Abstract
Bakgrunn
bisfosfonat, zoledronsyre (ZOL), kan hemme osteoklaster som fører til redusert osteoclastogenesis og osteoklastaktivitet i beinet. Her har vi brukt et blandet osteolytisk /osteoblastisk murin modell av ben-metastatisk prostatakreft, RM1 (BM), for å bestemme hvordan å inhibere osteolyse med ZOL påvirker evnen av disse cellene for å etablere metastaser i ben, integriteten til tumorbærende ben og overlevelse av tumorbærende mus.
Metoder
modellen innebærer intrakardiell injeksjon for arteriell formidling av RM1 (BM) celler i C57BL /6 mus. ZOL behandling ble gitt ved subkutane injeksjoner på dagene 0, 4, 8 og 12, 20 og 100 ug /kg doser. Bone integritet ble bedømt ved mikrodatamaskinstyrt tomografi og histologi med sammenligning til ubehandlede mus. Osteoklastprotonpumpen og osteoblastaktivitet ble bestemt ved måling av serum-tartrat-resistent sur fosfatase 5b (TRAP 5b) og osteocalcin, respektivt. Musene ble avlives i henhold til forhåndsbestemte kriterier og overlevelse ble vurdert ved hjelp av Kaplan Meier plott.
Funn
Micro-CT og histologisk analyse viste at behandling av mus med ZOL fra den dagen intrakardiell injeksjon av RM1 (BM) celler hemmet tumorindusert bein lyse opprettholdt beinvolum og reduserte forkalkning av tumorindusert endochondral osteoid materiale. ZOL behandling førte også til en redusert serum osteocalcin og FELLE 5b nivåer. I tillegg behandlede mus viste økt overlevelse sammenlignet med bærerbehandlede kontroller. Imidlertid gjorde ZOL behandling ikke hemme celler evne til metastasise til bein som antall bein-metastaser var lik i begge behandlede og ubehandlede mus.
Konklusjoner
ZOL behandling gitt betydelige fordeler for å opprettholde integriteten av tumorbærende bein og økt overlevelse av tumorbærende mus, selv om det ikke hindre etablering av bein-metastaser i denne modellen. Fra mekanistisk syn, disse observasjonene bekrefter at tumorindusert bein lyse er ikke et krav for etablering av disse bensvulster
Citation. Hung TT, Chan J, Russell PJ, Strøm CA (2011) zoledronsyre Bevarer benbygning og øker overlevelse, men begrenser ikke Tumor Forekomst i en Prostate Cancer Bone metastase Model. PLoS ONE 6 (5): e19389. doi: 10,1371 /journal.pone.0019389
Redaktør: Wafik S. El-Deiry, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 13 februar 2011; Godkjent: 28 mars 2011; Publisert: May 16, 2011
Copyright: © 2011 Hung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne ønsker å erklære at dette arbeidet ble finansiert delvis av et forskningsstipend fra Novartis Australia. Novartis også gitt zoledronsyre for denne studien. TH ble delvis støttet av Prostate Cancer Foundation of Australia. CAP ble delvis finansiert av Stiftelsen for medisinsk forskning i Sydney og er en kar av National Imaging Facility, Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Prosjektet ble delvis finansiert av et forskningsstipend fra Novartis Australia. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Noen primære kreftformer har en høy tilbøyelighet til å metastasise til ben, men grunnene for dette er fortsatt uklar, selv om det er generelt akseptert at vekst av de fleste kreftformer i ben er avhengig av faktorer som er tilstede i bein mikro-miljø. Tumorceller kan indusere proliferasjon og aktivering av benceller ved frigjøring av vekstfaktorer og dette aktivitetsøkning fører til ytterligere stimulering av kreftceller i det som er blitt kalt en «ond sirkel» [1]. Bone engasjement er vanlig i prostata og bryst kreft og myelom, og mens brystkreft og myelom bein-metastaser er overveiende osteolytic, med økt osteoclastaktivitet fører til bein erosjon, prostata kreft bein metastase tilfeller er heterogene, som involverer både bein lytisk og stivnet effekter [ ,,,0],2]. I osteolytiske lesjoner, kan kreftceller produserer cytokiner som fremmer differensiering av osteoklastene direkte [3], [4] og indirekte ved stimulering av stromale benmargsceller for å fremme osteoclastogenesis [5]. På samme måte kan tumorceller produserer cytokiner som fremmer osteoblastaktivitet og induserer benvekst [6] og osteoblaster kan forårsake kreft utvikling og progresjon [7], [8], [9]. Samspillet mellom kreftceller og beinceller diktere beinmetastatisk fenotype.
