Abstract
Bakgrunn
Unike egenskaper ved kreft microenvironments kan brukes som mål for kreft terapi. The aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator (ARNT) er en viktig formidler av tumorprogresjon. Men den funksjonelle rollen ARNT i kjemoterapeutisk medikament-behandlet kreft er fortsatt uklart.
metodikk /hovedfunnene
Her fant vi at knockdown av ARNT i kreftceller redusert spredning rate og transformasjon evnen til disse cellene. Dessuten ble cisplatin-indusert celle apoptose forbedret i ARNT-manglende celler. Uttrykk for ARNT også redusert i nærvær av cisplatin gjennom proteasomal degradering veien. Men ARNT nivået ble opprettholdt i cisplatin-behandlet resistente celler, som hindret celle fra apoptose. Interessant, reaktive oksygenforbindelser (ROS) økt dramatisk når ARNT ble slått ned i kreftceller, styrke cisplatin-indusert apoptose. ROS fremmet celledød ble hemmet i celler behandlet med ROS-scavenger, N-acetyl-cystein (NAC).
Konklusjoner /Betydningen
Disse resultatene antydet at anticancer aktivitet av cisplatin kan tilskrives dens induksjon av produksjon av ROS ved ARNT degradering. Målretting ARNT kan være en potensiell strategi for å eliminere legemiddelresistens i cancerceller
relasjon:. Shieh J-M, Shen C-J, Chang W-C, Cheng H-C, Chan Y-Y, Huang W-C, et al. (2014) En økning i reaktive oksygen arter av Deregulering av ARNT Forbedrer kjemoterapeutiske legemiddelindusert Cancer Cell Death. PLoS ONE 9 (6): e99242. doi: 10,1371 /journal.pone.0099242
Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan
mottatt: 17 februar 2014; Godkjent: 13 mai 2014; Publisert: 12 juni 2014
Copyright: © 2014 Shieh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet NSC 102-2628-B-006-011-My3 fra National Science Council of republikken Kina. Denne forskningen ble støttet delvis av hovedkvarteret fra University Advancement ved National Cheng Kung University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator (ARNT), også kjent som hypoksi-induserbar faktor (HIF) -1β, er en transkripsjonsfaktor som tilhører den grunnleggende helix-loop-helix Per-ARNT-Sim (bHLH -Pas) familie, slik som endotel-PAS domene protein 1 (EPAS1), HIF-1α, og aryl hydrokarbon-reseptor (AhR) [1] – [3]. Den ARNT danner en heterodimer med HIF-1α som respons på varierende oksygennivå av mikromiljøer, og ytterligere fremmer celleoverlevelse og angiogenese [4] – [6]. I tillegg avbrudd av ARNT i mus embryonale stamceller fører til hypoglykemi, en angiogenese mangel og en unnlatelse av å svare på hypoksi [7]. Videre er ARNT en mediator i normoksisk forhold når cellene overfor skadelige faktorer i mikromiljøet, slik som 2,3,7,8-tetra-chlorodibenzo [b, e] [1], [4] -dioksin (TCDD) eller anti -cancer medikamenter [8], [9]. Den ARNT dimerizes med aryl hydrokarbon-reseptor (AhR) og regulerer transkripsjon Sp1 aktivitet, etter oppregulering av promotoren av cytokrom P450-underfamilien polypeptid 1 (CYP1A1) for å motstå xenobiotiske påkjenninger, f.eks TCDD [3]. Ved regulering av den ARNT i celler, kan det være stabilisert ved samspill med BRCA1 proteinet i løpet av TCDD-spenning [10]. På den annen side, til aktiv kaspase-3 spalter Arnt under apoptose redusere celleoverlevelsessignaler [11]. Tap av HIF-1α og ARNT også fører til en økt reaksjon på radioterapi, en reduksjon i tumorvekst, og reduksjon av angiogenese i tumorer transplantert inn i immun-mangelfull mus [12]. I våre tidligere studier, fant vi at ARNT samhandlet med c-Jun å danne c-Jun /ARNT og c-Jun /ARNT /SP1 komplekser som fremmer uttrykk for cyklooksygenase (COX) -2, 12 (S) -lipoxygenase, og p21
WAF1 /CIP1
, i epidermal vekstfaktor (EGF) -behandlet cervikale kreftceller i en normoksisk tilstand [1], [13]. Disse studier indikerte at ARNT samhandler med HIF-1α som reaksjon på hypoksiske betingelser og binder også sammen med spesifikke transkripsjonsfaktorer som har evnen til å utløse signalene med tumorgenese i en normoksisk tilstand.
