Abstract
Mål
vi undersøke den prognostiske rollen forbehandling forholdet mellom Type 1 (M1) og type 2 (M2) tumor-assosiert makrofager (TAM) i lokalavansert livmorhals kreft (LACC) pasienter behandlet med chemoradiation (CT /RT).
Metoder
84 sammenhengende LACC pasienter behandlet med cisplatin-basert CT /RT for en total dose på 50,0 Gy, etterfulgt av radikal kirurgi ble analysert. Dobbelt farging immunhistokjemi av CD163 /p-STAT, CD68 /pSTAT1, CD163 /c-MAF, og CD68 /c-MAF ble utført på kreftprøver tatt ved diagnosetidspunktet. TAMs med CD163 + pSTAT1 +, eller CD68 + pSTAT1 + ble definert M1; CD163 + c-MAF + eller CD68 + c-MAF + definert M2 fenotype. Antallet M1 og M2-celler ble tellet ved lav forstørrelse ved å evaluere for hvert tilfelle den samme tumorområdet. Forholdet mellom M1 og M2 (M1 /M2) ble endelig beregnet.
Resultater
På diagnose, observerte vi en direkte sammenheng mellom antall sirkulerende monocytter og TAMs (p-verdi = 0,001). Pasienter med høy M1 /M2 opplevde oftere komplett patologisk respons (ingen resttumor) til CT /RT, sammenlignet med tilfeller med lav M1 /M2 (55,0% vs 29,5%, p-verdi = 0,029). Ved multivariat analyse M1 /M2 (OR = 2,067, p-verdi = 0,037) dukket opp som selvstendig prediktor for patologisk respons på CT /RT. Kvinner med høy M1 /M2 viste en lengre fem-yrs Sykdomsfri (67,2% vs 44,3%, p-verdi = 0,019), og 5-år Totalt (69,3% vs 46,9%, p-verdi = 0,037) overlevelse sammenlignet med tilfeller med lav M1 /M2. Tilstedeværelsen av en høy M1 /M2-forholdet ble uavhengig assosiert med en ugunstig overlevelse i multivariat analyse.
Konklusjoner
polarisering av TAMs mot en M2 fenotype, som gjenspeiles av en lavere M1 /M2 ratio, er en uavhengig prediktor for dårlig respons på CT /RT, og kortere overlevelse i LACC
Citation. Petrillo M, Zannoni GF, Martinelli E, Pedone Anchora L, Ferrandina G, Tropeano G, et al. (2015) Polarisering av Tumor-Associated Makrofager mot M2 Phenotype korrelerer med dårlig respons på Chemoradiation og Redusert overlevelse hos pasienter med lokalavansert livmorhalskreft. PLoS ONE 10 (9): e0136654. doi: 10,1371 /journal.pone.0136654
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, ITALIA
mottatt: 03.12.2014; Godkjent: 06.08.2015; Publisert: 3. september 2015
Copyright: © 2015 Petrillo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for de relevante prestasjoner innen primær- og sekundærforebygging, fortsatt representerer livmorhalskreft den nest vanligste kreftformen hos unge kvinner [1]. Videre, selv i utviklede land, var andelen pasienter med lokalavansert sykdom holdt seg stabilt de siste ti årene [2]. Fra et terapeutisk synspunkt, har eksklusive samtidig chemoradiation (CT /RT) er anerkjent som standard behandling for pasienter med lokalavansert livmorhalskreft (LACC) [3-8]. På den annen side har andre utprøvning som anvender strategier for gjennomføring kirurgi etter kjemoterapi eller CT /RT også blitt undersøkt med det formål å forbedre overlevelse [9-12]. Men uavhengig av behandlingsstrategi vedtatt, ca 30% av kvinner med LACC tilbakefall og dø av sykdommen.
Av disse grunner, gitt den høye variasjon i uttrykket for å overleve utfall og svar på CT /RT, det er en økende etterspørsel av pålitelige prognostiske markører i stand til å hjelpe klinikere i å utvikle mer skreddersydde terapeutiske tilnærminger.
