Abstract
Formål
Den aktuelle studien undersøker effekten av feber-range hypertermi og mild hypotermi på humane kreftceller med fokus på celle levedyktighet, spredning og HSP90 uttrykk.
Materialer og metoder
A549 og H1299 lungekarsinom, MCF7- bryst adenokarsinom, U87MG og T98G glioblastom, DU145 og PC3 prostata carcinom og MRC5 normale føtale lungefibroblaster cellelinjer ble studert. Etter 3 dagers eksponering for 34 ° C, 37 ° C og 40 ° C, ble cellelevedyktigheten bestemt. Celleproliferasjon (Ki67 indeks), apoptose (caspase 9) og HSP90 uttrykk ble studert av konfokalmikroskopi.
Resultater
Livskraftig /spredning eksperimenter viste at MRC5 fibroblaster var ekstremt følsomme for hypertermi, mens de var den mest motstandsdyktig mot hypotermi. T98G og A549 var termotolerante, de resterende blir termo-sensitive i varierende grad. Likevel, som en universell virkning, hypotermi redusert levedyktighet /proliferasjon i alle cellelinjer. Hypertermi kraftig indusert caspase 9 i U87MG mest termo-sensitive cellelinje. I T98G og A549 termotolerante cellelinjer, nivåene av caspase 9 avvist. Videre hypertermi sterkt indusert av HSP90 nivåer i T98G, mens en kraftig nedgang ble registrert i termo-sensitive PC3 og U87MG cellelinjer. Hypertermi sensibilisert termo-sensitive kreftcellelinjer til cisplatin og temozolomid, mens dens sensibiliserende virkning ble redusert i termotolerante cellelinjer.
Konklusjoner
Eksistensen av termotolerante og termo-sensitive kreft cellelinjer ble bekreftet, noe som ytterligere fremmer forskning for å klassifisere menneskelige svulst termisk forkjærlighet for pasientutvelgelse i kliniske studier. Av interesse, mild hypotermi hadde en universell undertrykkende effekt på kreftcelle spredning, noe som ytterligere støtter radio-allergi hypotese gjennom reduksjon av oksygen og metabolske krav
Citation. Kalamida D, Karagounis IV, Mitrakas A, Kalamida S, Giatromanolaki A, Koukourakis MI (2015) Fever treet Hypertermi vs. Hypotermi Effekt på Cancer Cell levedyktighet, spredning og HSP90 Expression. PLoS ONE 10 (1): e0116021. doi: 10,1371 /journal.pone.0116021
Academic Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians-universitetet, TYSKLAND
mottatt: 12 august 2014; Godkjent: 02.12.2014; Publisert: 30 januar 2015
Copyright: © 2015 Kalamida et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. studien er finansiert av opplæring og livslang læring – ARISTEIA prosjekt, kode nr 520, ESPA 2007-2013, GGET avgjørelse nummer 12605 /26.09.2012. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft celler, på samme måte som en hvilken som helst annen celle og levende system, svare på små endringer i utvendig temperatur ved aktivering av homeostatiske biologiske mekanismer i et forsøk på å opprettholde en tolerant intracellulært miljø og forhindre død. Temperaturer over 41 ° C er giftige både til tumorvaskulaturen og til kreftcellene selv, og brukes til å varme tumorer (Oncothermic hypertermi) i den hensikt å undertrykke deres vekst, oppnå regresjon eller bevisst dem til radioterapi og kjemoterapi [1]. Randomiserte studier har vist signifikant forbedring av lokale kontrollrate i sarkomer som gjelder regional hypertermi kombinert med kjemoterapi [2].