Cisplatin er et stort kjemoterapeutisk medikament brukt med mange typer kreft, spesielt testikkel, eggstokkene, esophageal, cervical, mage, prostata, og ikke-småcellet lungekreft [14]. Etter innstrømning i en celle, er cisplatin hydrolysert og blir dets aktive form. Tverrbinding av DNA-trådene skjer ved aktiv cisplatin binding til DNA på stillingen 7 av guanin som forårsaker kreft celledød [15], [16]. I tillegg til å forårsake apoptose ved å indusere cytokrom c frigivelse som respons på DNA-stress, cisplatin også induserer celleapoptose forårsakes av reaktive oksygenarter (ROS) via en p53-mediert p38a mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) reaksjonsveien i HCT1116 tykktarmskreftceller [ ,,,0],17]. ROS er stadig generert og eliminert under normal fysiologisk og biologisk funksjon [18]. Under oksidasjonsmiddel stress, så som hypoksi eller xenobiotisk stimulering, kan ROS elimineres ved scavenging proteiner, slik som superoksyd dismutaser (SOD) og glutation-peroksydase. Kreftceller viser større toleranse for ROS enn gjør normale celler. Et lavt nivå av ROS letter kreftceller kjørecellevekst-assosierte gener, men en høyere produksjon av ROS fører også til celler til å gjennomgå apoptose [19]. Imidlertid kreftceller tilpasse for skade fra cisplatin ved oppregulering efflux transportører, slik som ATP-bindende kassett (ABC) transportør. En multiresistens (MDR1) er et medlem av medikament efflux ABC-transportører som pumper anti-kreft medikamenter utsiden av membranen [20]. Videre overekspresjon av MDR1 tillater humane KB karsinomceller til effektivt å motstå colchicin, vinblastin, og doksorubicin [21]. Anti-kreft narkotika forårsake kreft celler til å erverve resistens gjennom overekspresjon av resistente gener. Derfor forstå den molekylære mekanismen involvert i regulering av kjøp av motstand i kreftceller vil være gunstig for effektiv behandling.
I vår forrige undersøkelse fant vi at ARNT interaksjon med SP1 for å regulere MDR1 uttrykk og beskyttede celler fra cisplatin indusert apoptose [9]. Den ARNT-regulert utstrømning av narkotika ble også observert i MDR1-oppregulert kreftceller. Disse resultatene viser at ARNT er en av regulatorer for å opprettholde kreftceller overlevelse etter cisplatin behandling. For ytterligere å forfølge potensielle rolle ARNT i å opprettholde celle overlevelse, ble effekten av ARNT nivå på kjemoterapeutisk effektivitet studert i ulike krefttyper. I denne studien fant vi at dereguleringen av ARNT ikke bare redusert celle levedyktighet, men fremmet cisplatin-indusert celledød ved å styrke produksjonen av ROS. Resultatene indikerte at ARNT kunne samtidig regulere MDR1 uttrykk og redusere ROS nivå for å beskytte kreftceller fra legemiddelindusert apoptose.
Resultater
Den ARNT regulerer kreftcelle spredning
for å klargjøre at ARNT er viktig for svulst celle vekst under normoksisk forhold, ble celleproliferasjon bestemt av en BrdU inkorporering analyse under en ARNT-knockdown tilstand. Som vist på fig. 1A, celleformeringshastigheten var signifikant redusert i siARNT celler. Resultater fra puls-merking med BrdU (20 min), og synkronisering av celler ved tymidin blokken viste at siARNT redusert DNA-syntese (fig. 1B) og fastholdt celler i S-fase progresjonen av cellesyklusen henholdsvis (fig. S1). Disse resultatene antydet at ARNT regulerer celleproliferasjon eventuelt gjennom kontroll av S-fase progresjon i normoxia.
