Abstract
mikroRNA-449a uttrykkes på et lavt nivå i flere svulster og kreftcelle linjer, og induserer G1 arrest, apoptose, og begynnende alderdom. Å identifisere funksjonen til MIR-449a i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), diskuterte vi potensialet relevansen av MIR-449a til clinicopathological egenskaper og prognose i NSCLC. Vi har også undersøkt effekten av MIR-449a om migrasjon og invasjon i NSCLC celler. Uttrykket av MIR-449a i NSCLC vev og cellelinjer ble oppdaget ved hjelp av RT-qPCR.
In vitro
, gain-of-funksjon, tap-av-funksjon eksperimenter, og fluorescens-analyser ble utført for å identifisere potensielle mål for MIR-449a og funksjonen av MIR-449a i NSCLC-celler. MiR-449a ble nedregulert i både NSCLC vev og cellelinjer. Dessuten, et lavt ekspresjonsnivå av MIR-449a så ut til å være korrelert med lymfeknutemetastase og dårlig overlevelse.
In vitro
, MIR-449 regulert celle migrasjon og invasjon i NSCLC celler som en potensiell tumor suppressor, i hvert fall delvis ved å målrette c-Met. Videre ble gjensidig uttrykk for MIR-449a og c-Met vist i NSCLC vevsprøver. Denne studien viser at Mir-449a kan være assosiert med NSCLC progresjon, og foreslår en avgjørende rolle for MIR-449a i NSCLC
Citation. Luo W, Huang B, Li Z, Li H, Sun L, Zhang Q, et al. (2013) mikroRNA-449a Er nedregulert i ikke-småcellet lungekreft og hemmer migrasjon og invasjon av målretting c-Met. PLoS ONE 8 (5): e64759. doi: 10,1371 /journal.pone.0064759
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 9. desember 2012; Godkjent: 17 april 2013; Publisert: 29. mai 2013
Copyright: © 2013 Luo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation National of China (nr 30972967) tilskudd, Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning (nr 20092104110018), Program for Liaoning gode talenter i University, Liaoning Provincial Natural Science Foundation (nr 20102122) og Shenyang Science and Technology Program (F10-149-9-41). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA, omtrent 20 til 25 nukleotider, som regulerer genekspresjon posttranscriptionally. Ved å binde seg til en komplementær sekvens hovedsakelig funnet i 3′-UTR til målet mRNA, mirnas enten nedbrytes disse mRNA eller hemmer dem fra å bli oversatt til proteiner. Nesten 50% av menneskelige miRNAs er plassert på skjøre områder og genomiske regioner som er involvert i kreft [1]. Emerging bevis viser at mirnas er korrelert med ulike menneskelige kreft og fungerer som både onkogener og tumor dempere [2], [3], [4].
mikroRNA uttrykk deregulering i kreft hos mennesker har vist at miRNA feilregulering er tilknyttet med mange typer kreft, inkludert lungekreft [5], [6], [7], [8], [9]. Høy ekspresjon av MIR-155 og lav ekspresjon av la-7, MIR-126 er rapportert å forutsi dårlig prognose av lunge adenokarsinom [6], [7], [10]. Raponi og kolleger beskrives ulike miRNA uttrykk i lunge plateepitelkarsinom (SCC) sammenlignet med normal lungevevet [11]. Basert på miRNA uttrykk deregulering, kan mirnas tilveiebringe en ny fremgangsmåte for kreftdiagnostikk.
