. Tumorvekter ble målt og inhiberingsgraden av tumorvekst ble beregnet. Kombinasjon indeks (CI) ble analysert i henhold til Chou og Talalay metode [19].
I hepatoma BEL-7402 xenograft modell, menneskelever BEL-7402 celler (1 x 10
7) suspendert i 200 mL saltvann ble inokulert subkutant (sc) i den høyre armhulen kvinnelige NIH
(nu /nu)
atymiske mus (18-22 g). Etter tre wk, ble svulstene dissekert og biter av svulstvev (2 mm
3 i størrelse) ble transplantert subkutant av en troakar inn atymiske mus. Når tumorstørrelse nådde ca 100 mm
3 (dag 7), mus ble delt med 6 mus per gruppe og behandlet oralt med saltvann eller legemiddelkombinasjoner på ulike doser henholdsvis én gang daglig, 5 dager i uken i 2 uker . Tumorstørrelse og kroppsvekt ble målt hver 3-4 dager. Tumor volum ble beregnet med formelen: V = ab
2/2, der
en
representerer lengde diameter og
b
vinkelrett diameter. Inhiberingsgraden av tumorvekst ble beregnet i henhold til tumorvolumet.
For hepatoma HepG2 xenograft modell, lungekarsinom A549 xenograft modell, lungecarcinom PG xenograft modell og epidermoid karsinom A431 xenograft modell, ble inokulert tumorer i atymiske mus som beskrevet i BEL-7402 modell. Tidsplaner av Drug Administration ble beskrevet i resultatene.
klonogene analysen
BEL-7402 celler av eksponensiell vekst ble sådd på 50 celler per brønn i 96-brønners plater og dyrket i 24 timer ved 37 ° C. Deretter forskjellige konsentrasjoner av legemidler ble tilsatt i triplikat og cellene ble dyrket i ytterligere 7 dager. Kolonier av mer enn 50 celler ble tellet. Overlevelses fraksjonene ble beregnet etter følgende formel: overlevelse fraksjon (%) = tellinger av testbrønner /tellinger av kontroll vel × 100%
Akutt toksisitet test
Kunming mus (18-. 22 g, halv hann og hunn halv) ble tilfeldig delt inn i 4 grupper med 20 mus i hver gruppe. DBDx (forholdet mellom dipyridamol, bestatin, og deksametason var 100, 20 og 1) ble gitt oralt i en enkelt dose på 0, 1,28, 1,6 og 2 g /kg, henholdsvis. Kroppsvekt av mus, nevrologiske respons og atferd unormalt ble nøye overvåket i 14 dager.
Western blot analyse
I H22 modell, 3 dager etter tumor implantering, DBDx på 242 mg /kg ble gitt oralt, en gang daglig i 10 dager. På dag 14, ble tumorvevet isolert, 5 vevsprøver ble tatt fra hver gruppe. De tumorvev ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 100 mikrogram /ml fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 ug /ml aprotinin , pH 8,0) og homogenisert med en håndholdt homogenisator. Lysatene ble sentrifugert ved 12 000 rpm i 10 min og supernatantene inneholdende protein ble kvantifisert ved anvendelse av en BCA proteinanalysesett (Pierce).
proteinprøver ble underkastet elektroforese på 10% SDS-PAGE, og overført til PVDF membran. Etter blokkert med 1% BSA, ble membranen inkubert med primært antistoff (Santa Cruz) og HRP-konjugert sekundært antistoff (Zhongshan Inc.), sekvensielt. Den immunoreactive Bandet ble visualisert ved hjelp av Western blot luminalen reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), og bildet ble tatt ved hjelp av bildeanalyse system (AIO Inc.).
Prøvepreparering for todimensjonal differensial gelelektroforese
BALB /c atymiske mus som bærer BEL-7402 xenotransplantater ble delt i to grupper, 5 mus i hver gruppe. Én gruppe mus ble behandlet med 242 mg /kg DBDx, en gang om dagen i 10 dager; en annen gruppe av mus ble administrert med saltløsning som kontroll. Neste dag etter siste administrasjon mus ble ofret. Tumorvev ble oppsamlet og hurtigfrosset med flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil behandling.
Protein prøvepreparering, to-dimensjonal elektroforese (2-DE) og massespektrometri (MS) ble utført ved Beijing Protein Innovasjon.
Proteinprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble utarbeidet med trikloreddiksyre (TCA) aceton nedbør metode. I korthet, omtrent 50 mg av tumorvev frosset i flytende nitrogen som tidligere ble knust med en metall morter, og ble deretter suspendert med 10% TCA i aceton inneholdende 1 mM PMSF, 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og 10 mM ditiotreitol (DTT) for 2 timer. Etter sentrifugering ble det utfelte protein ble vasket med foravkjølt aceton. Pelleten ble løst i lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 M urea, 4% 3 – [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] – 1-propansulfonat (CHAPS), 0,5% Pharma (pH 3-10L ), 10 mM DTT, 1 mM PMSF og 2 mM EDTA. Lysatet ble lydbehandlet i 5 min, fulgt av sentrifugering ved 40 000 g i 15 min. Supernatanten protein ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-metoden. De «blandede protein bassenger» ble fremstilt ved å blande like mengder protein fra 5 tumorprøver av samme gruppe for to-DE.
2-DE og bildeanalyse
«mixed proteinprøver «(200 ug) ble blandet med rehydrering buffer og applisert på en 18 cm lineær IPG strimler, pH 3-10 (Amersham Biosciences, Sverige) .Deretter båndene ble underkastet isoelektrisk fokusering i IPGphor (Amersham Biosciences, Sverige). Den fokuserte strimler ble deretter redusert med 1% DTT og alkylert med 2,5% jodacetamid (IAM) i ekvilibrert buffer (6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS, og 50 mM Tris-HCl, pH 8,8). De behandlede strimler ble overført til 12% SDS-PAGE i Ettan DALT II System (Amersham Biosciences, Sverige) for sekundær elektroforese. De analytiske Gelene ble farget med sølvfarging uten tilsetning av glutaraldehyd. De fargede geler ble skannet med en Imagescanner (Amersham Biosciences, Sverige), og bildene ble analysert ved hjelp ImageMaster 2-D Platinum versjon 3.0 (Amersham Biosciences, Sverige).
MS og protein identifikasjon
differensial~~POS=TRUNC uttrykk flekker ble fjernet fra gels og plassert i Eppendorf-rør. Gelstykkene ble redusert med 10 mM DTT og alkylert med 55 mM IAM. Deretter ble gelene sekvensielt ekvilibrert med 25 mM ammoniumbikarbonat, 50% acetonitril (ACN) 25 mM ammoniumbikarbonat og 100% ACN i 10 minutter, etterfulgt uttørket i en vakuumsentrifuge i 10 minutter. De tørkede geler ble rehydratisert i fordøyelse oppløsning (0,01 mg /ml trypsin oppløst i 25 mM ammoniumbikarbonat) på is i 30 min, og inkubert i 25 mM ammoniumbikarbonat (10-15 pl) over natten ved 37 ° C. Fordøyelsen ble stanset ved bruk av 0,1% trifluoreddiksyre (TFA). Det fordøyde Peptidene ble flekket på målet (AnchorChip ™, Bruker, Tyskland) og ko-krystallisert med α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA, 4 mg /ml i 70% ACN og 0,1% TFA). Deretter tørket matriser ble analysert ved en Ultraflex MALDI-TOF /TOFII MS (Bruker, Tyskland) operert i reflektoren modus i m /z utvalg 600-4 000. Kalibrering for PMF (peptid mass fingerprinting) prøvene ble utført eksternt med en blanding av standard-peptider og internt ved hjelp av peptidfragmenter av trypsin autolyse-produkter. Ifølge PMF signaler, ble de tre beste høyeste peptider med høyere nøyaktighet og høyere overflod videre analysert i MS /MS-modus. PMFS ble analysert med MASCOT (Matrix Science, GB) mot NCBInr database. En masse nøyaktighet toleranse ble tillatt innenfor 100 ppm. Protein identifikasjoner ble utført basert på sannsynlighetsbaserte Mowse scoring algoritmen med et konfidensnivå på 95% .Deretter de identifiserte proteiner ble analysert ved hjelp PANTHER (Protein analyse gjennom evolusjonære relasjoner) klassifiseringssystem (www.pantherdb.org) sikret system er designet for å klassifisere proteiner (og deres gener) og kategoriserer dem i henhold til familie og underfamilien, molekylær funksjon, biologiske prosesser, og veier.
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble godkjent av etikkomiteen for Animal eksperimenter ved institutt for Medisinsk bioteknologi, Chinese Academy of Medical Sciences (IMBF20060302). Studien protokollene i samsvar med anbefalingene i forskrift for forvaltning av forsøksdyr i departementet for vitenskap og teknologi i Kina.