(A) HeLa-celler ble transfektert med 30 nM ARNT siRNA oligonukleotider og krafse oligonukleotider (SC) ved lipofeksjon. BrdU-inkorporering assay ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. Feilfelt betegner middelverdien + SD (n = 3). Statistisk signifikans (*** P 0,001; ** P 0,01) mellom kontroll og siARNT oligonucleatides-behandlede celler ble analysert ved Student
t
test. (B) HeLa-celler ble transfektert med 30 nM ARNT siRNA oligonukleotider og krypterings oligonukleotider (SC) av lipofeksjon og merket med 20 nM BrdU i 20 minutter eller 24 timer. Cellene ble fiksert og farget med anti-BrdU antistoffer etterfulgt av anti-mus FITC og DAPI. Prosentandelen av kreftceller med positive atom og BrdU-farging ble beregnet ved å telle immunopositive celler i fire tilfeldig valgt. Feilfelt betegne gjennomsnittlig + SD (n = 4). Statistisk signifikans (*** P 0,001; ** P 0,01) mellom kontroll- og siARNT oligonucleatides-behandlede celler ble analysert ved Student
t
test
knockdown av Arnt hemmer. celle transformasjon
Basert på funnene som arnt uttrykk øker spredning av kreftceller, ble effekten av ARNT på celleproliferasjon ytterligere bekreftet ved hjelp av en koloni formasjon analysen. Som vist på fig. 2A, selv om størrelsen ikke var forenlig med foreldre celler, antall koloni redusert mer åpenbart i ARNT-manglende celler. Den reduserte formeringshastigheten ble også observert i Arnt manglende celler (fig. S2). Interessant nok har vi funnet at veksten av shARNT celler ble hemmet i henhold til 3D-kultur tilstand (fig. 2B), men ikke i 2D-kulturbetingelser (fig. 2A). Disse resultatene indikerte at uttømming av ARNT redusert evne til cellulær transformasjon av kreftceller.
(A) I henhold til en normoksisk tilstand, A375 parentale celler (P), shLacZ celler (Z), og ARNT-dempede celler ( shARNT # 1 og # 2) ble inkubert i friskt kulturmedium i normoksiske tilstand. Etter 7 dager ble cellene fiksert og farget med Giemsa beis. Forsøket ble utført ved kolonidannelsesbestemmelsen. (B) Den uttømming av ARNT hemmer celle transformasjon i kreftceller. Celler ble sådd ut i topplaget av agar-medium. Etter inkubering i 3 uker med supplert medium, ble cellene fiksert og farget med Giemsa. Forsøket ble utført ved soft agar assay. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
ARNT-knockdown fører resistente celler til å være mer følsomme for cisplatin
Blant cellegifter, induserer cisplatin celledød ved å danne cisplatin- DNA-addukter som fører til DNA-skade og svekker progresjon til S-fase. Muligheten for at ARNT styrer celledeling gjennom regulering av S-faseprogresjon fikk oss til å undersøke hvorvidt det produsert noen effekt på cisplatin-indusert celledød. For å klargjøre betydningen av ARNT i å regulere cisplatin motstand, brukte vi et par av celler, HONE-en og finpusse-1-C15 (HONE-1 cisplatin-resistente celler). Stabil Arnt knockdown cellelinjer ble generert av stabilt trans HONE-en og HONE-en-C15 cellelinjer med shARNT vektor (fig. S3). Som vist på fig. 3, cisplatin-indusert apoptose var mer signifikant i shARNT celler enn i paren HONE-1-celler. I tillegg cisplatin forårsaket mindre celledød i Hone-en-C15 celler enn i HONE-1 celler, selv med høy konsentrasjon behandling. Men HONE-en-C15 celler mistet sin motstand evne i en ARNT-knockdown tilstand (Fig. 3). Under cisplatin behandling, ARNT var også forringet i sperre Hone-1-celler, men ikke i resistente HONE-1-C15-celler (fig. 4). Cisplatin fremmet mer caspase-3-aktivering i HONE-1 celler, men ikke i Hone-en-C15 celler, selv når en høyere konsentrasjon av cisplatin ble brukt til å finpusse-1-C15-celler (Fig. 4). Men begge HONE-1 og HONE-1-C15-celler ble mer følsomme for cisplatin når ARNT var mangelfull (Fig. 4). Disse resultatene bekreftet at uttrykk for ARNT er en viktig faktor som regulerer legemiddelresistens av kreftceller.
