Abstract
Bakgrunn
Hypoksi i kreftformer resulterer i oppregulering av hypoksi induserbar faktor 1 (HIF-1) og en mikroRNA, HSA-MIR-210 (MIR-210) som er assosiert med dårlig prognose.
Metoder og funn
i menneskelig kreft cellelinjer og svulster, fant vi at MIR-210 er rettet mot mitokondrie jern svovel scaffoldprotein ISCU, som kreves for montering av jern-svovel klynger, kofaktorer for viktige enzymer involvert i Krebs syklus, elektrontransport og jern metabolisme. Nedregulering av ISCU var den viktigste årsaken til induksjon av reaktive oksygenarter (ROS) i hypoksi. ISCU undertrykkelse redusert mitokondrie kompleks en aktivitet og aconitasen aktivitet, forårsaket et skifte til glykolyse i normoxia og forbedret celle overlevelse. Kreft med lav ISCU hatt en dårligere prognose.
Konklusjoner
Induksjon av disse store kjennetegnene til kreft viser at en enkelt mikroRNA, MIR-210, formidler en ny mekanisme for tilpasning til hypoksi, ved å regulere mitokondriefunksjon via jern-svovel klynge stoffskiftet og frie radikaler generasjon
Citation. Favaro E, Ramachandran A, McCormick R, Gee H, Blancher C, Crosby M, et al. (2010) mikroRNA-210 Regulerer Mitokondrie Free Radical Response til Hypoksi og Krebs Cycle i kreftceller ved Targeting Iron Svovel Cluster Protein ISCU. PLoS ONE 5 (4): e10345. doi: 10,1371 /journal.pone.0010345
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago (UIC), USA
mottatt: 16 desember 2009; Godkjent: 29 mars 2010; Publisert: 26 april 2010
Copyright: © 2010 Favaro et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kreftforskning Storbritannia og Venner av Kennington Cancer Research Fund (EF, ALH, JL), The Wellcome Trust (CB1, CC, IR), Royal College of Surgeons British Urologi Foundation (CB2, RMcC), EU, ACGT (FB), Rhodes Scholarship (HG), Nuffield Medical Fellowship (AR), FIRC Student (EF). Biobanker støttet av NIHR Biomedical Research Centre i Oxford; Elsa Pardee Foundation (MI), American Cancer Society (MC, MI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hypoksi er en stor fysiologisk forskjell mellom svulster og normalt vev, hovedsakelig generert av tumorvekst med utilstrekkelig blodtilførsel og forbruk av oksygen ved tumorceller [anmeldt i [1]]. Hypoksi induserer en kompleks transcriptional svar hovedsakelig via induksjon av hypoksi induserbar faktor 1α (HIF1α), som påvirker mange biologiske prosesser som glykolysen, angiogenese, pH regulering, invasjon og immortalisation [2].
Et fremvoksende paradigmet i hypoksi er at mitochondria produsere reaktive oksygenforbindelser, formidlet av elektrontransport fortsetter i hypoksi [3]. Denne fri-radikal-reaksjonsveien bidrar til oppregulering av HIF [4] og forbedret vekst in vivo [5], men kan også være giftig. En rekke veier indusert av HIF har allerede blitt rapportert å beskytte mot den sistnevnte effekt, for eksempel induksjon av pyruvat dehydrogenase kinase-hemmer enzymkomplekset av pyruvat dehydrogenase og blokkerer omdannelsen av pyruvat til acetyl koenzym A, det første trinnet i Krebs syklus [6] og forbedrer laktatproduksjon [7]. Mitophagy kan induseres av BH3 domene protein BNIP3, [8] og cytokrom C oksidase subenheter kan bytte til mer effektive de [9].