Resultater
Triple kombinasjoner viste bedre og synergistisk antitumor effekt
Den antitumor effekt av trippelkombinasjoner bestående av DPM, BEN og DEX ble først sammenlignet med den enkle midler eller doble kombinasjoner i mus hepatom H22 modell. Etter 3 dager med svulst implantasjon (tumor volum: 250 ± 30 mm
3), ble medikamenter gitt oralt en gang daglig i 10 dager. På dag 14 ble musene avlivet og tumorvekten ble målt. Ved de angitte doser i tabell 1, inhiberingsgraden av respektive enkeltstoffer varierte fra 22,8% til 68,6%. For de doble kombinasjoner, de hemming prisene var fra 58,7% til 66,3%. CI verdier av doble kombinasjoner var 0,8-1, indikerte additiv eller litt synergieffekter. For trippelkombinasjoner, ble 3 x 3 grupper av kombinasjoner undersøkt som vist i tabell 1. Når tre medikamenter kombinert sammen, inhiberingsgraden klatret opp til 79,2% -89,4%, noe som var statistisk forskjellig fra det aktuelle enkle midler eller dobbelts kombinasjoner . CI verdier av alle trippelkombinasjoner var mellom 0,2 og 0,5, indikerte synergistisk antitumor effekt. For å lette stoffet kombinasjonsstudie, dosen forholdet mellom DPM, BEN og DEX ble festet til 100:20:1 (masse) og heter DBDx.
DBDx viste svært potent antitumor aktivitet mot humane tumorxenotransplantater
Den antitumor effekt av DBDx ble videre undersøkt i menneskelige leverkreft BEL-7402 xenograft modell. Etter 7 dager etter tumor-implantering, ble forskjellige doser av DBDx gitt oralt, en gang daglig i 10 dager. Saltvann ble gitt til musene i kontrollgruppen. På dag 17, DBDx ved 121, 242 og 363 mg /kg inhiberte tumorvekst med 73,0%, 88,1% og 94,5% evalueres av tumorvolum henholdsvis statistisk signifikant forskjellig fra den for kontrollgruppen (P . 0,01, Fig 1 .EN). Spesielt, etter disseksjon, ble det funnet at den implanterte tumor forsvant i 2 av 8 mus (fig. 1.B) .De tumorvekt ble vist i fig. 1.b. Under forsøkene kroppsvekttapet for de behandlede mus var mindre enn 10% sammenlignet med kroppsvekt ved starten av eksperimentet (fig. 1.C). I et annet uavhengig eksperiment ble administrert medikamenter som ovenfor, etter 10 dagers behandling på langtidsantitumor-virkningene av DBDx ble evaluert. På dag 60, nemlig 44 dager etter siste behandling, DBDx ved 242, 363 og 484 mg /kg inhiberte tumorvekst med 56,4%, 71,9% og 69,2% evalueres av tumorvolum, henholdsvis (fig. 1.d), som var konsistent med de tumor vektdata (fig. 1. E). Kroppsvekt av behandlede grupper viste liten nedgang (10%) i løpet av behandlingen, mens økt ved slutten av forsøkene, noe som indikerer at den administrerte doser ble godt tolerert (fig. 1.F).
A. DBDx hemmet tumorvekst i en doseavhengig måte. B. På dag 17 ble musene avlivet. Svulster ble fotografert og tumorvekt ble målt. C. Kroppsvektene til mus i løpet av de 17 dagers eksperiment. D. På lang sikt eksperimentet ved dag 60, nemlig 44 dager etter den siste behandling, DBDx fortsatt kunne hemme tumorvekst. E. Ved slutten av forsøkene, ble musene avlivet og tumorvekt ble målt. F. dyrekroppsvekt i alle grupper i løpet av 60 dagers eksperiment. (Dose: mg /kg). Statistisk signifikans ble bestemt av t-test; ** P . 0,01 sammenlignet med kontroll
I tillegg ble anti-tumor effekten av DBDx evaluert med andre humane krefttransplantater, inkludert human leverkreft HepG2 og lunge adenokarsinom A549. Legemidler ble administrert oralt en gang daglig, 5 dager i uken i 3 uker (7-11 dager, 14-18 d, 21-25 d). I HepG2-modell, på dag 28, DBDx ved 121, 242 og 484 mg /kg inhiberte tumorvekst med 61,9%, 72,3% og 93,7% evalueres av tumorvolum, henholdsvis (fig. 2 A). I mellomtiden, 5-FU ved 15 mg /kg inhiberte tumorvekst med 42%. Tumorvekter av alle grupper var vist på fig. 2.c. I A549-modellen, på dag 28, DBDx ved 121, 242 og 484 mg /kg inhiberte tumorvekst med 89,5%, 94,9% og 96,9% evalueres av tumorvolum, henholdsvis (fig. 2.B). Tumorvekt ble vist i fig. 2.d. Tydeligvis, behandlede dyr tolereres godt til alle ovennevnte doser av DBDx. Som vist på fig. 2.E og F, ved slutten av eksperimentet, oppsto ingen dødsfall, og kroppsvekten tapet var mindre enn 10% i alle behandlede mus i forskjellige doseringsgrupper, noe som indikerer at de behandlede dyrene tolererte godt med de administrerte doser av DBDx.