Zoledronsyre (ZOL) og andre bisfosfonater (BP) hemmer metastase og vekst av bein-resident svulster gjennom å hemme osteoklastfunksjonen. Således ZOL hemmer ben-destruktive virkninger av tumoren og den resulterende hemming av benomsetning også bremser ond syklus, noe som resulterer i en reduksjon i ben-tumorstørrelse og, i noen tilfeller, antallet av benlesjoner i forskjellige dyremodeller av osteolytisk benkreft [10]. Imidlertid har det vært motstridende rapporter om virkningene av ZOL på osteoblastiske bensvulster. Mens ZOL behandling ikke hemmer intra osseous vekst av osteoblastisk cellelinje LAPC-9 [11], veksten av intra-tibial LuCaP 23.1-celler inhiberes av ZOL [12]. En senere studie antydet at tumor-mediert osteolyse ikke er nødvendig for osteoblastiske metastaser [11].
Her bruker vi en blandet osteolytic /osteoblastisk syngene musemodell for prostatakreft metastaser til bein, den RM1 beinmetastatisk (BM) modell [13] for å vurdere effekten av ZOL behandling på
etablering
av skjelettmetastaser, integriteten av tumorbærende bein og total overlevelse av mus.
RM1 (BM) celler injisert inn i venstre ventrikkel i hjertet resultat i flere skjelettmetastaser med få bløtdelssvulster. Vi viser at hemming av osteolyse med ZOL behandling ikke påvirker forekomsten av beinsvulster. Ikke desto mindre hadde ZOL behandling øke overlevelsen av mus på en måte som er doseavhengig. Viktigst, ZOL behandling også redusert de lytiske effektene av RM1 (BM) svulster på bein som vurderes av histologi og mikro-computertomografi (micro-CT) analyse, og ser ut til å hemme forkalkning av tumorindusert endochondral bein, men ikke osteoid formasjon. Vi hadde ikke avgjøre om ZOL påvirket størrelse eller vekstkinetikk svulster. Eksperimentene som er presentert her benyttes intra-kardial injeksjon, noe som ikke forårsaker skader på skjelettet direkte, og den resulterende metastatiske foci i disse eksperimentene er sannsynligvis innebære forholdsvis få celler. Dermed etablering av metastaser fra enkeltceller eller små klynger av celler, en tilstand som mer sannsynlig å reflektere naturlige metastatisk hendelser, krever ikke nødvendigvis innledende lytiske forhold.
Resultater
I RM1 (BM ) beinmetastase modell, ZOL behandling hadde en betydelig effekt på overlevelse av mus i forhold til ubehandlede mus (figur 1). Totalt var det en trend med økt overlevelse med økt dose (p = 0,012). Overlevelse av mus i dose på 100 ug /kg var signifikant forskjellig fra den for den bærerbehandlede gruppe (p = 0,031) mens det /kg dose 20 ug ikke nådde statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppen med prøvestørrelsene som anvendes i disse forsøk (p = 0,108). Median overlevelse for kjøretøy-, 20 mikrogram /kg ZOL- og 100 mikrogram /kg ZOL-behandlede mus var 14,5, 18,5 og 20 dager henholdsvis.
(A) Kaplan-Meier overlevelses tomt på mus gitt en intra-arteriell injeksjon av RM1 (BM) -celler, etterfulgt av behandling med 100 ug /kg eller 20 mg /kg zoledronsyre doseringsregimer eller bærer bare som beskrevet i Materialer og Metoder. Den log rank test for trend indikerer en trend med økt overlevelse med økende dose (p = 0,012), og en signifikant forskjell i overlevelse mellom mus på 100 ug /kg dosegruppen vs bærerkontrollgruppene (p = 0,031, fulgt Kaplan-Meier ved Breslow parvis sammenligning SPSS 17.0)
osteocalcin nivåene var generelt lavere i tumorbærende mus, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant, og behandling av disse musene med 20 (p. 0,01) eller 100 ug /kg (p 0,01) av ZOL ytterligere redusert serum osteokalsin sammenlignet med normale kontroller (figur 2A). Serumet TRAP 5b nivåer av tumorbærende, ubehandlede mus var lik dem fra kontrollene. Imidlertid førte behandling med 20 eller 100 ug /kg av ZOL senket serum TRAP 5b til mindre enn 40% av kontrollmusene og de som fikk den RM1 (BM) -celler bare (s 0,001, figur 2B).