Likevel temperaturer under 41 ° C, ved den såkalte feber-range hypertermi, har også en direkte effekt på kreft celler og vev biologi, allergifremkallende svulster til strålebehandling og kjemoterapi. Hele kroppen hypertermi mellom 38-40 ° C har vært brukt i behandling av utbredt metastatiske tumorer i kombinasjon med kjemoterapi [3, 4]. Økt blodstrøm som gir økt tumor oksygenering og kjemoterapi tilgjengelighet er trolig en av de viktigste mekanismene for synergisme [5, 6]. Protein skader er også en viktig virkning av temperaturer over 39 ° C, men de nøyaktige veier av celledreping forbli unnvikende [7]. Inhibering av homolog rekombinasjon er også foreslått som en mekanisme for tumor chemosensitization [8].
I tillegg mild hypertermi som en supplerende terapi til kreftimmunterapi har blitt presentert av flere prekliniske og kliniske studier, ved å forbedre antitumor immunresponser. Den hyperthermia- indusert forbedret immunrespons omfatter HSP generasjon, antigenpresenterende celler aktivering og lymfocytter menneskehandel endringer [9]. Videre viser ytterligere bevis på at fysiologiske responser til hypertermi påvirker mikromiljøet av tumoren mest sannsynlig ved en mekanisme som innebærer temperaturfølsomme sjekkpunkter som regulerer tumor vaskulær perfusjon, lymfocytter handel, inflammatorisk cytokin ekspresjon, tumor metabolisme, og sist men ikke minst, både adaptive og medfødte immun handling [10]. Økt aktivitet av naturlige drepeceller mot tykktarmskreftceller har blitt bekreftet i mus når temperaturen ble økt ved 39,5 ° C [11].
Heat-sjokk proteiner (HSP) er kraftig oppregulert etter hypertermiske forhold, som deres høyere affinitet til akkumuler utfoldete proteiner frigjør HSF-en transkripsjonsfaktor bundet til HSP som går inn i kjernen for å initiere HSP gentranskripsjon [11]. HSP beskytte cellene mot varmeindusert protein skade ved sin chaperon aktivitet. Imidlertid kan langvarig oppvarming føre til HSP nivåer regresjon til normale nivåer. Tvert imot, kan høye temperaturer over en terskel hemme HSP syntese, noe som favoriserer celledød [12]. I flere detaljer, har HSP90 /Hsp70 baserte anstand maskiner vist seg å kontrollere signalisering av protein funksjon, smugling og omsetning. Det har vært også nylig foreslått at HSP90 og Hsp70 regulere behandling av skadede og unormale proteiner for degradering via ubiquitin-proteasome veien. Studiet av HSP90 i særdeleshet, er meget viktig, gitt at, hittil vitenskapelig interesse var fokusert på reguleringen av dens «typiske klient proteiner, men de senere data tyder på at HSP90 samvirker dynamisk med forskjellige proteiner, som ikke er klassiske HSP90-klienter. Derfor er HSP90 rolle i signalisering og regulering av kvalitetskontroll og skjebnen av skadede proteiner ekstremt viktig. [13]
I alle fall kan kreftcelleresponsen på hypertermi avhenge av både temperaturnivåer og eksponeringstider, men ytterligere omgivelsesforhold og, i hvert fall på den celletype som undersøkes. I denne studien, undersøkte vi effekten av feber toner hypertermi på et bredt spekter av kreftceller, som gir bevis for at dens effekt på levedyktigheten og proliferasjon er celle-avhengig. Hypotermi, en langt mindre studert tilstanden i kreftcellesystemer, ble også undersøkt. Effekten av hyper- og hypotermi på HSP90 uttrykk ble videre undersøkt. Til slutt ble hyperthermic chemosensitization undersøkt i to glioblastom cellelinjer (T98G og U87MG) og to lungekreftcellelinjer (A549 og H1299). T98G og A549, de eneste termotolerante cellelinjer ble undersøkt i forhold til to representative, termo-sensitive cellelinjer av samme tumor type, U87MG og H1299, henholdsvis, med de riktige cellegift for hver type kreft, sammen med mild hypertermi, for å undersøke en mulig sensibilisering eller motstand.