A, C og E. tumor~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP kurve, tumorvekt ved slutten av eksperimentet og kroppsvekt hos mus i alle grupper i HepG2 xenograft modell. B, D og F. Tumorvekst kurve, tumorvekt ved slutten av eksperimentet og kroppsvekt hos mus i alle grupper i A549 xenograft modell. (Dose: mg /kg). Statistisk signifikans ble bestemt av t-test; ** P 0,01 sammenlignet med kontroll
Sammenligning av antitumor effekt av DBDx med andre cytostatika
Den antitumor effekt av DBDx ble videre sammenlignet med gemcitabin (GEM) og gefitinib.. Slik det er velkjent, GEM, en antimetabolitt medikament, er ofte brukt i klinikker for behandling av lungekreft, kreft i bukspyttkjertelen, etc. I human lungekarsinom PG xenograft modell, ble antitumoraktivitet av DBDx sammenlignet med den til GEM. Syv dager etter tumor-implantering, ble DBDx gitt oralt, en gang daglig i 10 dager. GEM ble gitt ip på dag 7, 10 og 13, totalt tre doser. Som evaluert med tumorvolumet på dag 17, GEM inhiberte tumorvekst med 65,2%, mens DBDx inhiberte tumorvekst med 82,6% som var signifikant forskjellig fra den for GEM (P 0,05, Fig 3.a.). På dag 35, DBDx fortsatt utøves hemming av tumorvekst med 57,1%.
A. DBDX viste sterkere antitumor aktivitet enn GEM i PG xenograft modell. B. DBDX viste lignende antitumor aktivitet med gefitinib i A431 xenograft modell. C. Kroppsvektene til PG-xenograft-bærende mus i løpet av behandlingen. D. Kroppsvektene til A431-xenograft-bærende mus i løpet av behandlingen. (Dose: mg /kg).
Gefitinib er en EGFR tyrosin kinase inhibitor. For sammenlignende studie ble effekten av DBDx og gefitinib evaluert med det menneskelige epidermoid carcinoma A431 xenograft modell der EGFR er sterkt uttrykt. DBDx og gefitinib ble henholdsvis gitt oralt en gang daglig i 10 dager. Som vist på fig. 3B, DBDx viste lignende antitumor aktivitet med gefitinib. På dag 17, inhiberingshastigheten for DBDx ved 242 mg /kg var 84,3%, mens gefitinib ved 100 mg /kg inhiberte tumorvekst med 84,8%, respektivt.
Både i PG og A431-modeller, kroppsvekten tap av behandlede grupper var mindre enn 11%, og kroppsvekten hos behandlede mus i alle grupper økes ved slutten av forsøket, noe som indikerer at de behandlede dyrene tolererte godt med administrerte doser av DBDx og gefitinib (fig. 3.C, D )
Toxicopathological undersøkelse
i HepG2 xenograft modell beskrevet ovenfor, på dag 28, DBDx på 242 mg /kg hemmet tumorvekst med 72,3%, histopatologisk undersøkelse (seksjoner farget med H E) viste ingen tegn på toksikologiske skader i lever, nyre, mage, tynntarm, benmarg, lunge, hjerte og milt (fig. 4).
Histopatologisk undersøkelse i HepG2 xenograft-bærende mus av kontroll og gruppen behandlet med DBDx. Ingen patologiske forandringer ble funnet i lever, nyre, mage, tarm, benmarg, lunge, hjerte og milt i DBDx-behandlede dyr (H E). (X 200).