i denne sammenheng en økt forbehandling sirkulerende monocytter teller er nylig blitt anerkjent som en prediktor for dårlig prognose hos pasienter med plateepitelkarsinom LACC [13]. Disse funnene sterkt at relevant rolle i livmorhalskreft progresjon av rekruttering og differensiering av sirkulerende monocytter til tumorassosierte makrofager (TAM). Videre er det vel kjent at TAMs er en svært kompleks populasjon består av to fenotyper, hver og en med spesifikke funksjoner i svulsten mikromiljøet [14]. Når aktivert av interferon-γ (IFN-γ) eller tumornekrosefaktor α (TNF-alfa), Type 1 (M1) TAMs fremme den inflammatoriske immunresponser ved å øke antigenpresentasjon kapasitet og indusere Th1 immunitet ved produksjonen av cytokiner så som IL12 [ ,,,0],15]. På den andre produksjonen av type 2 (M2) TAMs av TGFfi, PGE2 og immunsuppressive cytokiner IL-10 bidrar til en generell undertrykkelse av antitumor aktiviteter [16,17]. Til tross for disse interessante biologiske bevis, (M2) TAMs hos kvinner med LACC forblir klinisk rolle type 1 (M1), og type 2 som skal etableres. Av disse grunner, her undersøker vi prognostisk rolle M1 og M2 TAMs i en stor serie av LACC pasienter sendt til CT /RT etterfulgt av radikal kirurgi.
Pasienter og metoder
Pasienter og behandling
Mellom mars 2009 og juni 2011, 84 kvinner med LACC har vært innlagt (at) til gynekologisk onkologi Enheter av det katolske universitetet i Roma. De klinisk-patologisk karakteristikk av studiepopulasjonen er oppsummert i tabell 1. Alle pasienter inkludert i studien viste: biopsi-påvist karsinom i cervix (stadium IIB-IVA), ingen tegn på sykdom utenfor bekkenet, Eastern Cooperative Oncology Group performance status 2, tilstrekkelig nyre- og leverfunksjon, ingen tidligere kreft enn basalcellekarsinom. Alle pasienter inngått en skriftlig informert samtykke godta å bli sendt til alle de beskrevne prosedyrer, og for deres kliniske data som skal prospektivt samlet og analysert for vitenskapelig formål. Studien fikk godkjenning av Etisk komité for Catholic University of the Sacred Heart. Forbehandling opparbeidelse inkludert samling av medisinsk historie, klinisk undersøkelse, brystet røntgen, abdominopelvic magnetic resonance imaging (MRI), komplett blodprosent og måling av lever og nyrefunksjon, cystoskopi og proctoscopy ved klinisk mistanke om blære og /eller endetarm invasjon. Resultatene av monocytt blodtelling utføres på tidspunktet for forbehandlingen opparbeidelse ble hentet og analysert i den foreliggende undersøkelse. Neoadjuvant CT /RT ble administrert som følger: Hele stråling av bekkenet i 25 fraksjoner (2,0 Gy /dag, i 1-2 uker, 5-6, 9, totalt 50 Gy) i kombinasjon med cisplatin (20 mg /m
2 , 2-h intravenøs infusjon) og 5-fluorouracil (1000 mg /m
2, 24-timers kontinuerlig intravenøs infusjon), både på dagene 1-4, hver 4. uke, til 3 sykluser [18]. Alle saker ble oversendt sju /åtte uker etter avsluttet samtidig CT /RT til radikal hysterektomi og bekken ± aortic lymphadenectomy. Etter operasjonen ble pasientene sendt til rutinemessig oppfølging prosedyrer. Patologisk respons på CT /RT ble definert: fullstendig i fravær av noen resttumor etter behandling (PR0), mikroskopisk (pR1) i nærvær av bare mikroskopisk tumor foci (≤ 3 mm maksimal dimensjon), og makroskopiske (pR2) når vi observerte utholdenhet av resttumor . 3 mm i maksimal dimensjon [19]
Immunhistokjemisk Vurdering av TAMs
Som nylig publisert, vi brukte uttrykket av pSTAT1, og c-MAF i sammenheng med CD68 eller CD163 å karakterisere
in situ
polarisering av TAMs [20]. Spesielt ble M1 fenotype definert som samtidig ekspresjon av pSTAT og CD68, eller pSTAT og CD163; mens TAMs med M2 fenotype ble identifisert ved hjelp av en kombinasjon av c-MAF og CD68, eller c-MAF og CD163 [20].