Materialer og metoder
Cellekulturer kulturer~~POS=HEADCOMP
A549 (human lunge adenokarsinom, CLS GmbH, Tyskland), H1299 (human ikke-småcellet lungekreft, ATCC), MCF7- (human bryst adenokarsinom, CLS GmbH, Tyskland), U87MG (human glioblastom-astrocytom, CLS GmbH, Tyskland), DU145 (human prostata carcinom, CLS GmbH, Tyskland), PC3 (human prostata adenokarsinom, CLS GmbH, Tyskland) og MRC5 (human foster lunge fibroblaster, CLS GmbH, Tyskland) cellelinjer ble dyrket ved hjelp av DMEM basal medium (31885-023, Gibco) og T98G (human glioblastoma multiforme, ATCC) cellelinje ble dyrket i MEM basal medium (10370-047, Gibco). Begge basaldyrkningsmedier ble supplert med 10% FBS (FB-1000/500, Biosera), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (15140-122, Gibco) og 2 mM L-glutamin (25030, Gibco). Celler ble opprettholdt ved standardbetingelser, 37 ° C, 5% CO2 i fuktig atmosfære og ble brukt når det når 70-90% konfluens.
Proliferation Assay
Evnen av celleproliferasjon under forskjellige inkubering temperaturer ble testet ved en proliferasjonsanalyse. Celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 1000 celler /brønn, platene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer for å lette tilslutning og normal vekst og deretter ble plassert ved 34 ° C, 37 ° C og 40 ° C, henholdsvis for tre påfølgende dager. Proliferations analyser for alle de undersøkte cellelinjer og veksttemperaturer ble utført samtidig. Celleproliferasjon målinger ble utført i en 24 timers intervall med AlamarBlue celleviabilitet Reagens (DAL1100, Invitrogen) målt på 540 nm eksitasjon og 590nm avleses emisjonsbølgelengder, i en FLUOstar Omega mikroplateleser (BMG LABTECH). Den AlamarBlue assay (DAL1100, Invitrogen) er en pålitelig metode for cellelevedyktighet [14]. Denne analyse, ved hjelp av den metabolske aktiviteten av cellene til å redusere resazurin (oksidert form, 7-hydroksy-3H-fenoksazin-3-1-10-oksyd) til resorufin, kvantifiserer antall celler med aktiv mitokondrier, ettersom Resazurin reduksjon blir utført av mitokondrie enzymer [15]. Eksperimentene ble utført tre ganger for å bekrefte viktigheten av resultatene.
Western Blot analyse
glioblastoma cellelinjer (U87MG og T98G) ble dyrket under standard betingelser, som tidligere nevnt. Disse cellelinjene ble likeledes inkubert ved 34 ° C og 40 ° C i 72 timer. Celler ble lysert ved anvendelse av en sukrose-lyseringsbuffer supplert med en protease og fosfatase-inhibitor cocktail (Cell Signaling). Proteinkonsentrasjoner ble målt basert på BCA-proteinanalysesettet (Pierce Thermo Scientific, USA). Spesifikke kanin polyklonale primære antistoffer ble benyttet for Western blot-analyse, anti-HSP90 (1: 1000; ab13495, Abcam) og anti-Caspase9 (1: 1000; ab47537, Abcam).
Hele fraksjonsprøver ble separert på diskontinuerlig SDS-geler ved å bruke 10% separerende og 5% stabling geler. Førti mikrogram celleekstrakter ble lastet på gelen. Immunoblotting ble utført anvendelse av PVDF-PSQ-membraner (Millipore Corp.). Etter et blokkeringstrinn med 5% ikke-fett tørrmelk i 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 inneholdende 0,1% (v /v) Tween 20 (TBS-T) ved romtemperatur (RT) i 2 timer, ble membranene hybridisert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer. Membranene ble deretter hybridisert i 2 timer ved 37 ° C med det sekundære antistoff, geit polyklonalt til kanin IgG (H + L) -HRP (1: 3.000, Biorad, 1706515, USA) og til slutt utviklet i Amersham ECL Western blotting påvisningsreagenser og analysesystem (RPN2209, GE Healthcare) utnytte Chemidoc MP Imaging system (Biorad, USA).