Nylig microRNAs (Mirs), som er små (~22 nt) ikke-kodende RNA som regulerer post-transkripsjonell genekspresjon ved å blokkere translasjon av mål-mRNA eller ved å akselerere deres degradering [10], [11], er blitt rapportert å bli indusert ved hypoksi. Men noen av sine mål eller virkningsmekanismer er kjent [anmeldt i [12]]. Vi og andre [13] har vist MIR-210 er robust indusert av hypoksi i mange cellelinjer, via HIF1α [14]. Vi har nylig analysert sitt uttrykk i en serie av 216 brystkreftpasienter og viste Mir-210 uttrykk ble korrelert med mange HIF1α mål på mRNA-nivå (målt ved en hypoksi metagene) og var sterkt assosiert med dårlig pasient overlevelse. bare avledet fra sekvens-baserte algoritmer, noen av de tidligere validerte målene for MIR-210 inkluderer Efrin A3 [15], E2F3 [16], RAD52 [17], CASP8AP2 [18], og MNT [19]. Vi kombinerte offentlig tilgjengelige algoritmer, med våre gene array-datasett, å forutsi potensielle Mir mål av betydning i kreftceller. Vi fant ut at mitokondrie jern svovel klynge homolog ISCU var den høyeste spådd mål for MIR-210. Nylig ISCU har blitt identifisert som en MIR-210 mål også i normale lunge endotelceller [20], hvor den bidrar til Pasteur-effekten og styrer nivået av ROS produksjon i hypoksi, noe som tyder på dens potensial adaptive rolle til hypoksi i sammenheng pulmonal endotel.
Jern svovel klynger [Fe-S] er tilstede i de aktive områder av mange enzymer og proteiner, kritisk for deres aktivitet og istand til å gi regulering av redoks-status [21]. Disse grupper er samlet i mitokondriene [22] av en kompleks serie av anstand og enzymer, inkludert ISCU, deretter eksportert til cytoplasma, hvor de blir samlet inn i det aktuelle proteinet [23]. Blant Fe-S klase proteiner involvert er flere som utgjør viktige komponenter i komplekse I, II og III i mitokondriene, og komponentene i Krebs syklus som succinatdehydrogenase og aconitasen. Den cytoplasmatiske form av sistnevnte regulerer jern metabolisme via sin funksjon som en translasjonell regulator-IRP1 [24].
I denne rapporten viser vi de store biologiske effekter av MIR-210 rettet mot ISCU, som alle er sannsynlig å bidra til viktige fenotyper i kreft. Ved downregulating ISCU, MIR-210 reduserer Krebs syklus enzymaktivitet og mitokondrienes funksjon, gir en viktig mekanisme for den økte frie radikaler generasjon i hypoksi øker celleoverlevelse etter hypoksi, induserer en bryter for å glykolyse i normoxia og hypoksi (Warburg og Pasteur effekter) og oppregulering av jernopptaket er nødvendig for cellevekst. Viktigere, analyse av over 900 pasienter med ulike krefttyper viste at undertrykkelse av ISCU er sterkt korrelert med en dårligere prognose. Denne studien viser dermed en ny sti aktivert i hypoksiske svulster, mediert av MIR-210 påvirker mitokondrieenzymaktivitet og frie radikaler generasjon og fremhever betydningen av mitokondrie metabolisme i hypoksi biologi [3].
Resultater
Valg av ISCU som et potensielt mål
Vi har sammenlignet Mir-210 uttrykk i vår publiserte serier av brystkreft [14] med vår hypoksi metagene av grupperte mRNA [25] og samlet vurdering med mål prediksjon algoritmer viste ISCU var den høyeste spådd mål, og tre kjente målgener også sitte i høyt rangert stillinger ble valgt ut av denne tilnærmingen (Supporting Material og metoder S1, Støtte Tabell S1).
MiR-210 og ISCU mRNA gjennomgå gjensidig regulering
i overensstemmelse med tidligere publikasjoner [13], [14], MIR-210 ble robust indusert i MCF7 og HCT116 av hypoksi (1% eller 0,1% oksygen) ved 24 og 48 timer, med maksimal induksjon observert ved 48 timer i 0,1% oksygen (Figur 1A og Støtte figur S1 A). ISCU mRNA kvantifisert ved rtPCR ble omvendt korrelert til MIR-210 og redusert viktigst når cellene ble utsatt for mer alvorlig hypoksi i lengre perioder (Figur 1B og Støtte Figur S1B). I likhet med regulering av MIR-210 etter hypoksi, ISCU undertrykkelse på karakterutskriften nivå var avhengig HIF1α og ikke HIF2α (Støtte Tall S1C og S1D). Videre fenomenet gjensidig regulering av MIR-210 og ISCU av hypoksi ble også funnet i mange andre cellelinjer (Støtte Tall S1E og S1F).