hone-en shLacZ celler (Z), Hone-en ARNT-manglende celler (shARNT), HONE-en-C15 shLacZ celler (Z), og hone-en-C15 ARNT-manglende celler (shARNT) ble behandlet med eller uten cisplatin (20 mikrometer cisplatin for hONE-1 shLacZ celler og hONE-en ARNT-manglende celler, 80 og 100 mikrometer cisplatin for hONE -1-C15 shLacZ celler og HONE-1-C15 ARNT-manglende celler) i 24 timer. Apoptotiske celler ble undersøkt ved farging med annexin V-FITC /propidiumjodid (PI), og flow-cytometri ble brukt til å analysere celle apoptose. Den apoptotiske forholdet ble beregnet. * Sen apoptose; # Tidlig apoptose. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
hone-1 celler ble transfektert med 50 nM siARNT eller 50 nM stealth RNAi negativ kontroll (SC) i 24 timer og behandlet med eller uten cisplatin (60 mikrometer for HONE-1-celler og 80 uM for HONE-1-C15-celler) i friskt medium dyrket i 24 timer. Totalt protein (inkludert levende celler og døde celler) ble ekstrahert, analysert med Western blotting og detektert med ARNT, caspase-3, og a-tubulin-antistoffer. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
cellegifter indusere ARNT degradering og celle apoptose
For å klargjøre mekanismen involvert i nedregulering av ARNT i cisplatin-behandlet sensitive celler, uttrykk for ARNT ble videre undersøkt i ulike kreftcellelinjer. Som vist på fig. 5A, cisplatin ga ingen effekt på transkripsjonsnivået av ARNT budbringer (m) RNA. Men cisplatin-indusert ARNT deregulering ble reversert i celler behandlet med en proteasominhibitor (Fig. 5B). Resultatene viste at cisplatin utløst ARNT degradering gjennom proteasomer avhengige trasé i følsomme celler. Interessant, cisplatin-indusert ARNT deregulering kan også bli reversert når forskjellige typer kreftceller ble forbehandlet med ROS-passiveringsmidlet NAC (fig. S4). Resultatene viste at produksjonen av ROS, i det minste er en årsakene til å eliminere ARNT i cisplatin-behandlede kreftceller. For ytterligere å undersøke om deregulering av ARNT er også nødvendig for andre kjemoterapeutiske stoffer som taxol og doxorubicin å indusere celledød, HeLa og HeLa cisplatin-resistente (HeLa R) celler ble behandlet med disse legemidlene, og uttrykk for ARNT og fragmentert DNA ble undersøkt . Doksorubicin og taxol hemmet ARNT uttrykk og økt i fragmentert DNA i HeLa-celler (fig 5C . 5D). Imidlertid ekspresjon av ARNT ble ikke endret i HeLa R-celler etter behandling med taxol eller doksorubicin (fig. 5C), og disse resultatene var i samsvar med mangel på fragmentert DNA observert i HeLa R-celler (fig. 5D). I tillegg shARNT cellelinjer var også mer følsomme overfor cisplatin-indusert celledød (fig. 3). Disse resultatene antydet at ARNT spiller en sentral rolle i å bidra til motstand ved kreftceller til ulike cellegifter. Vi har også funnet at caspase-inhibitor, ZVAD, blokkerte ekspresjon av p53 og aktiveringen av caspase-3 i cisplatin-behandlede celler (fig. 5E). Interessant nok var cisplatin-indusert deregulering av ARNT restaurert i ZVAD behandlet sensitive HeLa-celler (fig. 5E). I tillegg ble cisplatin-indusert kaspase-3 aktivering, uttømming av ARNT, og en økning i p53 reversert i celler forbehandlet med NAC (fig. S4). Disse resultatene indikerte at cisplatin-indusert aktivering av kaspase-3-mediert ekspresjon av ARNT og p53. ZVAD blokkert caspase-3 og reddet ARNT ekspresjon i cisplatin-behandlede sensitive celler, noe som antyder at caspase-3 aktivering er nødvendig for cisplatin-indusert celledød i følsomme celler.