MiR-449 uttrykkes på et lavt nivå i flere kreftcellelinjer og faste tumorer inkludert prostata cancer [12], gastriske cancere [13 ], blære kreft [14] og lungekreft [15]. De biologiske målene for MIR-449 har blitt delvis identifisert, og MIR-449 induserer G1 arrest, apoptose, og begynnende alderdom ved regulering av viktige faktorer i cellesyklus og apoptose som histondeacetylase 1 (HDAC1) [12], CDK6 [16] , [17], [18], CDC25A [16], [18], cyklin D1 (CCND1) [19], og SIRT1 [17]. Men lite er kjent om rollen MIR-449a i NSCLC progresjon. I denne studien fant vi at Mir-449a ble nedregulert i NSCLC vev og forbundet med clinicopathologic tegn og prognose. Vi utforsket effekten av MIR-449a i NSCLC celle migrasjon og invasjon og dens regulering av målet genet c-Met. Gjensidig uttrykk for MIR-449a og c-Met ble observert hos NSCLC vevsprøver og mulige roller MIR-449a og c-Met i NSCLC progresjon blir diskutert.
Materialer og metoder
Samples
Ferske prøver fra lungekreft og tilsvarende normal tilstøtende vev (NAT, 5 cm fra kreftvev) ble hentet fra pasienter på First Affiliated Hospital of China Medical University og Liaoning Cancer Hospital mellom januar 2008 og november 2009 med informert samtykke. (Sykehusets Ethical Review Committee ga godkjenning). Ingen av de 84 pasientene i studien mottatt noen kjemoterapi eller strålebehandling før kirurgi. Ti normale lunge prøver ble innhentet fra samtykkende pasienter under operasjonen for benign lungesykdom. For MIR-449 kvantitativ analyse, ble formalinfiksert parafin-embedded vev (FFPETs) fra lungekreft tilfellene valgt tilfeldig fra pasienter ved Liaoning Cancer Hospital januar 2004 til desember 2005 med informert samtykke og godkjenning. Clinicopathologic informasjon var tilgjengelig, og to patologer uavhengig bestemt diagnoser og histologisk grad basert på Verdens helseorganisasjons retningslinjer. Clinicopathologic informasjon og oppfølgingsdata er oppsummert i tabell S1.
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av den lokale Institutional Review Board på First Affiliated Hospital of China Medical University og Liaoning Cancer Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og all klinisk undersøkelse har blitt gjennomført.
Sanntids Kvantitativ Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) av MIR-449a
Total RNA ble ekstrahert fra frisk vev og celler ved anvendelse av Trizol (Invitrogen, NY, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA fra FFPETs ble separert ved hjelp av en miRNA Isolation Kit Am1975 RecoverAllTM (Ambion, Austin, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. MikroRNA kvantifisering av ekstrahert RNA ble utført ved anvendelse av TaqMan mikroRNA Assays (Applied Biosystems, Foster City, USA). RT primer og TaqMan probe av MIR-449a (Applied Biosystems, Foster City, USA) ble brukt for PCR-analyse på en ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, USA) i henhold til produsentens protokoll. RNU6B, som en intern kontroll, ble utført på samme måte som ovenfor. Hver RT-qPCR-analyse ble utført i tre uavhengige forsøk, ved hjelp av tre uavhengige prøver. Den relative mengde av MIR-449a i vev og NSCLC-cellelinjer ble sammenlignet med den midlere ekspresjon av 10 normale prøver, under anvendelse av ligningen RQ = 2
-ΔΔCT [20], [21].
Cell kultur og Transfeksjon
Den menneskelige lungekreft cellelinje A549 og H1299 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Andre NSCLC cellelinjer BE1 og LH7 celler var fra tidligere publisert artikkel av vårt team [8]. A549 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, USA). BE-1, LH-7 og H1299 ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, USA). I hvert tilfelle ble medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, USA), 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin. Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2.
A ligne negativ kontroll, en MIR-449a ligner, en inhibitor negativ kontroll og en MIR-449a-inhibitor, var fra RiboBio (Guangzhou, Kina). A549 og H1299 celler ble transfektert hjelp HiPerFect Transfeksjon Reagens (Qiagen, Hilden, tysk). I korthet, ble kompleksene inneholdende de etterligner eller inhibitorer fremstilles i henhold til produsentens protokoll. Blandingen ble tilsatt til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 100 nM. De fire gruppene var: celler transfektert med en etterligner negativ kontroll, transfektert med en MIR-449a etterligne, transfektert med en hemmer kontroll, transfektert med en MIR-449a hemmer. I tillegg ble en c-Met liten interfererende RNA (siRNA) og en negativ kontroll designet og syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina) og transfektert inn i A549-celler. Sekvensene av c-Met siRNA var 5′-HiG AUA GGA AGA GGG CAU UTT-3 «(forstand), og 5′-AAU GCC CUC UUC CUA UGA CTT-3» (antisense).