En
, MIR-210 øker i henhold hypoksi, med den mest robuste induksjon sees ved 48 timer med 0,1% oksygen.
B
, under de samme betingelser, den sterkeste nedregulering av ISCU mRNA observeres etter 48 timer med 0,1% oksygen. Uttrykket nivåer av MIR-210 og ISCU mRNA under hypoxi står i forhold til sine normoksisk uttrykk nivåer på 24 timer (N). Gjennomsnitt ± standardavvik av tre uavhengige eksperimenter er vist (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).
C
, transfeksjon av anti-210 delvis redder hypoksisk undertrykkelse av ISCU mRNA og mimikk-210 overekspresjon avtar ISCU mRNA i normoxia på 48 timer. Uttrykk for ISCU mRNA er i forhold til anti-ctrl i normoxia (N). Gjennomsnitt ± standardavvik av tre uavhengige eksperimenter er vist (** p 0,01, *** p 0,001).
D
, (
toppanelet
) ISCU protein er nedregulert i MCF7 lysatene på 0,1% oksygen i forhold til normoksisk lysatene (N) når anti-ctrl er transfektert i 48 timer. Denne reduksjonen i proteinnivået i tanken under hypoksiske betingelser er delvis reddet når anti-210 transfekteres. Under normoksisk forhold, mimikk-210 undertrykker ISCU protein nivå i forhold til å etterligne-ctrl transfekterte celler.
D
, (
nedre panelet
), kvantifisering av redningen av ISCU proteinnivået ved transfeksjon av anti-210. Transfeksjon av anti-210 redder ISCU protein nivåer i MCF7- med ca 40%. Bety verdier ± S.E.M. av to uavhengige eksperimenter er vist. (* P 0,05).
Mimic-210 trykt ISCU i normoxia og anti-210 reversert undertrykkelse i hypoksi
Vi rekapitulert den observerte hypoksisk induksjon av MIR-210 ved trans MCF7 og HCT116 med mimikk-210 i normoxia. Mimic-210 trykt ISCU mRNA nivåer med ca 60% (figur 1C og Støtte figur S2A). Vi antagonized MIR-210 induseres under hypoksiske betingelser med anti-210. Hemming av endogen MIR-210 betydelig reddet undertrykkelse av ISCU mRNA, selv om dette ikke var fullført (figur 1C og Støtte figur S2A).
ISCU har to hoved alternativt spleisede isoformer. ISCU1 har et alternativt N-terminale sekvens og er lokalisert til cytosol, mens ISCU2 er knyttet til mitokondriene. For å bekrefte spesifisiteten av antistoffet anvendt i disse studiene, ble MCF7-celler behandlet med sirnas mot ISCU. Bandet påvist i kontrollcellene ble fullstendig undertrykt ved transfeksjon med siISCU1 og siISCU3 (Støtte figur S2B). De to isoformer av ISCU kunne ikke skjelnes ved Western blotting av hele cellelysater på grunn av liten forskjell i molekylvekt. Men immunoreactive bånd ble påvist i både cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner (Støtte Figur S2C). Dette bånd er referert til som ISCU protein og dens molekylvekt er forenlig med resultatene fra Tong et. al. [23].
Under hypoksi, MCF7 og HCT116 cellene viste en reduksjon i ISCU protein, og dette ble replikert med mimikk-210 i normoxia (figur 1D og Støtte figur S2D). Videre anti-210 delvis reversert hypoksisk undertrykkelse av ISCU protein (figur 1D og Støtte figur S2D). Hypoksi sterkt undertrykt en luciferase reporter inneholder 3’UTR av ISCU som inkluderte den antatte MIR-210 målområde og dette undertrykkelse kan være delvis reddet av forbigående transfeksjon av anti-210 (Støtte figur S2E). I tillegg etterligne-210 i det vesentlige undertrykkes luciferase-aktivitet sammenlignet med kontrollen i normoksisk MCF7 celler (Hjelpemiddel Figur S2E). Til slutt, mens siRNA mot ISCU førte til en nedregulering av både endogene ISCU og en eksogen merket ISCU mangler 3’UTR, mimikk-210 mediert nedregulering ble bare observert på den endogene ISCU protein (Støtte figur S2F). Samlet utgjør disse observasjonene viser at MIR-210 nedregulerer ISCU mRNA og proteinnivåer ved å målrette sin 3’UTR.