(A) HeLa-celler ble behandlet med cisplatin for 24 timer. Total RNA ble ekstrahert for revers-transkripsjon PCR med ARNT og GAPDH primere. (B) HeLa-celler ble behandlet med 10 uM MG132 eller 1 uM laktacystin i 4 timer fulgt av cisplatin i 36 timer. Ekspresjon av ARNT og aktin ble analysert ved Western blotting-analyse ved anvendelse av anti-ARNT og anti-actin-antistoffer. (C) HeLa og Helar-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av taxol og doksorubicin i 24 timer. Uttrykk for ARNT og aktin ble oppdaget av Western blotting analyse ved hjelp av anti-ARNT og anti-aktin antistoffer. (D) Etter 30 uM cisplatin behandling av HeLa HeLa og R-celler, ble DNA-fragmentering apoptotiske bestemt som beskrevet i «Materialer og metoder». (E) Cellene ble transfektert med 30 nM ARNT siRNA oligonukleotider og egge oligonukleotider (SC) ved lipofeksjon. Etter 30 uM ZVAD behandling i 30 min, fulgt av 30 uM cisplatin i 36 timer, ble lysater av celler fremstilt og underkastet SDS-PAGE og analysert ved Western blotting med antistoffer mot ARNT, procaspase-3, caspase-3, p53, og aktin . Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Økningen i ROS i ARNT-knockdown celler bidrar til cisplatin-indusert apoptose
I tillegg til dereguleringen efflukspumper, en økning i ROS-nivå er en annen måte for cellegifter for å indusere apoptose. Som vist på fig. S4, uttømming av ROS dramatisk hemmet cisplatin-indusert celle apoptose. For ytterligere å klargjøre den mekanisme som er involvert i ARNT-regulert cisplatin motstand, ble rollen til ROS i cisplatin-indusert celledød undersøkt. Først identifiserte vi mengden av ROS i foreldre (P), shLacZ (Z), og shARNT celler. Interessant, fant vi at ROS var åpenbart høyere i ARNT-manglende celler enn i foreldreceller under normoksisk forhold (Fig. 6 og Fig. S5a). Økningen av ROS ble redusert i shARNT celler behandlet med NAC (fig. S5a). I tillegg ble cisplatin-forbedret ROS mengde eliminert i celler behandlet med NAC (fig. S5b). Cisplatin også indusert høyere produksjon av ROS i shARNT-celler (fig. S5C), og mengden av ROS ble redusert i celler behandlet med NAC. Disse resultatene antydet at uttrykket av ARNT hemmet cisplatin forbedret ROS produksjon. For å avklare om økningen i ROS i shARNT-celler spiller en rolle i cisplatin-indusert apoptose, ble NAC brukt til å utarme ROS, og den apoptose-forholdet ble analysert. Som vist på fig. 7, NAC inhiberte signifikant cisplatin-indusert celledød i shARNT-celler (fig. 7). Resultatene viste at ARNT beskyttet kreftceller fra cisplatin-indusert apoptose, minst gjennom å redusere ROS produksjon i cellene.
A375 foreldre og shARNT cellene ble inkubert under en normoksiske tilstand over natten og farget med karboksy-DCFDA å overvåke ROS produksjon. FL1 fluorescens er angitt fluorescens verdien av karboksy-2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (karboksy-DCFDA). Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Celler ble forbehandlet med 10-acetylcystein (NAC) i 1 time før A375 foreldreceller (P), shLacZ celler (Z), og ARNT-forstummet celler (shARNT # 1 og # 2) ble behandlet med 5 uM cisplatin, og deretter ble inkubert i 24 timer. Apoptotiske celler ble undersøkt ved farging med annexin V-FITC /propidiumjodid (PI), og flow-cytometri ble brukt til å analysere celle apoptose. Den apoptotiske forholdet ble beregnet. * Sen apoptose; # Tidlig apoptose. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Kreft terapeutiske programmer, for eksempel radikal behandling kombinert med chemo-terapeutiske medikamenter mediert ved induksjon av ROS, er viktige måter å eliminere kreftceller [22]. Men kreftceller er i stand til motstand mot skader forårsaket av ROS-indusert apoptose gjennom alternative anti-apoptotiske veier, for eksempel Akt, Kras, BRAF, og Myc [23], [24]. I denne studien demonstrerte vi at ARNT tillagt en anti-apoptose evne på kreftceller behandlet med anti-kreft legemiddel, cisplatin. Videre cisplatin produsert større ROS generasjon i ARNT-knockdown-celler, noe som resulterer i forbedring av celledød. I likhet med våre funn at Arnt beskyttet mot celleskader ved å redusere ROS-nivåer, leukemicellene var følsomme for troglitazon som også induserer apoptose gjennom intracellulær ROS [25]. Resistente leukemicellene viste en overflod av ARNT og også fulgt oppregulering av SOD (SOD2), nukleær faktor erytropoide 2 relatert faktor 2 (Nrf2) avskrift, og intracellulære glutation konsentrasjon [25]. SOD2 reduserer antioksidanter og Nrf2 øker antioksidantenzymaktivitet [25]. I tillegg regulerer Nrf2 transkripsjonen av mir125b å inhibere AhR repressor (AhRR), som beskytter nyre fra akutt skade [26]. Dette tyder på at dannelsen av AhR /Arnt komplekser kan reguleres ved mir125b [8]. Disse resultatene tyder på at ARNT kan regulere SOD2 uttrykk eller ARNT /AhR kompleks formasjon for å redusere celleskader forårsaket av økt ROS.