celle migrering og invasjon analyser
Transwell kamre (Corning, NY, USA) med en porestørrelse på 8 um ble brukt for cellemigrering og invasjons analyser. Celler ble dyrket til 60% konfluens og transfektert med miRNA eller siRNA. Etter 24 timer, for migrering analysen ble cellene trypsinert og 5 x 10
4 celler ble resuspendert i serumfritt medium og plassert i det øvre kammer. Som en kjemoattraktant, inneholdt den nedre kammer 10% FBS. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 for 16 timer, og nonmigrating celler ble fjernet med en bomullspinne. Migrerte celler vasket to ganger med PBS og fiksert i 100% metanol, farget med hematoksylin. Fargede celler ble sett under et mikroskop (forstørrelse x 200), og antallet migrerte celler ble tellet i fem tilfeldige områder. For invasjon analyser, ble det øvre kammer-belagt med Matrigel blandet med serumfritt medium (fortynnet på 1:03, BD Biosciences, San Jose, USA). Etter størkning av blandingen, 5 x 10
4-celler i serumfritt medium ble plassert i det øvre kammer. Det nedre kammer inneholdt 10% FBS som et kjemotiltrekkende. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 for 18 timer, og ikke invaderende celler ble fjernet med bomullspinne. Invasive celler ble fiksert, farget og telles. Fargede celler ble sett under et mikroskop (forstørrelse x 200), og antallet migrerte celler ble tellet i fem tilfeldige områder. Analysene ble utført i duplikat i tre uavhengige eksperimenter.
RT-qPCR analyse av MIR-449a Target Gene
Total RNA ble ekstrahert fra celler, og cDNA syntese ble utført med PrimerScript RT reagenssettet ( Takara, Dalian, Kina). Det resulterende cDNA ble amplifisert ved bruk av c-Met-primere med SYBR Premiks Ex Taq II (Takara, Dalian, Kina) med parametrene 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 30 sek . Primere for c-Met var F: 5′-GGCTGGTGGCACTTTACTTA-3 «og R: 5′- CTTGTCTCTCGGTTGGCTA-3′, og primere for endogen β-actin ble F: 5»-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 «, R: 5»-ACATGCCGGAGCCGTTGT -3 «. Smelting kurve analyse ble utført ved slutten av syklusene for å sikre spesifisitet. Den relative mengden av c-Met, normalisert til p-aktin, beregnet på grunnlag av ligningen RQ = 2
-ΔΔCT.
Western Blot analyse
Vevsprøver av 0,2 g var bakken til pulver i flytende nitrogen. Tissue pulver og cellene ble ekstrahert med lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 mg /ml aprotinin og 1 mM PMSF) i 30 minutter ved 4 ° C. En lik mengde protein ble separert på 10% SDS-PAGE-geler. Anti-c-Met (21220, Signalway antistoff, Maryland, USA), anti-MMP2 (sc-13595, Santa Cruz, CA, USA), anti-MMP9 (sc-13520, Santa Cruz, CA, USA), anti- β-Actin (sc-1616, Santa Cruz, CA, USA) ble brukt fulgt produsentens instruksjoner. Bilde J programvare (National Institutes of Health, Md, USA) ble brukt til å måle intensiteten av proteinbåndene.