Effekter av ISCU downregulation på Fe-S proteiner
En forventet effekt av nedregulering av ISCU ville være en reduksjon av Fe-S levering til målet proteiner. Derfor analyserte vi virkningen av ISCU undertrykkelse på to enzymer som krever Fe-S for deres aktiviteter, aconitasen og mitokondrie kompleks I. siRNA mot ISCU betydelig redusert aconitasen aktivitet i MCF7 og HCT116 cellene sammenlignet med kontrollceller i normoxia (figur 2A). En tilsvarende nedgang i aconitasen aktivitet var tydelig i begge cellelinjene ved transfeksjon av mimikken-210 (figur 2A). Men det var ingen endring i aconitasen protein nivåer som vurderes av Western blot (Støtte figur S3A). Aconitasen utarmet på Fe-S fungerer som den translatoriske regulator-IRP1, for å øke opptaket av jern. Vi fant etterligne-210 økt jernopptak i HCT116-celler (Støtte figur S3b). Det var også tydelig hemming av mitokondriell kompleks I-aktivitet indusert ved etterligne-210, i de to cellelinjer (figur 2B). I begge cellelinjene var der nedregulering av aktivitet ved hypoksi, til en tilsvarende grad til det som blir indusert ved å etterligne-210 eller ved ISCU uttømming. Videre transfeksjon av anti-210 i MCF7-celler var i stand til å øke aconitasen aktivitet betydelig i hypoksi (figur 2C).
Celler transfektert med siRNA mot ISCU eller med mimic-210 viser en signifikant reduksjon i aktiviteten av Fe-S protein aconitasen (
A
) og kompleks i (
B
) på 48 timer. Aktiviteten er uttrykt i forhold til SCR for siISCU3 eller å etterligne-ctrl for ligne-210. Gjennomsnitt ± standardavvik av tre uavhengige eksperimenter er vist (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).
C
, hypoksi avtar aconitasen og komplekse jeg aktivitet i MCF7 og HCT116. Aktiviteten er uttrykt i forhold til normoxia (N). Transfeksjon av MCF7 med anti-210 øker nivået av aconitasen aktivitet, sammenlignet med anti-ctrl. Gjennomsnitt ± standardavvik av tre uavhengige eksperimenter er vist (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).
D
, i normoxia, MCF7- transfektert med mimikk-210 har en økning i det utskilte laktatkonsentrasjonen og en reduksjon i den ekstracellulære pyruvat etter 48 timer. Laktat: Pyruvat forholdet viser en betydelig økning under de samme betingelser. Transfeksjon med anti-210 i hypoksi redusert laktatproduksjon sammenlignet med anti-ctrl transfekterte celler. Gjennomsnitt ± standardavvik av tre biologiske replikater vises (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).
Som nedgangen i aconitasen og komplekse jeg aktivitet reduserer Krebs syklus og mitokondrie funksjon vi undersøkt om det var et skifte til glykolyse og laktat produksjon. Våre resultater viste en meget signifikant reduksjon av pyruvat og øke i laktat i normoxia med den etterligne-210, med en økning i laktat pyruvat-forhold. Det var også en nedgang i laktat produksjon med anti-210 i hypoksi (figur 2D).
Effekter av ISCU downregulation på frie radikaler produksjon
Tapet av Fe-S fra komplekse jeg er sannsynligvis vil påvirke transporten av elektroner i elektrontransportkjeden og effekt på frie radikaler. Vi målte således produksjonen av superoksyd i MCF7 og HCT116-celler. I normoxia, begge cellelinjene viste en markant økning i frie radikaler ved transfeksjon av mimikken-210 i forhold til å etterligne-kontroll (figur 3A).
En
i normoxia, transfeksjon av mimikken -210 signifikant øker superoksydproduksjon i 48 timer, målt ved MitoSox farging. Representative bilder fra ligne-210 transfekterte celler er vist på toppen paneler og middelverdien ± standardavvik på ca 300 celler vises på bunnplatene (***, p 0,001).