Double farging immunhistokjemi av CD163 /pSTAT1, CD68 /pSTAT, CD163 /c-MAF , CD68 /c-MAF ble utført på formalinfiksert, parafin Embedded (FFPE) livmorhalskreft prøver tatt ved diagnosetidspunktet, før starten av CT /RT. Tre um paraffin vevssnitt montert på poly-L-lysin-belagte objektglass og tørket ved 37 ° C natten over ble anvendt. Snittene ble tatt skjema FFPE- områder viser en homogen og store utbredelsen av kreft vev som dekker nesten hele lysbildet. Glassene ble deparaffinised i xilene og rehydreres på vanlig måte, ble det endogene peroxidase blokkert med 3% H
2o
2 i H
2O i 5 min. Antigen gjenfinning fremgangsmåten ble utført ved mikrobølgeovnen oppvarming i EDTA pH 8 (2 ganger i 4 min.). For å redusere ikke-spesifikk binding ble seksjonene inkubert med 20% normalt geiteserum i 30 minutter ved romtemperatur. Celler som uttrykker CD68 eller CD163, ble identifisert etter 1 time inkubasjon ved romtemperatur ved å bruke det monoklonale antihuman CD163 antistoff (1:50; clone10D6, BIOCARE), og det monoklonale antihuman CD68-antistoff (1:50; klon PG-M1; DAKO), respektivt . Deteksjon ble utført ved anvendelse av en merket polymer En Vision-mus + System-HRP (DAKO, Carpinteria, CA, USA), 30 min ved romtemperatur. Diaminobenzidin ble anvendt som et kromogen (DAB substrat System, DAKO). Deretter ble objektglassene vasket (TBS1X Ph7,5) i 5 minutter, og den passende fortynnet c-MAF (polyklonalt antihumant c-MAF, 01:50, Santa Cruz) eller pSTAT1 (polyklonale antihumane antistoffer pSTAT, 01:50, Santa Cruz) ble inkubert over natten ved 4 ° C. Deteksjon ble oppnådd ved anvendelse av en merket polymer En Vision-kanin + System-AP (DAKO, Carpinteria, CA, USA), 30 min ved romtemperatur. Fast Red ble anvendt som et kromogen (UCS diagnostisk srl). Seksjoner ble kontra med hematoksylin og montert med Glycergel (DAKO). Antallet av merkede M1 og M2 makrofager ble tellet manuelt av to forskjellige forskere (GFZ; EM) uten forutgående kjennskap til de kliniske og biologiske parametre, ved lav forstørrelse (5x objektivlinse) ved å evaluere for hvert tilfelle den samme tumorområdet bestående av ti representative høy effekt felt (400x forstørrelse) av vev seksjoner. M1 /M2-forholdet ble endelig beregnet.
Statistical Analysis
Lineær regresjonsmodell ble brukt for å undersøke hvilken rolle clinicopathological variabler som predikator for restsykdom etter CT /RT. Total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) ble beregnet fra tidspunktet for diagnosen til dødsdato /tilbakefall eller dato for siste oppfølging besøk, i henhold til M1, M2 og M1 /M2 nivåer. Medianer og livs bord i henhold til TAM nivåer ble beregnet ved hjelp av produkt grensen estimat av Kaplan og Meier metoden, og den log-rank test ble benyttet for å vurdere statistisk signifikans [21,22]. Alle statistiske beregninger ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap (versjon 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
De klinisk-patologisk kjennetegner hele serien har er oppsummert i tabell 1. Sixty-åtte pasienter (82,1%) viste FIGO stadium IB2 /IIB, mens 16 tilfeller (17,9%) hadde stadium III-IVA. De aller fleste kvinner (84,5%) viste en plateepitel histotype, og fullstendig patologisk respons på CT /RT ble dokumentert i 35 pasienter (41,6%). Median antall TAMs detektert ved immunhistokjemisk analyse i tumorbiopsi ved diagnosetidspunktet var 12 (0-46), og median antall M1 og M2 makrofager var lik regnskap for 5 (tabell 1). Forholdet mellom antall M1 og M2 ble beregnet for hver enkelt pasient, og medianverdien var 0.600, varierende fra 0 til 19. Median monocytt-celletall i utgangspunktet evalueringen var 490 /ul (230-1180), og antallet av sirkulerende monocytter viste direkte statistisk signifikant korrelasjon med antall TAMs (p-verdi = 0,001; figur 1).
Tomme sirkler representerer antall TAMs og sirkulerende monocytter i hver pasient, lineær trend er også gitt (
p verdi
, og
X
2
er beregnet med lineær regresjonsmodell).
median~~POS=TRUNC verdiene~~POS=HEADCOMP av M1, M2, og M1 /M2 ble anvendt som terskler for å identifisere pasienter med lave og høye nivåer. Representative eksempler på tilfeller med høye M1 og M2 nivåer har blitt gitt i figur 2A og 2B.