Fluorescent reporter analysen
For å utføre den fluorescerende reporter analysen er følgende primere ble anvendt for å amplifisere den 3’UTR av c-Met-gen fra humant cDNA (NM_000245).: forover primer 5′-GATCCTGCTAGTACTATGTCAAAGCAACAGTCCACACTTTGTCCAATGGTTTTTTCACTGCCTGAG -3 «, revers primer 5′-AATTCTCAGGCAGTGAAAAAACCATTGGACAAAGTGTGGACTGTTGCTTTGACATAGTACTAGCAG-3»
plasmidet som inneholdt c-Met 3’UTR til et fluorescerende reporter ble bygget (Sauer Biotechnology Inc, Kina). A549-celler ble sådd på 48-brønners plater, dyrket over natten, deretter kotransfektert med etterligne kontroll, MIR-449a ligner, inhibitor kontroll, MIR-449a-inhibitor etterfulgt av pcDNA3 /EGFP-c-Met 3’UTR reporter vektor etter 24 timer. Den forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) aktivitet ble normalisert til rødt fluorescerende protein (RFP) aktivitet. Etter 72 timer ble proteinene ble ekstrahert, og det fluorescens spektrofotometer F-4500 (Hitachi, Japan) ble brukt for å bestemme fluorescens-intensitet. Analyser ble utført i duplikat i tre uavhengige eksperimenter.
Statistical Analysis
SPSS13.0 statistisk programvarepakke (SPSS, Chicago, USA) ble anvendt for statistisk analyse. For RT-qPCR, uttrykket nivået av MIR-449a i lungekreft og paret NATS ble log2 forvandlet. Alle verdier ble angitt som middelverdi med standardavvik (SD). En sammenkoblede-samples t-test ble brukt til å analysere forskjeller i MIR-449a uttrykk mellom lungekreft og matchet NAT. En chi-kvadrat test ble brukt til å analysere forholdet mellom MIR-449a uttrykk nivåer og clinicopathologic tegn. Mann-Whitney U-test ble brukt til å analysere rangert data for histologisk grad og patologisk stadium. Spearman bestemt sammenhengen mellom MIR-449a uttrykk og patologisk stadium, og lymfeknute status. Kaplan-Meier-metoden ble brukt for overlevelseskurver, og en log-rank-test ble anvendt for sammenligning. Cox regresjon ble brukt for å undersøke effekten av covariables. Resultatene av celleforsøk ble analysert ved en uavhengig prøver T-test og enveis ANOVA.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1.. MiR-449a ble nedregulert i NSCLC Vev og Associated med lymfeknutemetastase
Vi oppdaget uttrykk for MIR-449a med RT-qPCR på 84 friske NSCLC vevsprøver med tilkoblede NAT. Sammenlignet med NAT, ble uttrykket nivået av MIR-449a (77/84) signifikant nedregulert i NSCLC vev (paret T-test,
P =
0.004,
t
= -2,997, figur 1A). Nedregulering av MIR-449a oppdaget av RT-qPCR hos NSCLC vev, ble også vist i boksplott (figur 1B). RNU6B ble anvendt som en indre standard.
A. Sammenkoblet stolpediagram indikerer nedregulering av MIR-449a i NSCLC vev. RT-qPCR resultat av MIR-449a i 84 friske NSCLC vev og sammenkoblede NAT. Tredoble eksperimenter ble gjennomført for hver prøve, ble den relative uttrykket beregnes ved hjelp av ligningen RQ = 2
-ΔΔCT. Sammenlignet med NAT, ble Mir-449a signifikant nedregulert i NSCLC prøvene (paret T-test,
P =
0.004,
t
= -2,997). B. Boksplott viser nedregulering av MIR-449a i NSCLC vev. C. Sammenheng mellom MIR-449a uttrykk nivå og patologisk stadium, lymfeknute status av 84 friske parvise prøver fra lungekreftpasienter. D. Kaplan-Meier kurve for 5-års overlevelse priser (14,29%) av 70 FFPET prøver fra lungekreftpasienter. E. I 70 FFPET prøver fra lungekreftpasienter, Kaplan-Meier kurve for lungekreftpasienter som er klassifisert som høy eller lav MIR-449a uttrykk, lavt uttrykk nivå av MIR-449a var signifikant korrelert med pasientens dårlig overlevelse (log-rank test,
P
. 0,001)