hyperthermic chemosensitization eksperimenter
i chemosensitization eksperimenter, 1000 celler /brønn ble belagt i en 96-brønns plate i passende kulturmediet. Celler ble inkubert med klinisk etablerte medikamenter; lunge kreft cellelinjer: A549 og H1299 med 100 μΜ av Cisplatin og glioblastom cellelinjer: T98G og U87MG med 500 μΜ av temozolomid. Cellene, samtidig med behandling, ble inkubert i 24 timer ved henholdsvis 37 ° C og 40 ° C, mens cellenes levedyktighet ble vurdert etter 24 timer inkuberingsperiode ved AlamarBlue-analyse og cellene overlevelsesprosentandeler (%) ble beregnet. Statistisk analyse av 2-veis ANOVA test (n≥ 10 målinger for hver gruppe, ** p = 0,0037 for 5a p = 0,0097 for 5b, noe som er statistisk signifikant i begge tilfeller), og graf presentasjon har blitt utført ved bruk av GraphPad Prism Version 5.01 statistisk pakke (GraphPad Software Inc., USA). Eksperimentene ble utført tre ganger for å bekrefte viktigheten av resultatene.
Confocal immunfluorescens og Bildeanalyse
For immunfluorescens farging ble cellene dyrket på No. 1.5 dekkglass, fiksert i 3,7 % paraformaldehyd /PBS pH 7,4 i 20 minutter ved 37 ° C og deretter permeabilisert i PBS /0,1% volum /volum Triton X-100, pH 7,4 i 5 minutter ved romtemperatur. I tillegg ble cellene blokkert i PBS /5% vekt /volum BSA, pH 7,4 i 20 minutter og farget med forskjellige primære antistoffer: anti-Ki67 musemonoklonalt (1: 150; DAKO) anti-Caspase9 kaninpolyklonalt (1: 100; Abcam ), anti-HSP90 kaninpolyklonalt (1: 100; Abcam), i 1 time ved RT. Celler ble vasket i PBS, pH 7,4, inkubert med passende CF 488 og 564 sekundære antistoffer ved RT og DNA ble motfarget med Hoechst 33342 (1 ug /ml; Sigma-Aldrich). Etter siste vask dekk ble montert i hjemmelaget Mowiol monteringsmedium. Imaging ble utført på en tilpasset Andor revolusjon Spinning Disk Confocal System bygget rundt et stativ (IX81, Olympus) med et 60x objektiv og et digitalt kamera (Andor Ixon + 885) (CIBIT Facility, MBG-DUTH). Bilde Kjøpet ble utført i Andor IQ to programvare. Optiske seksjonene ble registrert hver 0,3 mikrometer. Alle Konfokalmikroskopi bildene som presenteres i dette arbeidet er 2D maksimal intensitet projeksjoner av z-stack bilder (ImageJ 1.47v National Institute of Health, USA).
Bilde intensitet analyse for de oppnådde datasettene er utført ved hjelp av ImageJ 1,47 v (National Institute of Health, USA) programvare. Bildebehandlings makroer er tilpasset utviklet for å kvantifisere nivåene av de undersøkte proteiner (% fluorescens intensitet) for caspase 9 og HSP90 i området av interesse.
Bildeanalyse og kvantifisering av Ki67 ekspresjon i kjernen har er utført ved hjelp av tilpassede utviklet makroer i ImageJ programvare 1.47v (National Institute of Health, USA). En populasjon av n celler (n≥ 20) har blitt analysert, for Ki67 kvantifisering. Cellene ble kategorisert i tre klasser, i henhold til deres pixel enheter, som representerer Ki67 ekspresjonsnivåer. Klasse Jeg var den lavere klasse inkludert celler med 1000-5000 piksler i den grønne kanalen (Ki67 bildebehandling) og klasse III var den høyere klasse inkludert celler med mer enn 7501 piksler, mens klasse II inkluderte 5001-7500 verdier, henholdsvis.