Når det gjelder regulering av ARNT, fant vi at cisplatin kan hemme ARNT i noen uoppdagede måter. ARNT ble nedbrutt i en doseavhengig måte i ikke-resistente celler behandlet med cisplatin. ARNT halveringstid syntes å være viktig for apoptose forårsaket av cisplatin. For eksempel, proteasomhemmere som MG132 og laktacystin, blokkerte nedbrytning av ARNT forårsaket av cisplatin. Imidlertid cisplatin-resistente cancercellelinjer viste at ARNT stabilitet ikke ble endret i løpet av behandling med cisplatin. Disse kreftcellene med konstante nivåer Arnt viste også en god evne til å forhindre muligheten av apoptose. Disse resultatene samsvarer med en tidligere studie der ARNT avbrudd var korrelert med proteasomal degradering via ubiquitinering prosessen [27]. I samsvar med våre funn at ARNT ble utarmet av anti-kreft narkotika, ARNT ble også degradert av curcumin i normoksisk og hypoksiske forhold i ulike kreftcelletyper [27]. I tillegg kan ekspresjon av ARNT gjenopprettes ved behandling med NAC, en ROS scavenger, i nærvær av curcumin. Disse resultatene er i samsvar med våre funn at NAC reddet uttrykk for ARNT i cisplatin-behandlet sensitive celler. Den ARNT kan også forstyrres ved bruk av H
2o
2 i kreftceller [27]. I tillegg til ROS og i overensstemmelse med det faktum at caspase-3 og kaspase-9 også spalte ARNT på Asp 151 aminosyre område in vitro [11], har vi funnet at cisplatin-indusert nedbrytning av ARNT ble undertrykt etter behandling med kaspaseinhibitor ZVAD. Dermed kan cisplatin-aktivert caspases forårsake deregulering av ARNT i narkotika-sensitive celler, men ikke i resistente celler. Kjemoterapeutiske medikamenter slik som taxol og doxorubicin kan også henholdsvis indusere apoptose kreftcelle gjennom caspase-10 og p53-trasé [28], [29]. I denne studien, taxol og doxorubicin også forbedret ARNT degradering, noe som resulterer i apoptose av sensitive celler. Disse resultatene viste at ARNT er en viktig faktor i å beskytte cancerceller mot medikament-indusert skade. En tidligere studie viste også at spaltning av ARNT forsterkes ved hypoksi-indusert aktiv caspase, og dette downregulated transkripsjonen aktivitet av overlevelses gener som induseres fra HIF [27]. Produksjonen av ROS er en av effekter gjennom hvilke cisplatin forårsaker celledød [17]. Det ble også rapportert at mir-24 indusert ved ROS bevirker uttømming av ARNT i proteinnivå i humane leverkreft cellelinjer [30]. Til sammen kunne ROS bli indusert av uttømming av ARNT, og deretter produserer negative tilbakemeldinger regulering av ARNT ved induksjon av mirRNA videre. Av den grunn, er forhindring av ARNT nedbrytning i den innledende behandling av medikamenter viktig for overlevelsen av kreftceller. Men om det ROS-indusert mir-24 er årsaken til undertrykkelse av ARNT i cisplatin-behandlede celler skulle bli undersøkt i våre videre studier. Selv om den mekanisme som er involvert i oppregulering av ROS nivå indusert ved uttømming av ARNT var ikke klar, og vil også bli undersøkt, spekulert vi at undertrykkelsen av ARNT kunne være en av mekanismene som er ansvarlig for å endre nivået av ROS i cisplatin-indusert celledød.