for å fastslå effekten av MIR-449a uttrykk på startfasen og progresjon, ble NSCLC pasienter delt inn i to grupper, lav og høy uttrykk, i henhold til det betyr uttrykket nivået av MIR-449a i kreftvevet (log2 verdi, median = 1,47). Sammenheng mellom MIR-449a uttrykk og clinicopathologic variabler av lungekreft er vist i tabell ble observert 1. Vesentlige korrelasjoner mellom MIR-449a uttrykk og patologisk stadium (
P
= 0,012) (Mann-Whitney U-test). I 17 tilfeller ble diagnostisert med patologisk stadium III, 13 (76,47%) tilfeller hadde lav uttrykk for MIR-449a, mens den lave uttrykk hastigheten var 16/32 (50,00%) av patologisk stageII og 13/35 (37,14%) av patologisk stadium I (figur 1C). Endringer i MIR-449a uttrykk ble også signifikant assosiert med lymfeknutemetastase. I 40 tilfeller av lungekreft med lymfeknutemetastaser, 25 (62,5%) hadde lav uttrykk for MIR-449a. I motsetning i 44 tilfeller uten lymfeknutemetastaser, bare 17 tilfeller (38,64%) hadde lav MIR-449a uttrykk (
P
= 0,029, chi-kvadrat test, figur 1C). Ingen korrelasjon ble observert mellom MIR-449a uttrykk og kjønn, alder, histologi type eller histologisk grad.
For bedre å forstå sammenhengen mellom MIR-449a uttrykk og patologisk stadium, lymfeknutemetastase, den Spearman korrelasjon test ble anvendt for videre analyse. Resultatene viste en negativ sammenheng mellom MIR-449a uttrykk og patologisk stadium (r = -0,276,
P
= 0,011), og lymfeknutemetastase (r = -0,238,
P
= 0,029 ).
2. Sammenheng mellom MIR-449a Expression og prognose av lungekreftpasienter
MiR-449a uttrykk ble oppdaget i FFPETs av 70 lungekreftpasienter med oppfølgingsdata (Tabell S1). Den total overlevelse kurven i Figur 1D viser en fem-års overlevelse rate på 14,29% i 70 tilfeller. Ifølge Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, NSCLC pasienter med lav MIR-449a uttrykk hatt en vesentlig dårligere prognose enn de med høy MIR-449a uttrykk (log-rank test,
P
0,001; figur 1E). I tillegg til Mir-449a uttrykk, andre clinicopathologic faktorer som histologisk grad (log-rank test,
P
= 0,004), patologisk stadium (log-rank test, P 0,001) og lymfeknutemetastase (log -rank test,
P
0,001) ble også assosiert med prognose for lungekreftpasienter i henhold til overlevelsesanalyse. Univariate Cox proporsjonal hazard regresjonsanalyse ble utført for å finne den mest sterkt prediktiv faktor for dårlig prognose av pasienter med lungekreft. Vi fant ut at Mir-449a uttrykk (
P
0,001, hazard ratio [HR] = 0,345), histologisk grad (
P
= 0,002, HR = 1,725), patologisk stadium (
P
0,001, HR = 3,254), og lymfeknutemetastase (
P
0,001, HR = 6,535) var prediktive faktorer for dårlig prognose for pasienter med lungekreft (tabell 2) .
multivariat Cox proporsjonal hazard regresjonsanalyse viste at uttrykket nivået av MIR-449a (
P
= 0,041, HR = 0,558, 95% konfidensintervall [CI]: 0.319- 0,976) var en viktig gunstig prognostisk faktor uavhengig av andre clinicopathologic faktorer, for eksempel patologisk stadium (
P
= 0,002, HR = 2,162, 95% KI: 1,338 til 3,491), lymfeknutestatus (
P
= 0,001, HR = 3,104, 95% KI:. 1,615 til 5,966; Tabell 2)
3. MiR-449a ble nedregulert i NSCLC cellelinjer og Berørt migrasjon og invasjon
in vitro
Vi har undersøkt uttrykk for MIR-449a i fire NSCLC cellelinjer: A549, BE-en, LH 7, H1299 ved hjelp av RT-qPCR. Som vist i figur 2, sammenlignet med den midlere ekspresjon av 10 normale lunge prøver, alle 4 cellelinjer viste betydelig nedregulering av MIR-449a. I tillegg, ekspresjon av MIR-449a ble funnet å være betydelig redusert i meget inngripende NSCLC-cellelinje BE1 sammenlignet med mindre invasiv LH7 cellelinje.