B
, eksponering av celler til 0,1% oksygen i 48 timer forbedrer produksjonen av superoksid; Denne effekten er nesten fullstendig reversert ved transfeksjon av anti-210. Representative bilder fra MIR-210 transfektert vises til venstre paneler og middelverdien ± standardavvik på ca 300 celler er vist på høyre panel (***, p 0,001).
C
, ROS produksjon indusert av mimikk-210 er sperret i MCF7 celler ved cotrasfection med ISCU2 uttrykke plasmidet. Gjennomsnitt ± standardavvik på ca 300 celler er vist (*** p 0,001). Barer = 10 mikrometer.
I hypoksi vi noterte en meget betydelig økning i superoksid produksjon, som ble nesten fullstendig reversert av anti-210 (figur 3B). I tillegg transfeksjon av ISCU2 konstruere nesten helt snudd den frie radikaler indusert av MIR-210 (figur 3C). Dette viser en stor ny mekanisme for regulering av ROS i hypoksi, og at det ikke er en passiv effekt av redusert oksygen tilgjengelighet.
Effekter av MIR-210 på apoptose og overlevelse i normoxia og hypoksi
Tidligere studier i gjær har vist de dødelige konsekvensene av ISCU homologer sletting [23]. Denne oppfatningen førte oss til å undersøke effektene av MIR-210 på apoptose i normoxia og hypoksi. Det var en slående forskjell i effekten av mir-210 i disse motstridende forhold. I normoxia, mimikk-210 betydelig økt apoptose målt ved annexin V flekker, men i hypoksi, antagonisme av MIR-210 økt apoptose (figur 4A).
En
, apoptose (Annexin V + celler) ble målt i MCF7- (
venstre
) og HCT116 (
høyre
) celler behandlet med MIR-210-hemmer eller etterligne, etter 48 timers eksponering til 0,1% oksygen eller normoxia. Gjennomsnitt ± standardavvik er representativ for 3 uavhengige eksperimenter (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).
B
, etter å transfektere MCF7 celler med egge LNA eller mir-210 LNA og utsatt for 0.1% oksygen eller normoxia (48 timer) ble cellene på nytt platet (100 og 500 celler /brønn). Etter en 12-dagers inkubering ble koloniene fiksert, farget, og de gjenværende fraksjoner ble beregnet på grunnlag av pletteringseffektiviteten.
C
, overlevende fraksjonene ble beregnet som i (
B
) i HeLa-celler, som ble tilført med anti-ctrl eller anti-210 (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, USA) og eksponert for 0,01% oksygen eller normoxia. I alle koloni analyser, gjennomsnitt ± standardavvik representerer 2 uavhengige eksperimenter utført i triplikat ved anvendelse av 2 forskjellige pletteringstettheter. (** P 0,01, *** p 0,001).
D
, RT-PCR for ISCU og MIR-210 i U87-xenotransplantater behandlet med anti-angiogen terapi (bevacizumab). Relativ uttrykk for ISCU normalisert til p-aktin, MIR-210 normalisert til tre små nukleolære kontroller, RNU43, RNU44 og RNU48. Mean uttrykk ± standardavvik i 4 dyr /gruppe er vist (** p 0,01, *** p 0,001).
For å evaluere effekten av MIR-210 på celleproliferasjon henhold hypoksiske forhold, ble en klonogene test som benyttes med en låst nukleinsyre antagonist (LNA) MIR-210-molekylet (figur 4B). Selv om mesteparten av reduksjonen i clonogenicity i hypoksi er klart via andre mekanismer, effekten av anti-210 resulterte i redusert klonogene overlevelses i hypoksi, som vi også funnet i en mer hypoksi-resistent cellelinje HeLa-celler (Figur 4C).
in vivo undertrykkelse av ISCU ved hypoksi og kliniske betydningen av ISCU uttrykk
Vi har undersøkt hvorvidt uttrykk for ISCU genekspresjon ble regulert in vivo, ved å studere menneskelige tumorxenotransplantater. Xenografter av glioblastoma cellelinje U87 ble behandlet med VEGF-inhibitor Avastin (Avastin), eller med bærerkontroll. Immunhistokjemi av disse svulstene demonstrert Avastin-indusert nekrose, uttrykk for HIF1α og HIF målgener CA9 og VEGF (data ikke vist). Vi analyserte mRNA fra svulster og fant markert oppregulering av MIR-210 og gjensidig nedregulering av ISCU mRNA (Figur 4D).