H22 modell, tumor-bærende Kunming mus ble behandlet med DBDx ved 242 mg /kg, en gang daglig i 10 dager. Etter 24 timer etter siste administrering ble histologiske snitt av benmarg undersøkt. Tellinger av de kjerneinneholdende cellene og megakaryocytter i benmargen, viste ingen forskjell mellom normale mus, tumorbærende mus behandlet med saltvann eller DBDx (tabell 2).
Den akutte toksisitet av DBDx (per os) ble undersøkt hos friske Kunming mus. Ved slutten av forsøket ble det ikke observert noen dyredødsfall, og dyrets kroppsvekt øket til 28-38 g, selv når dosen av DBDx gikk opp til 2 000 mg /kg, viser en god sikkerhets
in vivo
. Fur endring og atferd unormalt ble ikke observert.
In vitro cytotoksisitet analyse av DBDx til dyrkede tumorceller
Den cytotoksisitet av DBDx og enkle midler ble evaluert in vitro ved hjelp klonogene analysen. Bestatin og deksametason viste svak cytotoksisitet til dyrkede BEL-7402 celler. IC
50 verdier av dem var over 100 mikrogram /ml. For dipyridamol og DBDx, IC
50 verdier ble 13,34 ± 0,65 og 17,48 ± 0,59 mg /ml, henholdsvis.
Antitumor mekanisme studier av DBDx
Endringene av protein uttrykk i transplantert hepatoma 22 etter DBDx behandling ble undersøkt. Vi har analysert en rekke vekstfaktorer, inkludert epidermal vekstfaktor (EGF), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) og fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2); vekstfaktorreseptorer så som EGFR (EGF-reseptor), Flk1 (VEGF reseptor 2); proteiner relatert til tumor celle overlevelse og apoptose som Bcl-2 og Survivin; og noen andre proteiner slik som Nos3. Som et resultat, ble to proteiner Flk1 og Nos3 funnet å bli nedregulert i DBDX-behandlede gruppe (fig. 5).
Fem tumor vevsprøver tatt fra hver gruppe av hepatoma 22 (H22) transplantert Kunming mus ble brukt.
Neste, den globale protein forskjellen mellom saltvann kontroll og DBDx-behandlede grupper ble sammenlignet med 2-dE og MS. Tumorvev fra menneskelig hepatokarsinom BEL-7402 xenograft i atymiske mus ble brukt. Om lag 700 protein spots ble vist per gel. Fig. 6 viste representative proteinprofilen oppnådd fra 2-DE. Statistisk analyse av den normaliserte volumet av passet flekker viste 33 protein flekker hvis intensitet viste 3-gangers forskjell mellom saltvann og DBDX-behandlede grupper. Fra disse protein flekker ble 17 differensielt uttrykte proteiner identifisert (tabell 3). Blant disse identifikasjoner, 12 var unik i to grupper, 4 nedregulert og en oppregulert i DBDx-behandlede gruppen. Annen relevant informasjon i Tabell 3 inkludert NCBI deponeringsnummer, brett endret, maskot score, teoretisk og eksperimentell molekylvekt, teoretisk og eksperimentell pI og sekvensdekning.
Etter separasjon på 17 cm, pH 3-10 lineær strimler i første dimensjon og på en 12% SDS-PAGE i andre dimensjon, ble proteiner farget med sølv. A. Saline-behandlede gruppen. B. DBDx-behandlede gruppen. Protein flekker merket på kartene ble fjernet fra de gels og sekvensielt identifisert ved MS.
Så disse identifiserte proteiner ble kategorisert i henhold til biologisk prosess og signalveien ved hjelp PANTHER klassifiseringssystemet. Analyse av den biologiske prosessen viste at stoffskiftet (40,6%) og immunsystemet prosess (12,5%) var hovedsakelig påvirket av DBDx behandling. Andre biologiske prosessen påvirkes av DBDx inkludert cellekommunikasjon, cellulær prosess, respons på stimuli, system prosess, transport og apoptose og generering av forløper metabolitter og energi (Fig. 7A). Analyse av mobiltelefonsignalveier viste at angiogenese, VEGF signalveien og glykolyse omfattet 42,9% av signalveier som er berørt av DBDx behandling (Fig. 7B). Andre berørte veier inkludert apoptose signalveien, endotelin signalveien, Huntingtons sykdom, interleukin signalveien, PI3 kinase vei, Parkinsons sykdom, pyruvat metabolisme, og p38 MAPK veien.