Som vist i tabell 1, ble ingen forskjeller dokumentert på sikt av klinisk-patologiske egenskaper mellom kvinner med høy lav M1 /M2. Men andelen kvinner som viser Pr0 etter CT /RT var nesten dobbelt i gruppen av pasienter med høyt M1 /M2 i forhold til tilfeller med lave nivåer av forholdet (55,0% vs 29,5%, p-verdi = 0,029). På univariate /multivariat analyse, squamous histotype (OR = 2,120, p-verdi = 0,028), og høye nivåer av M1 /M2 (OR = 2,067, p-verdi = 0,037) ratio dukket opp som de eneste uavhengige prediktorer for Pr0 (tabell 2).
Survival Analysis
Per juni 2014 var median varighet av oppfølging var 28 måneder (7-107) i den totale serien. Tilbakefall og død av sykdom ble observert hos 21 og 20 pasienter, henholdsvis
Kvinner med høye M1 nivåer viste en lengre 5-år DFS (79,7% vs 51,3%, p-verdi = 0,450)., Og 5- år OS (74,7% vs 49,0%, p-verdi = 0,249; figur 2C) sammenlignet med tilfeller med lave M1 nivåer, men disse forskjellene nådde ikke statistisk signifikans. På den annen, ble tilstedeværelsen av et høyt antall M2 forbundet med en kortere 5-yrs DFS (54,3% vs. 64,8%; p-verdi = 0,067), og OS (51,9% vs. 60,3%, p-verdi = 0,236) , men igjen forskjellene var ikke statistisk signifikant (figur 2D).
Gitt motsatt effekt på overlevelse av M1 og M2 fenotyper, fokuserte vi vår oppmerksomhet på prognostisk rolle M1 /M2-forhold. 5-år DFS var signifikant lenger i kvinner med høy M1 /M2, sammenlignet med tilfeller med overvekt av M2 (dvs. lav M1 /M2) (67,2% vs 44,3%, p-verdi = 0,019; figur 3A). På lignende måte ble tilstedeværelsen av en høy M1 /M2 forbundet med en forlenget 5-yars OS sammenlignet med tilfeller med lav M1 /M2 (69,3% i forhold til 46,9%; p-verdi = 0,037, fig 3B). Med sikte på å analysere uavhengig prognostisk rolle TAMs polarisasjon, ble Cox regresjonsmodell anvendt på overlevelsesdata. Både i univariat og multivariat analyse, nivåer av M1 /M2 ratio (DFS: HR = 0,233, p-verdi = 0,028; OS: HR = 0,245, p-verdi = 0,030), samt baseline monocytter count (DFS: HR = 1,462, p-verdi = 0,043, OS. HR = 1,181, p-verdi = 0,041) var uavhengig assosiert med redusert DFS og OS (tabell 3)
Diskusjoner
Etter ankomsten av CT /RT relevante fremskritt er oppnådd i prognosen for LACC. Imidlertid eksisterer det fremdeles en kohort av kvinner med redusert overlevelse på grunn av tilstedeværelsen av tumorceller som er resistente mot kjemoterapi og strålebehandling.
Nylig har resultatene av en retrospektiv analyse utført i en stor serie av kvinner med lokalt fremskreden sykdom demonstrert at høy forbehandlingen sirkulerende monocytt teller er en uavhengig negativ prognostisk faktor og det kan brukes som tilleggs biomarkør til SCC-antigen [13]. I vår studie fikk vi bekreftet disse funnene (tabell 3), viser for første gang at det foreligger en signifikant sammenheng mellom baseline sirkulerende monocytter telling og antall TAMs i tumorprøver tatt ved diagnosetidspunktet (fig 1). Disse resultatene støtter sterkt at det foreligger et sirkulerende monocytt /TAMS akse, som fungerer ved regulering av livmorhalskreft progresjon [23].
Det er velkjent at tumoren mikromiljøet representerer en aktuell kilde for kjemokiner, som driver bloduttredelse av sirkulerende monocytter til tumorstedet [23]. Etter å ha nådd den ondartet vev, et komplekst nettverk av cytokiner, inkludert IL-4, IL-10 og IL-13, induserer differensieringen av monocytter inn i M1 og M2 TAMs [23]. I denne sammenheng, representerer vår studie den første evaluering av kliniske rollen til M1 og M2 TAMs hos pasienter med LACC.