De eneste data tilgjengelig for sammenligning av MIR-210 med ISCU RNA i humane tumorprøver er fra våre bryst og hode og nakke serien. Det var en svært signifikant invers sammenheng av MIR-210 til ISCU uttrykk i 216 pasienter med brystkreft (rho = -0,39, p 0,001) (figur 5A,
forlot
). Det var en meget signifikant invers korrelasjon av ISCU med mer aggressive høy klasse svulster (p = 0,008) og en dårlig tilbakefall overlevelse (figur 5A,
midt
). I en multivariat analyse, forble ISCU signifikant (p = 0,028), sammen med noder, klasse og alder (Støtte tabell S2). I to andre serier av brystkreft (Rotterdam [26], 286 tilfeller: Uppsala [27]; 235 tilfeller) lav ISCU var en dårlig prognostisk faktor i multivariat analyse (Pidestaller S3 og S4) (p = 0,038 og 0,015 henholdsvis). I Uppsala serien [27] vi kunne vurdere forløperen Mir-210 ved hjelp av Affymetrix sonder (Affymetrix U133b, 230710_at) og dette viste også en invers sammenheng av forløperen til ISCU og dårlig overlevelse (figur 5B). I vårt hode og nakke kreft serie [25], var det en invers sammenheng av disse variablene (figur 5C,
forlot
). I en serie med publisert oppfølging, Chung et al [28], var det en sterk sammenheng med undertrykt ISCU med dårlig resultat (figur 5C,
midt
). Analyse av uttrykk i normalt vev versus tumorvev i ni kreft datasett ved hjelp Oncomine viste i alle studier undertrykkelse i forhold til normalt vev (Støtte figur S4).
En
, MIR-210 qPCR uttrykk (DDCT) plottet som en funksjon av ISCU mRNA-ekspresjon (Illumina arrays) i Oxford brystkreft serie (
venstre
), og, tilbakefall overlevelse for prøver med høy og lav ISCU ISCU splittet ved median i Oxford brystkreft serie (
midt
).
B
, mRNA uttrykk for transkripsjon hosting Mir-210 forløper plottet som en funksjon av ISCU mRNA uttrykk mål av Affymetrix U133b og U133a henholdsvis i Uppsala brystkreft serie (
venstre
), og tilbakefall overlevelse for prøver med høy ISCU og lav ISCU delt av medianen i Uppsala brystkreft serie (
midt
).
C
, MIR-210 qPCR uttrykk (DDCT) plottet som en funksjon av ISCU mRNA uttrykk (Affymetrix arrays) i Oxford-Manchester HNSCC kreft serie hvor ISCU ble opprinnelig funnet å være assosiert til hypoksi (
venstre
), og tilbakefall overlevelse for prøver med høy ISCU og lav ISCU delt av medianverdien i Chung et al. HNSCC serie (
høyre
).
Diskusjoner
Våre studier viser tydelig MIR-210 regulerer uttrykket av ISCU RNA og protein ved hjelp av mimikk i normoxia i kreft cellelinjer. ISCU mRNA og protein ble undertrykket etter hypoksi, og denne effekten ble reversert med en betydelig anti-210. Den ufullstendige reversering innebærer andre mekanismer er også involvert i ISCU downregulation og det er velkjent at RNA oversettelsen er redusert med hypoksi via utbrettet protein respons [29].
En reduksjon i ISCU ville svekke evnen til cellene til å generere Fe-S klynger og vil deretter innvirkning på aktiviteten til enzymer som krever disse co-faktor deler. Vi viste at aconitasen, en viktig enzym av intermediær metabolisme som krever Fe-S klynger, hadde redusert aktivitet etter ISCU reduksjon. Av spesiell relevans for kreft er den doble rollen aconitasen som IRP1 når den mangler sin Fe-S klynge. IRP1 regulerer stabilitet og translasjon av mRNA for transferrin og ferritin [24]. Virkningene av tap av aconitasen ville være å modifisere jern metabolisme og øke dens opptak, noe som er kritisk for tumorvekst. Faktisk, observerte vi en akkumulering av intracellulært jern ved transfeksjon av celler med mimic-210 eller siISCU.