generelt kan ARNT interagere med HIF-1α å regulere gener som er involvert i å fremme angiogenese, samhandle med c-Jun og Sp1 til å modulere ekspresjon MDR1, eller regulere EGF-indusert ekspresjon av COX-2, 12 (S ) -lipoxygenase, og p21
WAF1 /CIP1
, som fornemme endring av microenvironmental komponent [1], [13]. ARNT spiller også viktig rolle i å regulere tumorprogresjon, avgiftning, og utstrømning av anti-kreftlegemidler, noe som øker sjansen overlevelse i uheldige omstendigheter [3], [8], [9], [24]. I kjemoterapeutisk behandling av cancer, akkumuleres cisplatin i kreftceller som forårsaker DNA-skade og induserer apoptose. Stoffet efflukspumpen, MDR1, blir oppregulert ved ARNT for å forhindre cisplatin-indusert apoptose [9]. I tillegg til å regulere legemiddelresistens i forrige undersøkelse, ARNT også beskytter celler fra microenvironmental toksisitet. For eksempel, oppfatter AhR /ARNT kompleks miljøgifter og regulerer trasé ansvarlige for avrusning. For eksempel induserer TCDD tallrike gener mediert av AhR /ARNT kompleks, slik som cytokrom P450 1A1 (CYP1A1) som kan gifte av polycykliske aromatiske forbindelser [8], [31]. I denne studien fant vi at ARNT spiller videre rolle i nedregulering av ROS å hindre kreftceller som lider skade fra cisplatin behandling. Til sammen spekulert vi at ARNT er en sentral megler for å eliminere cytotoksisitet opphisset av miljøfaktorer.
I konklusjonen, våre resultater viser at utarming av ARNT fremmet i effekten av anti-kreft narkotika på kreft celledød. I vår forståelse, var det minst to mekanismer som er involvert i ARNT-forårsaket legemiddelresistens: MDR1 oppregulering [9] og forebygging av ROS produksjon. Selv om mekanismen involvert i reguleringen av ROS produksjon av ARNT uttrykk er fortsatt ukjent, kan utvikling av antagonister rettet mot ARNT gi nye strategier for å ødelegge resistente kreftceller.
Materialer og metoder
Cellekulturer
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP av menneskelig malignt melanom (A375) og human livmorhalskreft (HeLa) ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Menneske nasofaryngeale carcinoma celler (HONE1 og HONE-en-C15) ble vennlig levert av Dr. Jane-Yang Chang (National Health forskningsinstitusjoner, Taiwan) [32]. A375 og HeLa-cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 1% glukose (Gibco). Hone-1 celler og deres derivater cisplatin-resistent variant, HONE-en-C15, ble opprettholdt i RPMI-medium 1640 (Gibco). Alle cellelinjer ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone), 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich) og 100 U /ml penicillin (Sigma-Aldrich) i kulturmedium og inkubert med 5% CO
2 ved 37 ° C for vedlikehold. Cisplatin-resistente HONE-1-C15 celler ble opprettholdt i medium inneholdende 15 uM cisplatin. De ARNT-manglende A375-cellelinjer var uavhengige stabile cellelinjer infisert med lentiviral vektor-avledede ARNT liten hårnål (sh) RNA [9]. De ARNT-mangel HONE-1 og finpusse-en-C15 cellelinjer ble stabile cellelinjer infisert med lentiviral vektor-avledet ARNT shRNA [9]. Drug-motstand tidsplaner ble brukt til å utvikle underlinjer som er resistente mot cisplatin [9]. HeLa-celler ble utsatt for cisplatin for en 9-måneders periode. Motstanden sublinje oppnådd ved denne fremgangsmåten er betegnet som HeLa R.