De to-dimensjonale (2D) gjennomsnittlig projeksjonen av z-stack bildene ble kvantifisert ved hjelp av en standard størrelse firkantet område hvor integrerte intensitetsverdiene er målt. Statistisk analyse av 2-veis ANOVA test (n≥ 20 celler for hver gruppe, * p 0,0001) og graf presentasjonen har blitt utført ved hjelp av GraphPad Prism versjon 5.01a statistikkpakke (GraphPad Software Inc., USA)
Resultatene
Effekt av hyper- og hypotermi på cellevekst
etter en tre dagers inkuberingsperiode henhold feber rekkevidde hypertermi, endring av celleproliferasjon /levedyktighet var sterkt avhengig av hver cellelinje ( Figur 1). Den normale fibroblast cellelinje, MRC5, var ekstremt følsomme for hypertermi, som viser et utbredt celledød virkning. U87MG glioblastoma cellelinje var også svært følsomme for hypertermi, som induserte en 10-gangers reduksjon av cellevekst. Prostata DU147 og PC3, samt lunge H1299 og bryst MCF7 kreftcellelinjer ble også termo-sensitive. Tvert imot, T98G glioblastom og A549 lungekreftcellelinjer ble termotolerante, viser en vekst økning på 1,87 og 1,18 ganger, henholdsvis.
% endring av relative fluorescerende enheter (RFUs) som er spilt inn med AlamarBlue analyse, etter 3 dager med eksponering av celler til hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normothermia (37 ° C).
nedkjøling ved 34 ° C, på den annen derimot hadde en ganske homogen effekt, noe som resulterer i reduksjon av både de normale MRC5 fibroblaster og av alle kreftcellelinjer levedyktighet (fig. 1). Denne reduksjonen lå mellom 1,23 og 7,40 ganger, i DU145 og U87MG-cellelinjer, henholdsvis, sammenlignet med kontroll (37 ° C) celler, som beregnet på den tredje dag av inkubasjon.
Effekt av hyper- og hypotermi videre Ki67-indeks spredning
Gitt at celleproliferasjon /levedyktighet bestemt ved AlamarBlue assay er et resultat av kombinerte sprednings og dødsfall, vi videre undersøkt celleproliferasjon ved hjelp indeksen Ki67 proliferasjon. Etter 3 dager med celle inkubasjon, hypertermi resultert i en økt andel av cellene i klasse III, inT98G og (henholdsvis 1,3 og 1,4 ganger) A549 cellelinjer i forhold til normothermia. Dette falt med 1,1 til mer enn 45 ganger i resten av cellelinjer (Fig. 2a). Karakteristiske og representative konfokale bilder av Ki67 nukleær farging og endres etter eksponering for hypertermi er vist i fig. 2b
2a.: Endring av Ki67-indeks spredning klasse etter tre dagers eksponering av celler til hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normothermia (37 ° C). 2b. Representative konfokal microcopy bilder som viser atom Ki67-immunfarging endring intensitet etter eksponering for hypertermi (40 ° C)
Hypotermi resulterte i reduksjon av celle akkumulering i klasse III-gruppen ved 1,2 opp til mer enn 45 fold i alle cellelinjer med unntak av DU145 prostatakreft cellelinje, hvor dette ble økt med 1,6 ganger.