Den relative mengde av MIR-449a i 4 NSCLC-cellelinjer ble sammenlignet til at uttrykket nivået på 10 normale lunge prøver basert på ligningen RQ = 2
-ΔΔCT.
MiR-449a uttrykk i både vev og NSCLC cellelinjer antydet at Mir-449a ble assosiert med spredning. Derfor, vi utforsket de potensielle effektene av MIR-449a om migrasjon og invasjon i lunge kreftceller. Ifølge uttrykk for MIR-449a i NSCLC cellelinjer, valgte vi A549 og H1299 cellelinjer, som hadde relativt moderat uttrykk for MIR-449a, for Transwell analyser. For å bestemme effekten av MIR-449a på celle migrasjon og invasjon, A549 og H1299 celler ble transfektert med ligne kontroll, MIR-449a etterligne, hemmer kontroll og MIR-449a hemmer. For å sikre transfeksjon effekter, ble RT-qPCR utført for å identifisere uttrykk for MIR-449a etter 24 timer (Figur S1). Den relative ekspresjon av MIR-449a i A549 og H1299-celler transfektert med en etterligner ble betydelig økt.
Som vist i figur 3, sammenlignet med kontroller, trekk egenskapene til celler transfektert med den MIR-449a mimic ble redusert med ca 42,9% for A549 celler og 36,4% for H1299 celler. I motsetning til celler i MIR-449a-inhibitor gruppen hadde høyere migrering evne enn kontrollene, de migrerte celler økte med 62,5% for A549 og 48,5% for H1299-celler (figur 3). Matrigel invasjons analyser ble også utført, og eksogent økning av MIR-449 uttrykk redusert antall invasive celler signifikant med 44,8% for A549 og 38,2% for H1299-celler (figur 3). Antallet invasive celler øker betydelig gjennom 58,1% for A549 og 46,9% for H1299 celler når transfektert med MIR-449a inhibitor (figur 3)
A . B. MiR-449a regulert celle migrasjon og invasjon. A549 /H1299 celler ble transfektert med Mimic Control, MIR-449a Mimic, Inhibitor Kontroll og MIR-449a Sperre, deretter utsatt for migrasjon og invasjon analyser som beskrevet i kapittel 2. Migrasjon /invasive celler ble fotografert for representative bilder etter farging med haematoxylin. Original Forstørrelse, × 200. C D. Gjennomsnittlig migrerte /invasiv celle nummer fra tre uavhengige eksperimenter ble vist i stolpediagram, gjennomsnitt ± SD. * P. 0,01
4. Mir-449a Målrettet c-Met
For å finne mulige målgener av MIR-449a i NSCLC celler, brukte vi tre algoritmer for å analysere potensielle mål av MIR-449a: TargetScan 5.2 (juni 2011), Miranda (august 2010 ), og Diana-mikrotiterplater (juli 2011). I potensielt mål listen, c-Met, som har to forutsagte bindingsseter med MIR-449a er implisert som en nøkkel-mediator av cellemigrering, invasjon og metastase i tumorigenese og tumorprogresjon i en rekke tumorer, inkludert NSCLC (figur S2). Vi undersøkte om c-Met ble regulert av MIR-449a i NSCLC vevsprøver og
in vitro
. For å bestemme den kliniske relevansen av MIR-449a og c-Met, valgte vi 27 parene fra de 84 friske NSCLC vevsprøver med tilkoblede NAT ifølge bety uttrykk nivået av MIR-449a i 84 kreftprøver vev, inkludert 13 MIR-449a lav expressers og 14 MIR-449a høye expressers. Som vist i figur 4 A og B, ble western blot utført for å undersøke ekspresjon nivået av c-Met i disse 27 par prøver, c-Met ekspresjon var signifikant høyere i NSCLC-vev sammenlignet med NAT (paret t-test,
P
0,001,
t