Mutasjoner i ISCU forårsaker laktisk acidose hos personer etter moderat trening, som gir et sterkt bevis for betydningen av dette målet i å opprettholde effektiv Krebs syklus aktivitet [30], [31]. Et tilknyttet virkning fra redusert ISCU nivåer og påfølgende reduksjon i Krebs syklus aktivitet var en bryter for å glykolyse og økt laktat produksjon. Dette ble indusert i normoxia ved MIR-210, og således er lik den Warburg virkning. Dette kan være aktuelt i situasjoner der MIR-210 oppregulering skjer i normoxia. For eksempel har det blitt vist hos nyrecancercellelinjer med mutasjoner i von Hippel Lindau protein [14]. Omvendt, i hypoksi, anti-210 redusert laktatproduksjon, reversere Pasteur effekt (overgang til glykolyse i hypoksi).
jern-svovel klyngene er integral for effektiv aktivitet av det mitokondrielle elektrontransportkjeden. Vi har vist at komplekset I-aktiviteten er redusert i henhold til hypoksi og ved transfeksjon av mimic-210 i normoxia. I tillegg til Complex I, Komplekser II og III inneholder også Fe-S klynger og vi spekulerer i at virksomheten i alle tre komplekser kan bli redusert i en MIR-210 avhengig måte. Nedsatt elektrontransportkjeden ville føre til en økning i frie radikaler som følge av elektron lekkasje. Spesielt kompleks III er en vesentlig bidragsyter til ROS i hypoksi [32] og kompleks I og II bidra med omtrent 30% av ROS [33]. I normoksisk forhold, transfeksjon av mimikken-210 førte til økt radikaler gratis. Videre normoksiske ROS produksjon observert med mimikk-210 ble nesten helt forebygges med en MIR-210 motstandsdyktig ISCU konstruere. Omvendt, i hypoksi, observerte vi at induksjonen av MIR-210 var assosiert med en økning i ROS, og dette kan bli nesten fullstendig reversert ved hjelp av anti-210. Dette gir en vesentlig ny kobling for å forklare mekanismen for ROS induksjon i hypoksi, som har blitt rapportert av flere grupper [33], og kan stå for mesteparten av hypoksiske ROS induksjon. ROS utgitt i hypoksi har vist seg å fungere som O
2-sensorer, som virker som signaliserte midler som aktiverer HIF [32], medierer tumorvekst in vivo via en HIF avhengig mekanisme [5] og forlenge levetiden av celler [34] .
i motsetning til hypoksisk induksjon av ROS og lindring med anti-210 observert i vår studie, Chan et al. kunne ikke måle noen vesentlig endring i ROS produksjon etter eksponering for hypoksi, og viste en omvendt trend når MIR-210 ble hemmet [20]. Årsaken til dette avviket er uklart, men kan potensielt reflektere en underliggende forskjell i kreft sammenlignet med normale endotelceller.
Til slutt, vi analysert om det var noen tilknytning av ISCU downregulation i primære humane kreftformer med hypoksi og utfall, og funnet en aggressiv fenotype var forbundet med denne endringen i studier av over 1000 pasienter, og nedregulering i forhold til normalt vev i mange krefttyper.
i konklusjonen, vi har funnet en stor ny mekanisme for responsen av kreftceller til hypoksi, koordinert av MIR-210 undertrykkelse av ISCU og den påfølgende nedgangen i aktiviteten av jern-svovel klase proteiner (Støtte figur S5). I tillegg til aconitasen, mange metabolske enzymer krever Fe-S klynger for deres aktivitet som tyder på at nedregulering av ISCU ville ha vidtrekkende konsekvenser for celle metabolisme. Mutasjoner i mange av disse Fe-S klase enzymer inkludert succinatdehydrogenase subenheter SDHD, SDHB og SDHC [35] og fumarate hydratase [36] er innblandet i hyperproliferative lidelser og kreft, viser et viktig bindeledd mellom cellenes stoffskifte og påfølgende transformasjon og fremhever en rolle for HIF, via en MIR-210-ISCU aksen i disse prosessene. I tillegg til metabolske enzymer, flere DNA-reparasjonsenzymer [37] med Fe-S klynger er potensielt mål. Vi har tidligere vist MIR-210 kan bli detektert ved et forhøyet nivå i serum hos kreftpasienter [38], slik det vil være av interesse hvis de gjenspeiler den metabolske tilstand av deres primære kreft, og følgelig kunne anvendes i fremtidige behandlingsvalg. Reguleringen av forskjellige biologiske mekanismer ved ISCU downregulation antyder en potensiell terapeutisk tilnærming av syntetisk dødelighet der narkotika som formidler DNA skader reparert av jern-svovel klynge inneholder heli Rad3 [39] eller Fanconi anemi [37] kan være bruk i synergi med PARP-inhibitorer eller hemmere av glykolyse [36] og glutaminolysis i undergruppen av pasienter med høyest MIR-210 nivåer.