Først rapporterer vi i vårt studium et forhold mellom M1 og M2 av 0,600, og dermed tyder på at ved diagnose svulsten mikromiljøet er hovedsakelig polarisert mot en M2 fenotype. Disse data er i samsvar med overbevisende bevis som tyder på at M2 makrofager er involvert i prosessen med kreftutvikling i flere humane maligniteter, inkludert kreft i livmorhalsen [14]. Mekanismer som dette skjer er fortsatt uklare så videre studier for å undersøke og klargjøre dem er ønskelig.
Videre observerte vi at andelen kvinner som viser Pr0 etter CT /RT er nesten dobbelt hos pasienter med høyt M1 /M2 forhold til tilfeller med lav M1 /M2, og forhold mellom M1 og M2 makrofager representerer en selvstendig prediktor for PR0. Disse dataene understreker at differensiering av TAMs mot en M2 fenotype kan fremme utvikling av resistens mot CT /RT i LACC pasienter. Våre resultater er sterkt støttet av nyere bevis som tyder på at betennelse fremmer differensiering av M2 makrofager, som til slutt kjøre motstand mot platinaderivater i livmorhalskreft cellelinjer [24].
Med fokus på overlevelse, vi ikke observere en korrelasjon mellom det totale antall TAMs og overlevelse (tabell 3). Disse resultatene kan lett forklares med tanke på at befolkningen i TAMs består av minst to undertyper av makrofager med motsatte funksjoner [14]. Faktisk ble tilstedeværelsen av et høyt antall M1 forbundet med en ikke signifikant tendens til en lengre overlevelse, mens økte M2-nivåer var assosiert med en kortere overlevelse, igjen uten å nå statistisk signifikans (figur 2C og 2D). På den annen side, forholdet mellom M1 og M2 nivåer tydelig frem som en meget interessant relevant uavhengig negativ prognostisk faktor, med en rundt 20% økning av 5-yrs DFS og OS hos kvinner med høy grad av M1 /M2. Nylig har tilstedeværelsen av en sterk intraepitelial infiltrasjon av M1 makrofager vært forbundet med en stor tilstrømning av T-lymfocytter og en forbedret overlevelse i livmorhalskreft [25]. I samsvar med disse
in vitro
bevis, våre resultater gir den første påvisning av at kliniske, (snarere) mer enn det totale antall M1 og M2-celler, polarisasjonen av TAMs mot en bestemt fenotype bestemmer tumor biologiske egenskaper og pasientenes prognose.
fra et klinisk synspunkt, må det tas i betraktning at et økt antall TAMs har vært forbundet med en høyere microvessel tetthet [26], og forbedret VEGF produksjon [27] i livmorhalsen kreftpasienter. Derfor vil det være nyttig å undersøke i fremtiden virkningen av polarisasjonen av TAMs på tumor angiogenese, spesielt etter innføringen av Bevacizumab- ved behandling av cervikale kreftpasienter [28]. Disse eksperimentelle og kliniske resultater bedt oss om å ytterligere evaluere potensielle mål som viser tumorigent og immunsuppressiv potensialet knyttet til tumorassosierte makrofager. Videre våre funn støtter ytterligere prekliniske evalueringer av effekten av narkotika målretting TAMs som Trabectedin, i livmorhalskreft [29].
Vi erkjenner at vår studie representerer en av de første programmene i livmorhalskreftpasienter av en immunhistokjemisk tilnærming for å bestemme
in situ
antall M1 og M2 TAMs; imidlertid påliteligheten av våre eksperimentelle protokollen støttes av tidligere publiserte bevis [20]
Til tross for den potensielle relevansen av våre data flere begrensninger påvirke vår studie. liten utvalgsstørrelse, ikke-standardisert tilnærming av vår eksperimentelle protokollen foreslår at ytterligere potensielle undersøkelser er nødvendig før å trekke endelige konklusjoner.
i konklusjonen, våre resultater viser at polariseringen av TAMs mot en M2 fenotype ved diagnose, noe som reflekteres av en lavere forholdstall mellom M1 og M2 makrofager, er en meget interessant markør for dårlig respons på CT /RT og kortere overlevelse hos kvinner med LACC. Våre funn understreker behovet for å fortsette videre eksperimentelle undersøkelser med molekylær basert tilnærming for å avklare rolle i livmorhalskreft av de spesifikke subtyper av TAMs, herunder også befolkningen i blandet M1 og M2 TAMs som nylig har blitt demonstrert som er involvert i å fremme tumorvekst i kolorektal kreft [30].