= 6,352), mens MIR-449a ble nedregulert i samme panel av NSCLC vev som påvises i Resultat 1 (Figur 4C). Videre svulster med lavt uttrykk nivå av MIR-449a avdekket høye konsentrasjoner av c-Met, mens svulster med høy uttrykk nivå av MIR-449a utført lave konsentrasjoner av c-Met (
P
= 0,037, figur 4D) . Disse resultatene indikerte at en invers korrelasjon mellom MIR-449a og c-Met ekspresjon i vevsprøver
A og. B. Uttrykk av c-Met oppdaget av Western Blot i 27 par med friske NSCLC prøvene. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Intensiteten av proteinbånd ble målt, y-aksen av boxplot var basert på OD. Verdier av Western Blot. C. Relativ uttrykk for MIR-449a i samme panel av 27 sammenkoblede NSCLC prøvene. D. Uttrykk av c-Met ble vist gruppert etter gjennomsnitts uttrykket nivået av MIR-449a i 84 kreftprøver vev. Uttrykket av c-Met i MIR-449a lave expressers var høyere enn Mir-449a høye expressers. Intensiteten av proteinbånd ble målt, y-aksen av boxplot var basert på OD. Verdier av Western Blot (
P
= 0,037).
For å finne ut om MIR-449a målrettet c-Met
in vitro
, vi transfekterte A549 celler og H1299 celler med MIR-449a ligne eller hemmer og oppdaget nivået av c-Met mRNA ved hjelp av RT-qPCR på 48 timer etter transfeksjon. Overekspresjon av MIR-449a betydelig redusert c-Met mRNA sammenlignet med kontroller, mens hemming av MIR-449a resulterte i en økning av c-Met mRNA (figur 5A). Western blot-analyse ble utført for å teste protein ekspresjon av c-Met. Resultatene viste overekspresjon av MIR-449a førte til en dramatisk reduksjon i c-Met-protein, mens reduksjon av MIR-449a merkbart øket c-Met-protein (figur 5B). Resultatene indikerte at Mir-449a regulert ekspresjon av c-Met både på mRNA og protein nivå.
A. Effekten av MIR-449a på c-Met mRNA i NSCLC celler. A549 /H1299 celler ble transfektert med en Mimic Control, en Mir-449a Mimic, en inhibitor kontroll og en MIR-449a Sperre, deretter RNA ble ekstrahert og utsatt for RT-qPCR. Den relative mengden av c-Met, normalisert til p-aktin, ble sammenlignet med Mock gruppe basert på ligningen RQ = 2
-ΔΔCT. * P 0,01. B. Effekten av MIR-449a på c-Met protein i NSCLC celler. A549 /H1299 celler ble transfektert med en etterligner Control, en Mir-449a etterligne, en inhibitor kontroll og en MIR-449a hemmer. Etter 48 timer ble cellulært protein ekstrahert og utsatt for Western Blot-analyse av c-Met. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. C. MiR-449a bindingssteder i 3’UTR av c-Met ble vurdert ved hjelp av fluorescerende reporter analyser. Med en vektor som inneholder c-Met 3′-UTR ble A549 celler transfektert med en etterligner Control, en Mir-449a etterligne, en inhibitor kontroll og en MIR-449a Sperre, deretter protein ekstrahert og fluorescensintensiteten ble bestemt. * P. 0,05
For å finne ut om c-Met var et direkte mål på MIR-449a, ble fluorescerende reporter analyser utført. 3′-UTR av c-Met med to spådd bindingsseter for Mir-449a ble klonet inn et fluorescerende reporter vektor. Som vist i figur 5C, oppregulering av MIR-449a reduserte intensiteten av EGFP fluorescens i celler transfektert med en vektor inneholdende c-Met 3′-UTR sammenlignet med kontroller, mens i den MIR-449a-inhibitor gruppe intensiteten av fluorescens-EGFP økt betydelig . Disse resultatene indikerer at Mir-449a binder seg til c-Met 3’UTR regionen direkte.