Trypan blå eksklusjon assay
Celler ble sådd ut i 5 x 10
4 per brønn i 24-brønners plater. Etter Cellene ble latt bli tilkoblet over natt, ble mediet erstattet med friskt medium med eller uten cisplatin. Celler ble inkubert ved 37 ° C under en fuktet hypoksisk tilstand (1% O
2) i ytterligere 24 timer og trypsinisert for å resuspendere dem i medium inneholdende serum. Trypan blått fargestoff på 20 ul og 20 ul av en cellesuspensjon ble blandet for å måle antallet av levende celler (med en fortynningsfaktor på 2). Fargede celler ble tellet og ansett som døde celler.
bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering assay
DNA-syntese i prolifererende celler ble påvist ved BrdU-inkorporering (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Sperre og Arnt knockdown-celler ble utspredt på 96-brønners plater og inkubert i 24 timer. 5-bromdeoksyuridin (BrdU) reagens ble tilsatt til kulturmedier for 0 til 48 timer ble 100 pl fikseringsoppløsningen tilsatt til cellene i 30 min. Cellene ble vasket med vaskebuffer og inkubert i 1 time med 100 pl 1 x BrdU-antistoff. Etter tilsetning av 100 pl 1 x HRP-konjugat løsning i 30 minutter, ble 100 ul TMB-substratoppløsning tilsatt. Etter 30 min inkubasjon ble stoppløsning tilsatt. OD ble målt ved 450 nm ved bruk av en plateleser. For immunfluorescens,-celler transfektert med 30 nM ARNT siRNA oligonukleotider ble puls-merket med 20 nM BrdU i 20 minutter eller 24 timer. Cellene ble fiksert og farget med anti-BrdU antistoffer etterfulgt av anti-mus FITC og DAPI. Prosentandelen av kreftceller med positive kjernekraft og BrdU flekker ble beregnet ved å telle immunopositive celler i fire tilfeldig valgt ved hjelp av Image J programvare.
Colony formasjon analysen
Celler ble platet som separate enkeltceller i 6 -vel cellekulturplater. Etter at cellene fikk feste seg over natten, ble cellene behandlet med eller uten 1 mM cisplatin i 8 timer, og mediet ble endret til friskt kulturmedium. Dyrkningsmediet ble byttet hver 2. dag. Etter inkubasjon i 7 dager ble cellekoloni ble vasket to ganger med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA, Sigma-Aldrich). Metanol (JT Baker) ble anvendt for å øke gjennomtrengning av celler, og Giemsa beis (Sigma-Aldrich) ble anvendt for celle farging. Colony tallene ble bestemt med bilde J programvare [33]. Den kolonidannelse ble bekreftet minst tre ganger.
myk-agar assay
høy-glucose DMEM inneholdende 10% FBS med 0,5% agarose ble sådd ut på bunnen (1,5 ml /brønn) av 6-brønns plater. Etter at basalagar- hadde stivnet, 5 x 10
3-celler ble resuspendert i høy glukose DMEM inneholdende 10% FBS med 0,25% agarose og lagt på toppen (1,5 ml /brønn) i 6-brønns plater. Celler ble inkubert med 0,5 ml supplementert medium etter at toppsjiktet agaren hadde størknet. Dyrkningsmediet ble byttet hver 2. dag. Etter inkubering i 2 uker, ble cellene vasket to ganger med PBS og fiksert med 4% PFA. Metanol ble anvendt for å øke gjennomtrengning av celler, og Giemsa beis ble benyttet for celle farging. Den kolonidannelse ble bekreftet minst tre ganger.
Revers transkripsjon-PCR (RT-PCR)
Cell RNA ble ekstrahert ved TRIzol (Invriogen) reagens og etterfulgt av manuskriptet. To ug RNA ble reversert ved ImProm-II ™ revers transkriptase (Promega) og anvendt for cDNA-templat av polymerase kjedereaksjon (PCR). 50 ng cDNA mal ble brukt for PCR med 2.5U Tag DNA polymerase (MD Bio, Taiwan) [34]. Primersettene ble anvendt som følgende: ARNT (F): 5′-TGGGTCCAGCCATTGCCTCT-3 «, ARNT (R): 5′-CGAGCCAGGGCACTACAGGT-3′, GAPDH (F): 5»-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3 «, GAPDH (R ): 5»-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3 «. PCR-reaksjonene ble deretter elektroforese på 2% SeaKem LE agarosegel (Lonza, ME, USA).
Western blot-analyse
Cellene ble høstet med 1x CCLR eller RIPA-buffer (10 mM Tris-buffer ved pH 6,5, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% DOC, og 1% NP-40 inneholdende protease inhibitorer).