Effekt av hyper- og hypotermi på caspase 9 nivåer
Confocal immunfluorescens bilder av caspase 9 ekspresjon i cellelinjer etter eksponering for hypertermi og hypotermi er presentert i fig. 3a. Plott av fluorescens intensitet endringer etter eksponering for hypertermi og hypotermi er presentert i Fig. . 3b og 3c, henholdsvis
3a: Representative konfokal microcopy bilder som viser cytoplasmisk caspase 9 uttrykk endring intensitet etter eksponering for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normothermia (37 ° C) ( forstørrelse x60). 3b, c. Densitometry utført på confocal microcopy bilder av caspase 9 farging etter eksponering for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) i forhold til normothermia (37 ° C)
hypertermi kraftig indusert caspase 9 i U87MG termo-sensitive cellelinje, noe som også viste den dypeste reduksjon av celle levedyktighet i Alamarblue eksperimenter. Av interesse, både T98G og A549 termotolerante cellelinjer, caspase 9 ble redusert med hypertermi, noe som tyder på en apoptose undertrykkende effekt av hypertermi i disse cellelinjene. Den mest termo-sensitive av alle, MRC5 cellelinje, men ikke viser økt caspase 9 nivåer tyder død ved uavhengig av caspase 9 trasé.
Hypotermi indusert caspase 9 i U87MG, DU145 og MCF7 celler, i samråd med redusert levedyktighet, demonstrert i Alamarblue eksperimenter. I resten av cellelinjer, caspase 9 ekspresjon forble stabil eller det ble redusert i tilfellet med T98G celler, noe som tyder på at hvis apoptose trasé blir aktivert ved nedkjøling disse er caspase 9 uavhengige.
Western blot-analyse utført i termo-tolerant T98G og termo-sensitive U87MG glioblastom cellelinjer er presentert i fig. 3d, støtter de tidligere presenterte resultatene. Hypertermi indusert caspase 9 i termosensitive U87MG cellelinje, mens dette ble redusert i termotolerante en, T98G. Hypotermi redusert caspase 9 nivåer i T98G cellelinje, mens ingen tydelig endring ble bemerket i U87MG en.
Effekt av hyper- og hypotermi HSP90 nivåer
Representant konfokal mikroskopi og immunfluorescens bilder av effekten av hypertermi og av hypotermi på HSP90 på cellelinjer som er vist i fig. 4a. Plott av fluorescensintensiteten endringer er presentert i fig. 4b og c
4a. Representative konfokal microcopy bilder som viser cytoplasmisk HSP90 uttrykk endring intensitet etter eksponering for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normothermia (37 ° C) (forstørrelse x60) . 4b, c: Densitometry utført på confocal microcopy bilder av HSP90 farging. 4d:. Western blot bilder av HSP90 uttrykk i termotolerante T98G og termo-sensitive U87MG cellelinjer
Hypertermi sterkt økte HSP90 nivåer i T98G termotolerante cellelinje, mens en skarp fallet ble registrert i termosensitive PC3 og U87MG cellelinjer. På den annen side ble de HSP90-nivå tydelig redusert i alle cellelinjene som ble undersøkt i henhold til nedkjøling. Western blot-analyse utført i termotolerante T98G og den termofølsomme U87MG glioblastoma cellelinjer er vist i fig. 4d, bekrefter resultatene av konfokal mikroskopi.
hyperthermic chemosensitization
Eksponering av termotolerante A549 og termosensitive H1299 lungekreft cellelinjer til cisplatin, nøkkelen stoffet som brukes i klinisk praksis for behandling av lungekreft, viste at feber utvalg hypertermi sterkt sensibilisert H1299 for medikamentet, men dens effekt på A549-cellelinjen var minimal
5a (fig 5a.):. levedyktighet av lungecancer cellelinjer A549 og H1299 etter en 24 timers eksponering for cisplatin henhold normotermisk og feber utvalg hypertermiske forhold. 5b: Livskraftig av glioblastom cellelinjer T98G og U87MG etter en 24 timers eksponering for temozolomid i henhold Normotermisk og feber gående hypertermiske forhold
Eksponering av termotolerante T98G og U87MG termo-sensitive glioblastom cellelinjer til. temozolomid, den eneste godkjente medikament for behandling av humant glioblastom, viste at hypertermi ved 40 ° C sterkt sensibilisert den U87MG-cellelinjen overfor medikamentet, mens noen sensibiliserende virkning ble notert for den T98G en (fig. 5b).