For ytterligere å bekrefte om MIR-449a regulert migrasjon og invasjon gjennom målretting c-Met, ble c-Met siRNA brukes til taushet c -Met uttrykk. Western blot-analyse ble brukt for å bekrefte resultatene (figur 6A). Med nedstrøms endringer i MMP2 og MMP9 (figur 6B), ko-transfeksjon av MIR-449a-inhibitor og c-Met siRNA opphevet virkningen av MIR-449a på migrering og invasjon i A549-celler (figur 6C 0,01
Diskusjoner
Vi fant at Mir-449a var signifikant nedregulert i NSCLC vev og cellelinjer, i samsvar med rapporten at MIR-449 ble redusert i flere menneske svulster og kreft cellelinjer [16]. I tillegg Liang og kolleger fant at MIR-449 ble påvist i human lunge, testis, og egglederne, men ikke andre normale menneskelige vev [22], [23]. Videre nedregulering av MIR-449 ble observert i magekreft. Uttrykket av MIR-449 var lav eller umulig å oppdage i 8 av 10 mage kreft vev, selv om ingen korrelasjon ble observert mellom reduksjonen i Mir-449 uttrykk og kliniske kjennetegn ved magekreft i de 10 parene av vev [13]. Nylig, Jeon og kolleger fant at MIR-449a /b har redusert uttrykk i lungekreft vev, med målet genet HDAC1 overexpressed på mRNA nivå [15]. Men data fra et stort utvalg satt på uttrykket status av MIR-449 og dens relevans for clinicopathologic funksjoner er uklart. Her har vi brukt 154 NSCLC-prøver (inkludert 84 ferske prøver og 70 FFPET prøver) for å detektere potensialet forholdet mellom ekspresjonsstatus av MIR-449a og forskjellige clinicopathologic egenskaper, så vel som overlevelsen hos pasienter med NSCLC. Ifølge RT-qPCR resultatene på 84 tilfeller av ferske NSCLC vev og sammenkoblede NAT, ble Mir-449a signifikant nedregulert i NSCLCs sammenlignet med sammenkoblede NAT. Statistisk analyse ble utført, og et lavt nivå av MIR-449a syntes å være korrelert med avansert patologisk stadium, og lymfeknutemetastase. Så vidt vi vet, vår analyse indikerte for første gang at Mir-449a ble assosiert med lymfeknutemetastase. Videre data fra 70 FFPETs indikerte at lungekreftpasienter med lav MIR-449a uttrykk hadde dårlig prognose. Multivariat Cox regresjonsanalyse viste at lavt uttrykk nivå av MIR-449a ble uavhengig assosiert med dårligere prognose samt avanserte patologisk stadium og lymfeknutemetastaser. Disse resultatene antydet at Mir-449a kan være et nyttig prognostisk prediktor uavhengig av andre clinicopathologic faktorer.
De nøyaktige molekylære mekanismer for endret uttrykk av MIR-449 i tumorer er fortsatt ukjent. Mir-34 familien som deler samme frø sekvens med MIR-449 er tumor-undertrykkende og metylert i lungekreft [24], [25], [26]. Videre er uttrykk for MIR-449 inaktivert av histon H3lys27 (H3K27mes) og reversert av epigenetiske medisiner for histonmodifikasjonene [16]. Til sammen kan avvik epigenetiske hendelser være viktig i mekanismene bak MIR-449 feilregulering. MiR-449a ligger i første intron av CDC20B på kromosom 5q11 som ofte er et område av abnormitet i lungekreft [27], [28].