Diskusjoner
medikamentkombinasjoner er mye brukt i kreftbehandling i over et halvt århundre. Det er en rasjonell og effektiv strategi for å øke terapeutisk effekt, mens redusere toksisitet og overvinne motstand. I denne studien, foreslo vi en svulst mikroorientert, multifunksjonelle legemiddelkombinasjonen strategi som tar sikte på en svært potent terapeutisk effekt
in vivo
. En trippel legemiddelkombinasjonen som består dipyridamol, bestatin og deksametason ble designet og dens terapeutiske effekten har blitt bekreftet. DBDx, trippellegemiddelkombinasjonen, er unik for bestående andre enn konvensjonelle kjemoterapeutika lavt cytotoksiske midler og for å oppnå den bemerkelsesverdige terapeutisk effekt på godt tolerert dosenivåer. Generelt undersøkelse av terapeutisk effekt
in vivo
med eksperimentelle tumorsystemer, spesielt humane krefttransplantater i atymiske mus, er av særlig betydning for vurderingen av cytostatika. Som vist, er DBDx meget effektivt mot vekst av humant leverkreft BEL-7402 xenograft. Foruten å redusere tumor størrelse markert, DBDx behandling selv forårsaket implanterte svulsten helt forsvunnet i to av åtte mus.
Spesielt vises DBDx et bredspektret antitumor aktivitet. Når dosen av DBDX nådde 484 mg /kg, en tålelig dosering, inhiberingsgraden var opp til 90% i alle de testede xenograft-modeller, inkludert human leverkreft HepG2, lunge adenokarsinom A549, lunge kjempecellekreft PG, og epidermoid karsinom A431 xenografter. Den bredspektret antitumoraktivitet innebærer at DBDx kan opptre i hovedsak via moduler svulsten mikromiljøet; Følgelig er det forholdsvis uavhengig av tumortypen. Videre
For medikamentkombinasjoner, er ikke bare avhengig av dose intensitet, men også på kombinasjonen av 3 medikamenter med ulike virkningsmekanismer kan også gi multi-modal dekning av et bredt spekter av svulster.
Den terapeutiske aktivitet doseforhold av de kombinerte komponenter. Noen forhold av kombinert medikamenter kan være synergistisk, mens andre forhold av de samme midler kan være additiv eller antagonistisk [20]. I alle våre testede kombinasjoner, de tre agentene handlet synergi (KI: 0,2-0,5). Som kjent, kan synergistisk kombinasjon øke den terapeutiske effektiviteten ved tolererte doser og forsinke utvikling av medikamentresistens [21]. Det er av interesse at de tre agenter DBDx kombinasjonen er ikke konvensjonelle cytotoksiske kjemoterapeutika; I motsetning til de hovedsakelig påvirker tumor-mikromiljøet. Derfor kan denne multifunksjonelle legemiddelkombinasjonen kunne redusere fremveksten av resistens.
Selv om DBDx viser svært potent antitumor effekt
in vivo
, klonogene analysen viser at denne kombinasjonen ikke viser potent cytotoksisitet
in vitro
. Det indikerer at hemming av tumorvekst ved DBDx
in vivo
ikke først og fremst stole på avliving av tumorceller direkte; I motsetning til dette kan DBDx utøver sin antitumoraktivitet hovedsakelig gjennom forstyrrer svulsten mikromiljøet. Som rapportert, er dipyridamol en aktiv hemmer av nukleosid transport. Bestatin kan målrette til aminopeptidase N og hemme tumor angiogenese [15]. Deksametason kan også undertrykke angiogenese [17]. Våre mekanistiske undersøkelser vist at DBDx ned-regulert ekspresjon av Flk1, en reseptor for VEGF, og NOS3, som kan regulere vaskulær funksjon [22]. Dessuten opptrer på tumor angiogenese, DBDx også påvirker immunsystemet og betennelse. Som rapportert, spiller betennelse en viktig rolle i tumorigenese og fremgang [23], [24]. Bestatin er et mye brukt immunomodulator mot tumor. Deksametason er en anti-inflammatorisk medikament. En fersk rapport viser at dipyridamol reduserer immuncelleinfiltrasjon og serum inflammatoriske cytokiner nivåer i mus [9] betraktelig. Effektene av DBDx på tumormikromiljøet ble ytterligere bevist av to-DE og følge PANTHER analyse. Klassifisering av ulikt uttrykte proteiner av de cellulære signalveier avslørte at DBDx påvirket hovedsakelig angiogenese og VEGF signalveien. Analyse av den biologiske prosess har vist at immunsystemet prosess ble påvirket.