(A) Nivåer av osteoblastmarkør, ble osteocalcin redusert i serum av zoledronsyre behandlede mus. (B
)
tartrate bestandig syre fosfatase 5b, en indikator på osteoklastaktiviteten, ble også redusert med behandling. Punkter på kurven representerer serumnivåene for de enkelte mus mens linjer viser stillingen av anordningen innenfor hver gruppe. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis ANOVA for analyse, etterfulgt av Tukey innlegg test. *** P. 0,001
Tilstedeværelsen av tumorlesjoner i mus ble evaluert av to midler, fluorescens bildebehandling for grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykk av tumorceller etterfulgt av bekreftelse med histologi som beskrevet [ ,,,0],1. 3]. Den RM1 (BM) cellelinje var følsom for Zol behandling
in vitro plakater (data ikke vist), men behandlingen hadde liten effekt på forekomsten av bløtdels eller bensvulster i denne modellen. ZOL behandling reduserte ikke antallet av bein lesjoner eller antall tumor-metastase i mykt vev i RM1 (BM) injiserte mus (figur 3A-C). Vi gjorde ikke vurdere effekten av ZOL behandling på veksten av etablerte tumorer.
(A) Totalt antall metastaser, (B) bein-metastaser, eller (C) metastaser bløtvev som vurdert av en- veis ANOVA. Hvert punkt representerer antall metastaser i en individuell mus, linjene viser medianen i gruppen.
Rekonstruerte tredimensjonale bilder av bein fra mikro-CT og representant H og E farget histologiske snitt er vist i henholdsvis Figur 4 og 5. Snittene ble også farget med tetra flekk [14] for å skille nytt ben utvikling av etablert /forkalket ben (figur 6). Mus med metastatiske benskader i det lange ben viste signifikant ben lyse, spesielt nær epiphyseal plate, med en reduksjon i trabekulært ben (figur 4B) sammenlignet med normale kontroller (Figur 4A). Den lytiske virkning av tumoren er redusert i 20 ug /kg ZOL behandlingsgruppen (figur 4C) og kanskje mer i mus som fikk 100 ug /kg ZOL (figur 4D). De mikro-CT-resultater er bekreftet ved de histologiske resultater (figur 5 og 6), som viser normal trabekulært ben struktur i de ubehandlede kontrollmus (Figur 5A, 5B og 6A), men bevis på begge lytisk og stivnet effekter i det ubehandlede tumorbærende bein (figur 5C, 5D og 6B). ZOL behandling ved 20 ug /kg bevart trabekulære struktur i tumorbærende ben (figur 5E, 5F og 6C) og 100 ug dose kg /økes trabeklære ben (figur 5G, 5H og 6D). Økningen i tumor-indusert endochondral trabeklære ben dannelse er særlig tydelig i de Zol behandlede mus (figur 5E og 5G) på grunn av samtidig hemning av tumor-indusert lyse. Imidlertid er ufullstendig mineralisering av trabekulært ben osteoid nær epifyse plate tydelig i de Zol behandlet tumorbærende bein (figur 6C og 6D)
MicroCT skanninger av mus femur og tibia.; normal kontroll (A), RM1 (BM) tumorbærende (B), RM1 (BM) tumor-bærende behandlet med 20 ug /kg ZOL diett (C), RM1 (BM) tumor-bærende behandlet med 100 ug /kg ZOL regime (D)
H . E farget deler av lårbenshodet ved 40X (A, C, E og G) og 120X (B, D, F og H) forstørrelse viser normal (A og B) og RM1 (BM) tumorbærende ben (C-H); Typiske eksempler på bein fra ubehandlede mus (A-D) og mus behandlet med 20 ug /kg ZOL (E 0,01, figur 7B) og derav følgende økning i ben-overflateareal: ben-volumforhold i tumorbærende ben (p 0,001, figur 7C), mens Zol behandlinger resulterer i en økning i skjelettvolum (p 0,001, figur 7B) og en reduksjon i ben-overflateareal:. ben-volum-forhold (p 0,001, figur 7C) i tumorbærende ben
det var ingen signifikant endring i ben overflateareal (A) indusert ved nærværet av en svulst eller behandling med zoledronsyre. Imidlertid benvolum ble dramatisk redusert i RM1 (BM) inneholdende ben, og ved behandling med ZOL forhindret dette tapet på en doseavhengig måte (B), som resulterer i lavere overflateareal /volum-forholdet (øket bentetthet) sammenlignet med normal eller tumor -bærende ben (C). Resultatene er basert på målinger innhentet fra CT-skanner som beskrevet i Materialer og metoder. Statistisk analyse ble utført av enveis ANOVA etterfulgt av Tukey innlegg test, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
Diskusjoner
Når. injisert ved intra-hjerte rute, induserer RM1 (BM) cellelinje flere benmetastaser med relativt få (og relativt små) bløtvevssvulster [13]. Av notatet er observasjonen at de resulterende beinmetastaser ikke viser preferanse for bestemte steder i skjelettet der det oppstår høy beinomsetning, noe som indikerer at høy benutskiftingen ikke er nødvendig for etablering av metastaser. Videre de resulterende skjelettmetastaser har blandet osteolytic og osteoblastiske tegn med verken fenotype dominerende [13]. Vi har fastslått at intra-kardial injeksjon av RM1 (BM) -celler er en utmerket modell for vurdering av om ZOL kunne hemme etablering av tumorer metastaser som ikke var avhengig av lytisk vekst, det vil si ond sirkel. Vi vurderte også evnen til ZOL behandling for å inhibere tumor-osteolyse og endochondral bendannelse og bestemt påvirkning av behandlingen på den totale overlevelse av mus.