Selv om dette arbeidet var i forberedelsene, ble tre nye Mir-210 mål validert, dvs. HOXA1, HOXA9 og FGFRL1 og analyse av tumorxenotransplantater avledet fra kreftcellelinjer overekspresjon MIR-210 foreslo en potensiell involvering av MIR-210 i tumorvekst initiering [40].
Materialer og metoder
Cell kultur
Cell eksponering overfor hypoksi (1%, eller 0,1%, eller 0,01% oksygen) ble foretatt i en hypoksi-inkubator (MiniGalaxy A, RS Biotech, Scotland, UK) ved anvendelse av en kontinuerlig strøm av en fuktet blanding av 95% N
2 og 5% CO
2.
miRNA etterligne eller hemmer transfeksjon
transfeksjon ble utført med Dharmacon anti-210, Mir-210 etterligne, eller styre oligos (Thermo Scientific, CO, USA), til en endelig konsentrasjon på 20 nM, ved hjelp OptiMem serumfritt medium og Oligofectamine reagens (begge fra Invitrogen, Paisley, UK) i henhold til produsentens protokoll.
Transfeksjon og luciferase analyser
luciferaserapportørplasmid plasmider som inneholder 3 «utranslaterte regioner (UTR) av ISCU eller tilfeldig genomisk sekvens (kontroll) ble hentet fra koblingsanlegg Genomics (Menlo Park, CA. En Renilla luciferase ekspresjonsplasmid (PRL-TK vektor, Promega, Southampton, UK) ble anvendt som kontroll transfeksjon.
enzymaktivitetsanalyser
aconitasen aktivitet ble ved hjelp av Bioxytech aconitasen-340-analysen (Oxis International Inc, Beverly Hills, California). Data er presentert som% av aktivitet sammenlignet med kontroll.
Celler ble analysert for Complex Jeg aktivitet bruker Mitoprofile Complex jeg Rapid Elisa Kit (MitoSciences, Eugene, OR, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Data er presentert som% av aktivitet sammenlignet med kontroll.
laktat og pyruvat målinger
Laktat og pyruvat ble analysert ved bruk av kits fra Instruchemie (Delfzijl, Nederland).
MitoSOX farging
Mitokondrie superoksid ble analysert ved hjelp MitoSOX Red (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Bilder ble kjøpt med en konfokal mikroskop (Radiance 2000, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, UK), og analysert som tidligere beskrevet [41].
Gene uttrykk data-mining
Vi har tidligere utledet en hypoksi metagene i grunnskolen hode- og halskreft plateepitelkarsinom [HNSCC] [25]. Klynger av gener anti-korrelert til MIR-210 ekspresjon ble dannet som tidligere beskrevet [25]; Spearman korrelasjon ble brukt til å identifisere gener betydelig anti-korrelerte MIR-210 og falske funnrate (FDR) ble estimert ved hjelp av en permutasjon basert metode [42]. Gener med FDR 0,05 ble valgt. Vi har også brukt 5 mål prediksjon algoritmer: – TargetScanHuman (https://www.targetscan.org/); Pictar [43]; Miranda (https://microrna.sanger.ac.uk/); DianaLab (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), miRDB (https://mirdb.org/miRDB/).
Survival analyser og andre statistiske analyser
Spearman korrelasjon ble brukt for kontinuerlige variabler og Wilcox test for kategoriske variabler.