diskusjon
effekten av feber-range hypertermi på normal og kreft cellebiologi og dens eventuelle rolle og innflytelse i celle følsomhet for kjemoterapi og strålebehandling er fortsatt dårlig forstått, som krever ytterligere etterforskning. Mild hypertermi har blitt rapportert å ha en hemmende virkning på celleformering. I en tidligere studie, men Morrisey
et al
rapporterte også en stimulerende effekt av mild hypertermi ved 38 ° C på U87MG cellelinje som ble kraftig reversert ved 40 ° C [16]. Konklusjonen laget av disse forskerne om differensial respons blant cellelinjer til små temperatur høyder er absolutt viktig. Denne studien har ført med hensyn til identifisering av to cellelinjer (T98G og A549) som synes å være motstandsdyktig mot virkningen av hypertermi ved 40 ° C. Den humane A549-cellelinjen er tidligere blitt rapportert å være resistente mot termisk dreping ved 43-45 ° C i forhold til den U87MG-cellelinjen [17], men en differensial reaksjon som strekker seg fra proliferasjon til celledød ved brønnen tolereres av menneskekroppen 40 ° C er nye. Kombinasjoner av feber-range hypertermi kan derfor forsinke progresjon av metastatisk sykdom i termofølsomme svulster med U87MG-lignende oppførsel, mens G2-M fasen rettet mot narkotika kan vise seg avgjørende for å behandle termotolerante T98G lignende svulster i kombinasjon med hele kroppen feberinduksjon eller lokal ikke-toksisk oppvarming.
på den annen side bør den terapeutiske rolle hypotermi ikke undervurderes, og bør være grundig undersøkt i dyremodeller, som omtrent halvparten av de undersøkte cellelinjer viste en 3- 7 ganger reduksjon av levedyktighet ved 34 ° C. Den nåværende kunnskap på sin virkning på kreftceller er begrenset. Hypotermi ved 28 ° C synes å beskytte fortrinnsvis normale fibroblaster i forhold til kreftceller mot 5-fluorouracil [18]. I vår studie ved 34 ° C, normale humane fibroblaster led en redusert spredning av en viss grad, men ganske begrenset i forhold til de fleste kreftcellelinjer. Den reduserte metabolisme og oksygenforbruk av tumorer som utsettes for hypotermi kan også være viktig i tumor bestrålingssensibilisering [19], en hypotese som er blitt også testet i den kliniske praksis [20]. Rollen til hypotermi ved inhibering av kreftcelle adhesjon til endotelceller og således migrering som vist ved Zhang
et al product: [21], gir en ekstra grunn for videre studier angående bruk av hypotermi som en cancerterapi alternativ.
Vi videre undersøkt om dødsfallet effekten indusert av milde temperaturendringer i flere cellelinjer er caspase-9-mediert. Den asparaginsyre spesifikk protease Caspase-9 er involvert i mitokondrie død pathway. Frigjøring av cytokrom c fra mitokondrier aktiverer apaf-1 (apoptosome), som i sin tur spalter pro-enzymet av Caspase-9 i sin mest aktive form. Ikke desto mindre er spalting ikke er vesentlig for Caspase-9 apoptotiske aktivitet [22]. I vår studie, hypotermi og hypertermi indusert caspase-9 i flere følsomme cellelinjer som U87MG, DU145 og MCF7-, i samsvar med redusert levedyktighet bemerket. I resten av tilfellene, forble Caspase-9 uttrykk stabil, noe som tyder på at hvis apoptotiske reaksjonsveier blir aktivert ved nedkjøling disse er caspase 9 uavhengige. For eksempel, AIF (apoptose induserende faktor) eller caspase-8 og 12 er alternative apoptotiske caspase-9 uavhengige apoptotiske trasé [23]. Av interesse, i T98G og A549 termotolerante cellelinjer, ble caspase-9 nivåer redusert under feber varierte hypertermi, som gir bevis for en vei utnyttet av enkelte cellelinjer for å unnslippe mitokondrie relatert apoptose.