I likhet med andre nitrogenholdige bps ZOL induserer apoptose i osteoklaster ved å hemme enzymer i reaksjonsveien mevalonat og hindre isoprenylation av små GTP-bindende proteiner som Ras og Rho [15], [16].
In vivo
, BPs binder seg med høy affinitet til bein hydroxy-Appatite og dermed er sequestered av aktive osteoklaster i høye konsentrasjoner, som fører til osteoclast apoptose. Selv om en rekke andre mekanismer, inkludert direkte dreping av kreftceller, hemming av angiogenese og aktivering av γδT celler [17], [18] er blitt vist for ZOL, dens virkning på osteoklaster forblir hovedmekanismen ved hvilken ZOL inhiberer benkreft etter gjeldende behandlingsregimer. Fordelen for pasienten er potensielt todelt: ZOL hemmer osteoklastmediert lyse indusert av svulsten og så avbryter den onde sirkelen og påfølgende fremming av tumorvekst. Dette er sikkert sant av osteolytiske svulster, men effekten av ZOL behandling på svulster som ikke er avhengig av ben lyse er dårlig forstått.
Behandling av tumorbærende mus med ZOL langvarig overlevelse av musene i vår studie ( Figur 1). Ved en dose på 100 ug /kg, det er en statistisk signifikant økning i overlevelsestiden sammenlignet med de bærerbehandlede mus og en tendens til økt overlevelse på 20 ug /kg-behandlede mus. Lignende resultater har blitt rapportert for andre syngene kreft modeller [7], [8], [9]. Men i osteolytiske modeller av multippelt myelom [10] og brystkreft [8], betydelig reduksjon i etablering av beinmetastatiske lesjoner ble observert, men dette er ikke tilfelle for systemet (figur 3). Vi har vist tidligere [13] at RM1 (BM) celler metastasise til de fleste steder i skjelettet og dermed metastasering av disse cellene til benete områder ser ut til å være uavhengig av bein omsetning priser. Dermed er vi ikke overrasket over at hemming av bein lyse av ZOL behandling ikke har noen påviselig effekt på etablering av svulster i ben. Disse funnene tyder på at forkjærlighet for RM1 (BM) celler for bein er avhengig av andre faktorer, potensielt økt homing til benete områder eller avhengighet av faktorer som er uavhengige av bein lyse. Selv om dette er en blandet osteolytisk /osteoblastisk modell, er resultatene i motsetning til de av Corey [12], men tilsvarende resultater som er oppnådd med den osteoblastiske celler linje, LAPC-9 [11].
Vi har vurdert konsentrasjonene av de to benomsetningsmarkører, osteocalcin (utskilt av osteoblaster) og TRAP 5b (fremstilt av osteoklaster) i serum av eksperimentelle mus. ZOL behandling reduserer serumnivåene av begge disse markørene (figur 2) som indikerer at ZOL har hemmet både osteoclast og osteoblastaktivitet på systemnivå. Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporter om redusert osteocalcin i brystkreftpasienter [19] og en felle 5b nedgang i mus [20] etter behandling med ZOL. Oppdagelsen av at både osteoblast og osteoklast-aktivitet er svekket tyder på at den observerte økning i benvolum og overflateareal med ZOL behandling (figur 7) er et resultat av redusert osteoclast-aktivitet, heller enn øket osteoblastaktivitet. Imidlertid er det funnet spesielt interessant at osteocalcin nivåene i serum er redusert i ZOL behandlede tumorbærende mus ledsager med observasjonen av øket endochondral osteoid dannelse i disse musene (figur 5 F og H). Viktigere, vises den nye osteoid materiale observert i de Zol behandlede mus i stor grad un-forkalket (figur 6C og 6D), særlig ved den høye dose (figur 6D), på det tidspunkt ble musene drept noe som tyder på en frakopling av osteoid utvikling og forkalkning trinn på beindannelse. Av relevans er observasjonen at osteocalcin-mangelfull mus har økt beindannelse [21]. Nedgangen i trabekulært ben forkalkning med økt i ZOL dose er et nytt funn og ser ut til å motsi den omfattende eksisterende litteratur om effekten av bisfosfonater på beinet. Men vi viser også at ZOL behandling av tumorbærende mus øker bein volumet av mus leggbena (figur 7B), som støtter tidligere funn. I lignende prekliniske studier med det c4-2 [21] og LuCaP 23,1 [22] xenograft-modeller, ble ZOL behandling også vist seg å øke den totale benvolum. Dermed blir redusert mineraliseringen av nydannet trabekulært ben observeres her er i overensstemmelse med en generell bevaring av eksisterende mineralisert ben i tumorbærende mus. Disse effektene av ZOL i å opprettholde bein integritet er assosiert med økt overlevelse i ZOL behandlet mus.
Effektene av ZOL på benbygning kan eller ikke kan direkte påvirke utviklingen av kreft, men forebygging av unormal bein modellering i en tumor-ridd ben kan være nøkkelen til Zol redusere risikoen av skjelettrelaterte komplikasjoner og forlenge tiden for å skjelettrelaterte hendelser oppstår hos pasienter med ben-metastatisk prostatakreft [23], [24]. Videre har ZOL behandling betydelige konsekvenser for å håndtere smerte reduksjon i klinikken. BPs bedre beinstrukturen hos pasienter, med en stor reduksjon i relaterte smerter [25], [26], [27], som har vært knyttet til re-forkalkning i beinet, som har ført til en nedgang i smertestillende bruk. Av relevans er observasjonen i multippelt myelom (en osteolytic sykdom) pasienter, redusert osteocalcin nivåer, som rapportert her, var relatert til reduksjon i skjelettrelaterte hendelser [28]. Behandling med zoledronsyre er en effektiv terapi for blandet osteoblastiske /lytiske svulstene som det øker overlevelse av behandlede mus. Behandlingen hemmer ben lyse og redusert osteoklast-aktivitet som forventet. ZOL behandling også redusert serumnivåer av osteokalsin, men inhiberte ikke tumorindusert endochondral osteoid formasjon, selv om det delvis inhiberte påfølgende forkalkning av denne osteoid materiale på en doseavhengig måte. ZOL ikke redusere hyppigheten av metastaser som indikerer at selv om RM1 (BM) svulster indusere bein lyse, er ikke avhengig av lytisk vekst etablering av svulster.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
The University of New South Wales Animal Care og etikkomiteen godkjent dyr bolig, reindrift, og alle eksperimentelle prosedyrer utført på dyr før eksperimenter (Prosjekt søknad godkjenningsnummer: 05 /120B). Musene ble overvåket nøye (på daglig basis) og avlives etter forhåndsdefinerte kriterier (tap av 20% av kroppsvekten, betydelig tap av tilstand, eller delvis lammelse) som er godkjent av de dyreetikk.
Cell kultur
RM1 celler ble hentet fra Dr. T Thompson, Baylor College, og RM1 (BM) ble utviklet av serieaging av RM1
in vivo product: [13]. Begge cellelinjer ble dyrket under standardbetingelser (37 ° C i en 5% CO
2 inkubator) i DMEM (Invitrogen, Melbourne, Australia) med 10% FBS (Invitrogen) og L-glutamin (Invitrogen).
surrogatmarkører for benmetastaser i Serum
Sera fra tumorcelle injisert mus og normal kontroll mus tatt ved obduksjon av hjertestans punktering ble vurdert for tilstedeværelsen av surrogatmarkører for beinmetabolisme. Utilstrekkelig serum var tilgjengelig fra noen mus for å vurdere surrogatmarkører. Osteokalsin Innholdet ble vurdert ved hjelp av en osteocalcin enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) 5b Konsentrasjonen ble bestemt ved The Mousetrap analysen (Suomen Bioanalytikka Oy, Turku, Finland) som forbudt i settet. Serum protein nivåer ble bestemt ved sammenligning med en standardkurve fremstilt av standardene som følger med analyser.