HSP90, på den annen side, er en tung medlem av HSP-familien, med en viktig rolle i tumorvekst, blir også forbundet med dårlig prognose i brystkreft og andre maligniteter [24]. Den HSP er oppregulert etter hypertermiske forhold [11], for å beskytte cellene mot varme-indusert protein skade ved sin chaperon aktivitet. Flere HSP90 hemmere har blitt utviklet og har blitt vist i
vivo
å være tumoristatic og å ha en synergistisk effekt med kjemoterapi og andre mål terapier [25]. Oppdagelsen av at hypotermi redusert uttrykk av HSP90 i alle cellelinjer undersøkt er interessant. Som virker som et fysisk middel hemmer av HSP90, kan hypotermi ha synergistisk effekt med kjemoterapi, på samme måte som de kjemiske inhibitorer. Av interesse, hypertermi forsterket HSP90 ekspresjon i den termotolerante T98G cellelinje, noe som antyder en beskyttende rolle av HSP90 i slike cellelinjer og trives under varme betingelser.
hypertermi ble også undersøkt i kombinasjon med cytostatika. Det er tidligere blitt rapportert at samtidig hypertermi og cisplatin-indusert celledød i T-leukemiske celler ved forskjellige molekylære mekanismer på den måten den forbedrede cisplatin-indusert cytotoksisitet ved hypertermi kan forklares [26]. Lignende data er rapportert i en fase I-II studie med formål å evaluere gjennomførbarhet og alvorlig toksisitet av en kombinasjon av cisplatin, bestråling og hypertermi, i behandling av overfladiske livmorhalsnodemetastaser fra hode og nakke kreft, der muligheten for kombinasjonen av cisplatin, bestråling og lokal ekstern mikrobølgeovn hypertermi med en akseptabel toksisitet profilen har blitt bekreftet. Derfor ble det videre foreslått at trimodal terapi fortjener nærmere vurdering som en måte å forbedre effekten av stråling i tilfeller av nodemetastaser fra hode og hals svulster [27]. I vår studie, eksperimenter samtidig eksponering av lungekreft og glioblastom cellelinjer til feber utvalg hypertermi og klinisk etablerte cellegifter viste at allergi gitt av hypertermi hovedsakelig gjaldt termo-sensitive cellelinjer, mens dens sensibiliserende virkning var drastisk dårligere i termotolerante cellelinjer. Dette med å finne ytterligere støtter nødvendigheten av å utvikle kliniske metoder i stand til å identifisere termofølsomme svulster som ville dra mest hvis det behandles med kombinert hypertermi og kjemoterapi protokoller. Enten termotolerante svulster kan bli følsomme for hyper kjemoterapi ved å blokkere HSP90 eller relevante biologiske pathways forblir en hypotese for videre eksperimentering.
Det konkluderes med at kreftceller reagerer forskjellig milde temperaturendringer, enten disse er mot mild hypotermi eller feber-range hypertermi. Thermo-tolerante og termo-sensitive cellelinjer har blitt identifisert til feber utvalg hypertermi, som oppmuntrer forskning for å finne egnede metoder for klinisk gruppering av humane tumorer i henhold til deres termiske forkjærlighet. Slik karakterisering ville tillate kliniske forsøk med ikke-toksisk lokalisert eller total kropps hypertermi hos pasienter som anslås å være følsomme for slike behandlinger. Av interesse, mild hypotermi hadde en undertrykkende effekt på celleproliferasjon i alle celler undersøkt, noe som tyder på at hypotermi vil undertrykke svulst replikasjon og metabolisme i de fleste humane tumorer, ytterligere støtte til radio-allergi hypotesen gjennom økt oksygentilførsel ved å redusere oksygen og metabolske krav.