Dyr
5-6 uker gamle C57BL /6 mus ble hentet fra Animal Resource Centre (Adelaide , Australia). De ble plassert og vedlikeholdes på biologiske ressurser Centre, Little Bay, NSW. På dag 0 av eksperimentet ble musene injisert med en av 3 x 10
4 RM1 (BM) -celler i saltløsning eller saltløsning alene (100 pl) inn i venstre ventrikkel av hjertet. Mus ble behandlet på dagene 0, 4, 8 og 12 ved subkutan injeksjon av enten 20 pg /kg eller 100 ug /kg av zoledronsyre (Novartis Pharmaceuticals, Australia), eller saltvann (bærer). Den kumulative dosen på 20 ug /kg tilsvarer en omtrentlig enkeltdose på 4 mg hos pasienter. Musene ble overvåket nøye og avlives etter forhåndsdefinerte kriterier (tap av 20% av kroppsvekten, betydelig tap av tilstand, eller delvis lammelse) som er godkjent av de dyreetikk. Antallet av tumorer hos hver mus ble bestemt ved GFP fluorescens (som tidligere beskrevet [13]) ved obduksjon, etterfulgt av histologi. Tilstedeværelsen av bare en thorax svulst er en indikasjon på at IC injeksjonen var ikke vellykket, og derfor slike mus ble ekskludert i disse vurderingene.
Histologi
Muse skrotter ble fiksert i 10% formalin i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 48 timer og deretter avkalkes i 10% EDTA i 10-14 dager. Decalcified forgrunnen og baklemmene ble dyppet i parafin etter vev behandling (dehydrering, rydding og impregnering). Seksjoner (5 um) ble kuttet fra hver blokk og farget med Harris «hematoksylin og eosin (H E). For analyse av mineralisering av bein, ble deler (8 mikrometer) klipp og farget med tetra flekken i henhold til tidligere publiserte metoder [14] med små modifikasjoner: den ponceau røde løsningen ble erstattet med Briebrich Scarlet /syrefuksin løsning. Seksjonene ble undersøkt med Aperio Scanscope XT (CA, USA) og bilder tatt med Imagescope Viewer (Aperio, CA, USA).
Micro-CT-skanning og analyse
Etter formalin fiksering, den baklemmene ble valgt for mikro-CT-skanning før behandling for histologi. Tumorbærende lemmer ble identifisert før ved uttrykk av GFP
in vivo
. For tumorbærende mus som fikk den /kg dosering 20 mikrogram, ble både høyre og venstre bakbein av fem mus skannet. For andre behandlingsgruppene, ble bare en eneste etappe skannet fra hver mus. Alle analysert ben var fra dyr som ble hentet mellom dag 15 og 21 etter injeksjon av cellene. Skanning og rekonstruksjon ble utført ved hjelp av en Skyscan 1072 mikro-CT-systemet og tilhørende programvare (Skyscan, Antwerpen, Belgia). Samtidig opprettholde prøven i synsfeltet under bildeopptak, ble prøven rotert 180 ° rundt den vertikale aksen. Bilder ble eksponert for 5,9 sek og anslag registrert på hvert rotasjonstrinn, hver 0,9 °, 80 keV og 100 mA. Cross sectional bilder (DICOM-format) ble samlet inn de projiserte CT-bilder ved hjelp Nrecon (Skyscan, Belgia). Bone areal og volum ble beregnet ut fra DICOM-bilder ved hjelp av produsentens programvare (CT-Analyzer, Skyscan, Belgia). Den delen av benet rundt kneleddet fra toppen av den tredje trochanter av femur til forgreningen av tibia og fibula ble valgt for denne analysen for å sikre konsistens. Rekonstruksjon av 3D-modellen og bilde visualisering ble utført ved hjelp av ANT programvare (Skyscan, Belgia).
Statistisk analyse
En vei ANOVA etterfulgt av Tukey innlegg testene ble utført med GraphPad Prism versjon 4.00 for MacIntosh, GraphPad programvare (San Diego, USA). Overlevelse ble vurdert av Kaplan-Meier fulgt av Breslow parvis sammenligning SPSS 17.0.
